透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物、制备方法及应用

本发明属于医学生物材料领域，尤其是透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物、制备方法及应用。

背景技术：

皮肤可以有效的保护人体的组织器官免受外界机械性和化学性刺激以及防止病毒、细菌等微生物的入侵。然而在日常生活中，皮肤极易因为烫伤，烧伤及其它机械性伤害等因素而发生缺损。皮肤缺损后，局部组织通过再生，修复，重建等过程进行修补。此外，皮肤表面存在着人体常驻菌群，皮肤缺损后，在初期若得不到正确诊断和治疗，极易引起感染，造成严重后果，甚至危及生命。因此，急需要研制出一种能够保护伤口，具有抗菌能力，促进伤口愈合的敷料。

现有的医用敷料如纱布，脱脂棉等虽然因为制作简单，价格便宜被广泛使用，但是也有着明显的缺点，传统的医用敷料不具备抗菌能力，容易导致伤口感染，而将抗菌药物使用于伤口，再用敷料覆盖，操作复杂，费时费力。此外，传统的医用敷料不能保持伤口湿润，止血能力差，对伤口愈合没有明显的促进效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有医用敷料无抗菌性及对伤口愈合没有明显促进的缺点，提供透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物、制备方法及应用。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物，为由透明质酸和ε-聚赖氨酸盐酸盐通过静电作用而形成的聚离子复合物。

进一步的，透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物内部呈三维网状孔隙结构。

进一步的，透明质酸和ε-聚赖氨酸盐酸的摩尔比为1：(3～8)。

进一步的，所述透明质酸的分子量为50000。

进一步的，所述ε-聚赖氨酸盐酸盐的分子量为3800～4200。

一种透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物的制备方法：

1)将透明质酸溶于去离子水中，得到透明质酸水溶液；

将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶于去离子水中，得到ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液；

2)将透明质酸水溶液与ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液混合均匀，得到混合溶液；

将混合溶液充分振荡，在室温下静置0.5～1h，得到透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物。

进一步的，在步骤1)中，以质量百分比计，透明质酸水溶液中透明质酸的浓度为4％；

ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液中ε-聚赖氨酸盐酸盐的浓度为4％～8％。

进一步的，步骤2)中透明质酸水溶液与ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液的体积比为10：3。

进一步的，所述透明质酸的分子量为50000；

所述ε-聚赖氨酸盐酸盐的分子量为3800～4200。

本发明的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物的应用，作为敷料用于促进皮肤伤口愈合。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物，具有良好的力学性能，粘附能力强，能够有效阻止敷料从伤口脱落；有良好的自愈能力，敷料在外力引起断裂后可以短时间内自愈；有良好的抗菌能力，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有良好的抑制作用；细胞相容性好，静电复合避免了交联剂的使用。

本发明的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物的制备方法，采用了物理共混法，利用带负电荷的透明质酸和带正电荷的ε-聚赖氨酸盐酸盐通过静电作用形成聚离子复合物，操作简单，原料来源广泛，反应条件温和，避免了交联剂的使用或其他溶剂的引入所引起的细胞毒性等问题。

本发明的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物作为敷料用于促进皮肤伤口愈合，可以根据不同的伤口需要制备任意形状的敷料，促进伤口愈合。

附图说明

图1为实施例3的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物形态图；

图2为实施例1-实施例3的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物的sem图，其中，图2(a)、2(b)、2(c)为实施例1不同放大倍数的sem图，图2(d)、2(e)、2(f)为实施例2不同放大倍数的sem图，图2(g)、2(h)、2(i)为实施例3不同放大倍数的sem图；

图3为实施例3的粘附性测试图，其中，图3(a)为透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物在猪皮表面粘附图，图3(b)、图3(c)为透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物在猪皮间粘附图；

图4为实施例3自愈性能测试图，其中，图4(a)为自愈性能宏观评估图，图4(b)为自愈性能流变测试图；

图5为实施例1-实施例3的金黄色葡萄球菌体外抗菌实验，其中，图5(a)为对照组金黄色葡萄球菌体外抗菌实验结果图，图5(b)、图5(c)、图5(d)为实施例1-实施例3的金黄色葡萄球菌体外抗菌实验结果图；

图6为实施例1-实施例3的大肠杆菌体外抗菌实验，其中，图5(a)为对照组大肠杆菌体外抗菌实验结果图，图5(b)、图5(c)、图5(d)为实施例1-实施例3的大肠杆菌体外抗菌实验结果图；

图7为实施例3的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物的伤口愈合图片，其中，图7(a)、图7(b)、图7(c)、图7(d)为空白组0天、5天、10天、15天时的伤口愈合图，图7(e)、图7(f)、图7(g)、图7(h)为对照组0天、5天、10天、15天时的伤口愈合图，图7(i)、图7(j)、图7(k)、图7(l)为实验组0天、5天、10天、15天时的伤口愈合图；

图8为皮肤伤口组织病理切片he染色图，其中，图8(a)、图8(b)图8(c)为空白组5天、10天、15天时的he染色图，图8(d)、图8(e)、图8(f)为对照组5天、10天、15天时的he染色图,图8(g)、图8(h)、图8(i)为实验组5天、10天、15天时的he染色图；

图9为皮肤伤口组织病理切片masson染色图，其中，图9(a)、图9(b)图9(c)为空白组5天、10天、15天时的masson染色图，图9(d)、图9(e)、图9(f)为对照组5天、10天、15天时的masson染色图,图9(g)、图9(h)、图9(i)为实验组5天、10天、15天时的masson染色图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

透明质酸是一种酸性粘多糖，广泛的分布于各个人体组织，在体内具有重要的生理功能。同时，透明质酸是细胞外基质的主要成分，在皮肤的修复过程中(如组织再生，炎症和血管生成)中起着重要作用。不同类型的透明质酸已经广泛用于医学的各个分支，如高分子量的透明质酸钠溶液可作为手术中的保护材料，交联型透明质酸治疗面部凹陷性瘢痕等。

聚赖氨酸盐酸盐具有广谱的抑菌性。研究表明聚赖氨酸盐酸盐可以和微生物的细胞壁通过静电作用紧密结合，影响微生物的正常生理活动，从而使微生物死亡，聚赖氨酸盐酸盐对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)均有较强的抑制效果。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

实施例1

将透明质酸溶解于去离子水中配制成浓度为4％的透明质酸水溶液，将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶解于去离子水中配制成浓度为4％的ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液，将体积比为10:3的透明质酸水溶液和ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液混合均匀，充分振荡，将混合溶液静置0.5h，即得透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物。

实施例2

将透明质酸溶解于去离子水中配制成浓度为4％的透明质酸水溶液，将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶解于去离子水中配制成浓度为6％的ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液，将体积比为10:3的透明质酸水溶液和ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液混合均匀，充分振荡，将混合溶液静置40min，即得透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物。

实施例3

将透明质酸溶解于去离子水中配制成浓度为4％的透明质酸水溶液，将ε-聚赖氨酸盐酸盐溶解于去离子水中配制成浓度为8％的ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液，将体积比为10:3的透明质酸水溶液和ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液混合均匀，充分振荡，将混合溶液静置1h，即得透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物。

实施例1-实施例3所用的透明质酸购于上海源叶生物科技有限公司，分子量为50000，ε-聚赖氨酸盐酸盐购于郑州拜纳佛生物工程股份有限公司，分子量为3800～4200。

将实施例3的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物置于西林瓶中，如图1所示，可以观察到，在瓶底形成了胶状物质，说明透明质酸和ε-聚赖氨酸盐酸盐通过静电作用形成透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物。

将实施例1-实施例3制备的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物样品放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，取出干燥后的样品，在液氮中切开样品。且将聚离子复合物断面用导电胶固定，喷金，然后用扫描电子显微镜观察截面的微观形貌。参见图2，图2(a)、2(b)、2(c)为实施例1不同放大倍数的sem图，图2(d)、2(e)、2(f)为实施例2不同放大倍数的sem图，图2(g)、2(h)、2(i)为实施例3不同放大倍数的sem图，可以看到透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物呈现三维网状孔隙结构，这种结构有助于氧气分子，水分子，营养物质和代谢物的传递，因此透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物具有良好的通透性能够作为促进伤口恢复的敷料。三维网状孔隙结构的形成机制为透明质酸的结构中有大量羧基，带负电荷，而ε-聚赖氨酸盐酸盐的结构中有大量的氨基，带正电荷，羧基的负电荷与氨基的正电荷发生静电作用，使得透明质酸与ε-聚赖氨酸盐酸盐相互紧密缠绕形成三维网状孔隙结构。

利用猪皮对实施例3的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物的粘附性能进行评价。将透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物制备成圆形，取2×2cm的新鲜猪皮，将聚离子复合物粘附在猪皮表面，参见图3(a)，可以观察到聚离子复合物能够稳定的粘附在猪皮表面，证明聚离子复合物可以很好的粘附在皮肤伤口处而不掉落。将猪皮切为两半，用聚离子复合物连接，参见图3(b)和图3(c)，可以观察到聚离子复合物可以使两块猪皮黏合，用镊子夹起悬空时可以承受自身的重力不会断裂。

自愈合实验

将实施例3的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物用模具成型后从中间切断，参见图4(a)，在室温下将两块切开的聚离子复合物的断面重新轻轻接触，在10s内即可愈合。采用流变学的方法对聚离子复合物的自愈性能进行测试，参见图4(b)，当受到大应力1000pa时，g’和g”迅速下降，表明聚离子复合物的结构被破坏，然而当应力恢复至低于10pa时，g’和g”能够恢复，该行为可至少交替重复3次，表明透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物有优异的自愈能力。

体外抗菌实验

将实施例1-实施例3制备的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物样品紫外线照射30min，加入1mlpbs缓冲溶液。将培养好的细菌取4ml到离心管，离心10min左右，倒掉清液，加8ml左右pbs使得od600＝0.1-0.2。将od600＝0.15的菌液稀释50倍后(1×104cfu/ml)，直接加到照射后的水凝胶中，培养1h，稀释10倍涂布。抗菌结果参见图5和图6，无论是革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌还是革兰氏阴性的大肠杆菌，随着ε-聚赖氨酸的浓度增加，抗菌能力均加强，显示出透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物优异的抗菌性能。

促进皮肤伤口愈合实验

1)以昆明鼠为实验动物，麻醉后，在昆明鼠背部脱毛，用手术剪剪出直径为1cm的圆形伤口，作为皮肤损伤的模型。将实施例3的透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物覆盖在伤口处，此组作为实验组。同时用商品3m膜敷料作为对照组，伤口不做处理者做空白组。

2)在5、10、15天时拍照并测量伤口直径，参见图7，可以观察到在第5、10、15天时实验组的愈合情况好于对照组与空白组，证明透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物能够促进伤口的愈合。

3)在第5、10、15天时对实验组、对照组与空白组的伤口组织进行病理切片he染色，显微镜下观察。参见图8(a)、图8(d)、图8(g)，可以观察到在第5天时，三组表皮和真皮中有大量炎症细胞浸润，伴有角质层丢失；参见图8(b)、图8(e)、图8(h),在第10天时，三个组炎症细胞浸润减少，实验组减少的最为明显，对照组减少的最不明显，且实验组的表皮明显增厚；参见图8(c)、图8(f)和图8(i)，在第15天时，三组均无明显炎症，皮肤的修复基本完成，但是实验组可以观察到腺体的存在，表明皮肤的结构和功能恢复的更为完善，证明透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物能够促进创面愈合。

4)在第5、10、15天时对实验组、对照组与空白组的伤口组织进行病理切片masson染色，显微镜下观察。参见图9(a)、图9(d)和图9(g)，在第5天时，三组均没有明显的胶原生成；参见图9(b)、图9(e)和图(h)，在第10天时，空白组仍然没有胶原生成，对照组与实验组l组有少量胶原生成；参见图9(c)、图9(f)和图9(i)，在第15天时，三组均有大量的胶原生成，此外实验组有明显的血管和腺体生成的现象，证明透明质酸-ε-聚赖氨酸盐酸盐的聚离子复合物能够促进创面愈合。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。