一株球孢白僵菌B2660及其在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一株球孢白僵菌b2660及其在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用。

背景技术：

对羟基苯甲酸(4-hydroxybenzoate,4-hba)是一种用途广泛的有机合成原料，其酯类衍生物，如甲酯(尼泊金甲)、乙酯(尼泊金乙)、丙酯、丁酯、异丙酯、异丁酯，可做食品添加剂，添加在酱油、醋、清凉饮料(汽水除外)、果品调味剂、水果及蔬菜、腌制品等中。此外，4-hba酯类衍生物还主要用于液晶聚合物和新型耐高温聚合物用于材料领域。同时，4-hba也用作染料、农药的中间体和尼龙的增塑剂。现行的4-hba化学生产是从石油成分合成而得，整个合成工艺必须在高温高压下进行，消耗大量的能源，而且生产过程中有环境污染物苯酚的生成。同时较难进行高纯度的产物的分离纯化工作，或其分离纯化的成本较高。利用可再生资源生物合成4-hba及其衍生物将是解决环境污染和资源枯竭的重要途径之一。

采用生物法合成4-hba，对生产的设备以及成本都大大降低，还有反应条件更加温和、对环境更加友好、更加符合绿色工业的要求等优点。目前生物法合成4-hba主要有如下几种方式：(1)改造植物的莽草酸途径，分别从分支酸、苯丙素和苯丙氨酸出发合成4-hba。但在植物中的4-hba通常被糖基化或者酯化，分离纯化困难。(2)改造酵母的莽草酸途径，如耿娜在酿酒酵母中引入大肠杆菌的ubic基因，以分支酸为底物合成4-hba，4-hba产量达到11.34mg/l；进一步过表达aro4基因，4-hba使其产量达到35.02mg/l(生物合成对羟基苯甲酸的酿酒酵母基因工程菌的构建[d].北京化工大学2019)。(3)构建大肠杆菌或恶臭假单胞菌工程菌，发酵产生4-hba。如frost课题组构建了一株重组大肠杆菌工程菌，能利用葡萄糖发酵4-hba，发酵产量达到了12.0g/l(biotechnologybioeng,2001,76(4):376-390.)。verhoef等构建恶臭假单胞菌工程菌株，将4-hba羟化酶基因poba敲除后，避免了4-hba合成后进一步降解，同时构建一个载有苯丙氨酸解氨酶基因的质粒，最终该菌株能将酪氨酸通过苯丙氨酸解氨酶转化为对羟基肉桂酸，然后利用对羟基肉桂酸降解途径合成4-hba(appliedmicrobiology&biotechnology,2010,87(2):679-690.biotechnology,2007,132(1):49-56.)。

除了如上通过工程菌构建的方法外，直接筛选相关菌株进行4-hba的生物合成，方法更为简单。如朱莉等利用微泡菌具有4-hba合成能力，产量可达19μmol/l(微泡菌生物合成对羟基苯甲酸及其酯类物质的研究[d].江苏师范大学,2016)。可以看出，目前生物法合成4-hba，主要依赖发酵的方法，从葡萄糖出发对莽草酸途径及相关途径进行改造最终合成4-hba，途径改造时涉及酶和相关基因较多，且4-hba产量往往不高。

综上可知，上述这些现有的方法，步骤较繁琐，4-hba产量较低；因此，如何开发一种新的菌种应用于生物转化，成为亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明目的是提供一株球孢白僵菌b2660及其在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用，筛选出的球孢白僵菌b2660能将苯甲酸直接转化为对羟基苯甲酸，通过一步生物转化就合成了4-hba，可避免复杂的化学合成过程，为生物法合成对羟基苯甲酸提供了一条新的途径。

在本发明的第一方面，提供了一株球孢白僵菌b2660，所述球孢白僵菌b2660的保藏编号为：cctccno：m2021337。

在本发明的第二方面，提供了一种球孢白僵菌b2660发酵菌剂，所述球孢白僵菌b2660发酵菌剂包括：

将所述的球孢白僵菌b2660进行发酵获得的湿菌体；

或将所述湿菌体经喷雾干燥获得的干粉菌剂。

进一步地，所述湿菌体的制备方法为：

将种子斜面培养基保存的球孢白僵菌b2660接种至液体培养基中第一摇床培养，获得种子液；

将所述种子液接种至液体培养基中第二摇床培养，获得培养液；

将所述培养液进行第一离心获得离心沉淀物，后用生理盐水洗涤再重悬和第二离心，获得湿菌体。

进一步地，所述种子斜面培养基的配方为：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，溶剂为自来水，自然ph，121℃灭菌20min；所述液体培养基的配方为：葡萄糖40g/l，酵母粉10g/l，七水硫酸镁2g/l，二水氯化钙1g/l，磷酸氢二钾1.8g/l，磷酸二氢钾0.75g/l，溶剂为自来水，自然ph，121℃灭菌20min。

进一步地，所述第一摇床培养和第二摇床培养的条件均包括：摇床转速为100～300rpm，培养温度为25～30℃，培养时间为24～96h。

进一步地，所述接种中，按体积比为1～5％的接种量接种。

进一步地，所述第一离心和第二离心的条件均包括：转速为5000～10000rpm，时间为5～15min。

在本发明的第三方面，提供了所述的球孢白僵菌b2660或者所述的球孢白僵菌b2660发酵菌剂在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用。

进一步地，所述应用包括：

采用所述的球孢白僵菌b2660发酵菌剂为催化剂，以苯甲酸为底物，采用浓度为0.5mol/l的naoh调节ph值，使ph为7。在温度为25～35℃，摇床转速为100～300rpm的条件下进行生物转化反应，获得含对羟基苯甲酸的转化液。

进一步地，所述苯甲酸的终浓度为10～100g/l，所述的球孢白僵菌b2660发酵菌剂为所述的球孢白僵菌b2660进行发酵获得的湿菌体时，所述湿菌体的加入量为5～40g/l。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的一株球孢白僵菌b2660及其在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用，筛选出的球孢白僵菌b2660能将苯甲酸直接转化为对羟基苯甲酸，通过一步生物转化就合成了4-hba，且4-hba产量高，在催化24h时球孢白僵菌b2660可将10g/l苯甲酸催化合成8.75g/l的对羟基苯甲酸，转化率达87.5％；同时可避免复杂的化学合成过程，为生物法合成对羟基苯甲酸提供了一条新的途径。

本发明的球孢白僵菌b2660的保藏日期为2021年4月6日，保藏编号为cctccno：m2021337。其分类命名为球孢白僵菌b2660(beauveriabassianab2660)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为球孢白僵菌(beauveriabassiana)b2660在pda培养基上的菌落形态；图1a为菌落正面；图1b为菌落背面；

图2为球孢白僵菌(beauveriabassiana)b2660使用its测序引物pcr扩增结果；

图3为全细胞催化合成产物的lc-ms联用质谱图；

图4为苯甲酸钠和对羟基苯甲酸的hplc色谱图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

本申请发明人从采集于湖北省农业科院水稻实验田中的土壤中经过筛选到一株微生物，发现该菌株具有利用全细胞催化将苯甲酸转化合成为对羟基苯甲酸的能力，该细菌经菌落形态、生化及its测序分析，该菌株与球孢白僵菌属(beauveriabassiana)多个的菌株同源性均在96％以上，结合生理生化特性，初步确定该菌株属球孢白僵菌属(beauveriabassiana)，并命名为球孢白僵菌b2660(beauveriabassianab2660)。

本发明的球孢白僵菌b2660能将苯甲酸直接转化为对羟基苯甲酸，通过一步生物转化就合成了4-hba，且4-hba产量高，在催化24h时球孢白僵菌b2660可将10g/l苯甲酸催化合成8.75g/l的对羟基苯甲酸，转化率达87.5％；同时可避免复杂的化学合成过程，为生物法合成对羟基苯甲酸提供了一条新的途径。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一株球孢白僵菌b2660及其在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用进行详细说明。

实施例1菌株b2660的定向富集分离与鉴定

1、菌株b2660的筛选、定向富集分离

从湖北省农科院水稻实验田中收集土壤样品，采用稀释涂布法分离菌株：称取2g土壤样品置于18ml的无菌水中搅拌2min制成土壤悬浮液，稀释10倍后涂布于pda培养基上，25℃恒温培养。将分离得到的菌株采用分生孢子单菌落分离获得纯培养菌株，以pda斜面培养基4℃保存备用。

2、菌株b2660的鉴定

(1)菌株b2660的菌体及菌落形态特征

将-80℃冰箱中甘油保藏的菌株b2660菌液在冰上解冻，用接种环取一环菌液在pda琼脂平板上进行划线，将培养皿倒置于恒温培养箱中30℃培养24h左右，观察菌落形态。取pda琼脂平板上长出的单菌落，进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌落形态如图1所示。

(2)遗传学特征

取该球孢白僵菌b2660，于lb液体培养基中扩大培养，取新鲜菌液用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组。将提取得到的基因组，用its测序引物进行pcr扩增，pcr体系为：2×taqpluspcrmastermix25μl、ddh2o19μl、通用引物27f2μl、通用引物1492r2μl、模板dna2μl。取pcr扩增得到的产物10μl，于1.5％的琼脂糖凝胶中电泳检测，确认有清晰明亮的条带后将剩余的pcr产物送测序公司测序，测序结果如seqidno：1所述。

将测序结果与blast搜索程序从数据库(ncbi)中基因序列进行比对分析，并结合生理生化特性，确定菌株b2660为球孢白僵菌属，并命名为球孢白僵菌b2660(beauveriabassianab2660)，于2021年4月06日于中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为cctccno：m2021337。

实施例2球孢白僵菌b2660发酵菌剂的制备

1、球孢白僵菌b2660种子培养液的制备：

种子斜面培养基的配方为：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，溶剂为自来水，自然ph，121℃灭菌20min；所述液体培养基的配方为：葡萄糖40g/l，酵母粉10g/l，七水硫酸镁2g/l，二水氯化钙1g/l，磷酸氢二钾1.8g/l，磷酸二氢钾0.75g/l，溶剂为自来水，自然ph，121℃灭菌20min。

将采用所述种子斜面培养基进行斜面保存的球孢白僵菌b2660接种至种子摇瓶中，28℃下摇床转速为100～300rpm，培养24h,种子摇瓶培养基成分为：葡萄糖40g/l，酵母粉10g/l，七水硫酸镁2g/l，二水氯化钙1g/l，磷酸氢二钾1.8g/l，磷酸二氢钾0.75g/l，溶剂为自来水,自然ph，121℃灭菌20min。

2、发酵摇瓶培养：将种子液以体积浓度1～5％的接种量接种至装有400ml发酵培养基的三角瓶(1000ml)中进行发酵培养。培养温度为28℃，摇床转速为100～300rpm，培养时间24～96h。发酵培养基组成是(g/l)：葡萄糖40g/l，酵母粉10g/l，七水硫酸镁2g/l，二水氯化钙1g/l，磷酸氢二钾1.8g/l，磷酸二氢钾0.75g/l，溶剂为自来水,自然ph，121℃灭菌20min。

3、菌体的收集：摇瓶发酵得到的菌液在5000～10000rpm的离心机里离心5～15min，收集菌体，使用生理盐水洗涤2～4次后，获得湿菌体。为了方便保存可以将所述湿菌体经喷雾干燥获得干粉菌剂。

实施例3采用全细胞催化法催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸

1、采用实施例2的方法将斜面保存的球孢白僵菌b2660接种至种子摇瓶中，培养24h后，按2％的接种量接种至不含苯甲酸的发酵摇瓶中，在发酵温度为28℃，摇床转速为220rpm条件下进行发酵，将发酵得到的菌液在8000rpm的离心机里离心10min，收集湿菌体。

2、在所述湿菌体中加入10g/l的苯甲酸，采用浓度为0.5mol/l的naoh调节ph值，使ph为7。在恒温摇床中以28℃的温度，200rpm的转速条件下进行全细胞催化24h。

3、采用lc-ms和hplc法对其定性和定量分析。根据gc-ms图(附图3)和hplc图(附图4)检测结果可知，全细胞催化产物为对羟基苯甲酸，在催化24h时球孢白僵菌(beauveriabassiana)b2660可将10g/l苯甲酸催化合成8.75g/l的对羟基苯甲酸，转化率达87.5％。

实施例4采用全细胞催化法催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸

1、采用实施例2的方法将斜面保存的球孢白僵菌b2660接种至种子摇瓶中，培养24h后，按5％的接种量接种至不含苯甲酸钠的发酵摇瓶中，在发酵温度为32℃，摇床转速为150rpm条件下进行发酵，将发酵得到的菌体在6000rpm的离心机里离心12min，收集菌体，使用生理盐水洗涤2次后重悬菌液，重悬后获得湿菌体30g/l。

2、在所述湿菌体中加入60g/l的苯甲酸，采用浓度为0.5mol/l的naoh调节ph值，使ph为7。在恒温摇床中以30℃的温度，300rpm的转速条件下进行全细胞催化36h；

3、采用lc-ms和hplc法对其定性和定量分析。根据gc-ms图(附图3)和hplc图(附图4)分析结果可知，全细胞催化产物为对羟基苯甲酸，在催化36h时球孢白僵菌(beauveriabassiana)b2660可将60g/l苯甲酸催化合成48.15g/l的对羟基苯甲酸，转化率达80.25％。

实施例5采用全细胞催化法催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸

1、采用实施例2的方法将斜面保存的球孢白僵菌b2660接种至种子摇瓶中，培养24h后，按3％的接种量接种至不含苯甲酸的发酵摇瓶中，在发酵温度为28℃，摇床转速为120rpm条件下进行发酵，将发酵得到的菌体在10000rpm的离心机里离心5min，收集菌体，使用生理盐水洗涤4次后重悬菌液，重悬后获得湿菌体40g/l。

2、在所述湿菌体中加入90g/l的苯甲酸，在恒温摇床中以28℃的温度，250rpm的转速条件下进行全细胞催化48h；

3、采用lc-ms和hplc法对其定性和定量分析。根据gc-ms图(附图3)和hplc图(附图4)分析结果可知，全细胞催化产物为对羟基苯甲酸，在催化48h时球孢白僵菌(beauveriabassiana)b2660可将90g/l苯甲酸催化合成57.53g/l的对羟基苯甲酸，转化率为63.9％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

综上可知，本发明提供的一株球孢白僵菌b2660可以同时将苯甲酸转化为对羟基苯甲酸，可避免复杂的化学合成过程，为生物法合成对羟基苯甲酸提供了一条新的途径。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>武汉大学

<120>一株球孢白僵菌b2660及其在全细胞生物催化苯甲酸合成对羟基苯甲酸中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>537

<212>dna

<213>球孢白僵菌(beauveriabassiana)

<400>1

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