一种核酸样本采样、保存、快速提取一体化装置的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于核酸样本采样、保存、快速提取一体化装置。

背景技术：

利用pcr技术直接检测病原体核酸，在感染性疾病的诊断、无症状感染者的筛查中，具有灵敏度高、特异性强的优势，不仅提高了精准诊断水平，还有利于隐性感染者的早期发现。在新型冠状病毒疫情席卷全球的时候，我国就是通过人群pcr核酸检测，筛查、发现早期症状不典型及无症状感染者，有效隔离患者及密切接触者，迅速控制了疫情的发展。然而，pcr核酸检测需要经过采样、核酸提取、核酸扩增等多个操作步骤，其中，核酸样本的采集、保存及提取是决定检测效率的关键环节，需要专业人员、特定设备、特殊环境、检测周期长，并且存在交叉污染及环境污染的风险，导致核酸检测技术门槛高、费用高，严重制约了核酸检测技术的全面推广。

针对上述技术问题，减少核酸样品采集、提取中样品开盖次数及操作环节，可极大减少气溶胶形成及播散，降低人员感染及环境污染风险，缩短检测时间。因此，开发功能集成的核酸采样、保存及快速提取装置，不仅能提高核酸检测的安全性、时效性，还可以减少专业人员和检测设备的投入，降低检测成本。

技术实现要素：

本发明的目的是要提供一种核酸样本采样、保存、快速提取一体化装置，简化核酸检测的操作环节，缩短检测周期，最大程度去除样品中杂质，提高了核酸检测效率，同时减少专业人员及设备投入，降低交叉污染和环境污染的风险。

一种核酸样本采样、保存、快速提取装置，其特征在于，包括采样单元和核酸提取单元；所述采样单元包括采样管、采样棒、竖直隔离板、采样管帽、卡槽、卡扣、位于采样管帽上的取样口和取样口盖子；

所述核酸提取单元包括核酸提取管、水平隔离板、暂存小室及位于竖直隔离板上的隔离薄膜和吸附滤膜；

竖直隔离板将采样单元与核酸提取单元完全隔离开，竖直隔离板下1/2镶嵌吸附滤膜，吸附滤膜的核酸提取单元侧有隔离薄膜密闭覆盖，在样品中核酸完全释放前避免与裂解液接触；

采样棒通过卡槽与采样管帽连接，作为一个整体便于采样时抓握，用于鼻、咽、口腔拭子，各种分泌物、排泄物及物体表面擦拭；样品采集后将采样管帽旋转180度，可将采样棒穿过核酸提取单元内的暂存小室，插入裂解液内，同时取样口和取样口盖子则被旋转到采样管上方；

核酸提取单元中的水平隔离板将核酸提取单元分割为上下两个部分，在水平隔离板上设置有贯穿水平隔离板全层的暂存小室，暂存小室内密封有试剂干粉，水平隔离板下方的核酸提取管内装有裂解液；

所述暂存小室的材料为锡箔、铝箔及其他对酸碱稳定、脆性大的膜材料，其中优选锡箔；

所述试剂干粉，包括蛋白酶k、链酶蛋白酶等蛋白质消化酶类，消化样品中蛋白质、抑制dna酶和rna酶，以及还原试剂如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(dtt)和苯甲基磺酰氟(pmsf)等，抑制rna酶活性；干粉试剂可以是一种或两种以上试剂的组合物，常规方法制备成干粉剂型，密封于暂存小室内；其中，优选蛋白酶k和dtt；

这些试剂暴露于空气中和溶液状态都易于发生变性或氧化，失去活性，在干粉状态非常稳定，一般采取现配现用；采样后，采样棒穿过暂存小室，试剂干粉释放，进入裂解液内，加速样本中核酸释放，并且保护核酸不被降解；

所述裂解液不含苯酚、不沉淀dna和rna、沉淀或不沉淀蛋白质、ph维持在8.0-12.0范围内，裂解液能够迅速、完全地裂解细胞、细菌、病毒释放核酸，并且不影响从暂存小室释放的蛋白酶的活性；

所述裂解液包括盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素、naoh、十二烷基磺酸钠(sds)、十六烷基三甲基溴乙胺(ctab)、tris-hcl缓冲液的组合物；裂解液可以是一种或两种以上试剂的组合物，其中，优选sds和tris-hcl缓冲液；

样品进入裂解液后，其中的细胞、病毒、细菌等被迅速裂解，与核酸结合的蛋白质被蛋白酶消化，释放出游离核酸，并且核酸保持溶解状态，核酸酶被抑制而不被降解；

所述隔离薄膜为对酸碱稳定、脆性大的膜材料，其中优选锡箔；隔离薄膜覆盖在吸附滤膜核酸提取单元一侧，阻止吸附滤膜在样品进入前与裂解液接触，保持吸附滤膜的活性；

所述吸附滤膜为经表面改性、通过共价键连接螯合剂的纤维素膜或羟基磷灰石填料，螯合剂优选亚氨基二乙酸(ida)，滤膜优选纤维素膜；

吸附滤膜可吸附裂解液中未被消化的残余蛋白质、螯合ca2+/mg2+等二价金属离子、阻挡细胞碎片和粘液等，并且在ph8.0-12.0范围内不吸附核酸分子；

纯化的核酸溶液滤过到采样管中，从取样口吸取核酸样品用于后续的核酸检测。

附图说明

图1一种核酸样本采样、保存、快速提取一体化装置结构示意图

图2一种核酸样本采样、保存、快速提取一体化装置工作状态示意图

图3本发明实施例一6个样本提取的核酸pcr产物电泳结果图

图4本发明实施例二核酸样本室温放置不同时间后pcr产物电泳结果图

图5本发明实施例三核酸样本不同温度条件下放置一周后pcr产物电泳结果图

具体实施例

本实施例中，裂解液的配方组分为：tris-hcl、sds和nacl，tris-hcl的浓度为2.5mm，ph9.0，sds的浓度为1％(m/v)，nacl的浓度为1m；干粉试剂包括蛋白酶k和dtt，蛋白酶k在裂解液中溶解和浓度为1mg/ml，dtt的浓度为1m；将亚氨基二乙酸(ida)通过共价键连接到纤维素膜上。

采用takara公司pcr检测试剂(premixtaq，rr901)对提取的核酸样本进行pcr检测，反应体系为50微升，其中扩增试剂25微升、上下游引物各1微升、灭菌水13微升、样本模板10微升，在bio-radptc-200pcr仪上进行扩增反应，pcr的反应条件为：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，一共34个循环，扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，观察目的条带。

实施例一：从6个健康自愿者采集鼻拭子后，将采样棒穿过暂存小室，插入裂解液内，暂存小室内的干粉试剂同时释放到裂解液内，用采样棒搅动混匀裂解液，然后将采样棒紧贴隔离薄膜，从上往下刺破隔离薄膜，盖紧采样管帽。打开取样口盖子，从采样管内吸取10微升滤过的核酸样本，加到配制好的pcr反应体系中，pcr扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示6份核酸提取样本均扩增出目的基因片段，表明本实施例中核酸提取成功。

实施例二：实施例一中的核酸样本经pcr证实核酸提取成功后，选取其中一份样本，在室温下放置1周、2周、3周后，从采样管内吸取10微升滤过的核酸样本，加到配制好的pcr反应体系中，pcr扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示核酸提取样本在室温放置1周后，扩增出目的基因条带与新鲜样本无明显差异，样本放置2周和3周后扩增出目的基因条带稍有减弱，表明本实施例中提取后核酸样本在室温至少可以稳定放置3周。

实施例三：实施例一中的核酸样本经pcr证实核酸提取成功后，选取其中一份样本，分别在-80℃、4℃、室温、60℃放置一周后，从采样管内吸取10微升滤过的核酸样本，加到配制好的pcr反应体系中，pcr扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示核酸提取样本在-80℃、4℃、室温、60℃均能保持稳定至少1周。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的等同变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。