本发明属于医药化学领域，涉及具有抗乙型肝炎病毒(hbv)活性的磺胺苯甲酰胺类衍生物及其制备方法。
背景技术：
慢性乙型肝炎病毒(hbv)感染是全球重大公共卫生问题。据估计，全球慢性乙肝病毒感染者大约有3.5亿人，其中我国大约有9300万人。每年死于hbv感染及其相关性肝脏疾病者约100万例。目前现有抗hbv感染的药物主要包括疫调节剂和核苷类药物，虽然这些药物能够显著抑制dna复制，但是病毒容易对其产生耐药性，而且不能根治。因此，发现和开发具有全新作用机制的抗hbv药物是多年来该领域的研究热点。
核心蛋白是hbv核壳体组成的主要结构蛋白，在病毒进化过程中相对保守，并且核心蛋白的组装在乙肝病毒生命周期中发挥着重要作用。然而，目前还没有相关靶点的药物上市。针对目前进入临床候选药物肝毒性强、水溶性差以及代谢稳定性差的缺点，通过核心蛋白与配体的晶体复合物结构，进行了基于靶点的合理药物设计，设计了一类新型的磺胺苯甲酰胺化合物。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术所存在的缺陷，本发明提供了一种磺胺苯甲酰胺类衍生物及其制备方法，本发明还提供了上述化合物作为非核苷类hbv抑制剂的活性筛选结果及其应用。
本发明的技术方案如下：
一、磺胺苯甲酰胺类衍生物
本发明所涉及的一种磺胺苯甲酰胺类衍生物，具有如下通式ii所示的结构：
其中，r1-r4各自独立的选自氢或者卤素；r5代表环己胺、环戊胺、羟基哌啶、4-氨基-1,2,4-三氮唑、咪唑、吗啉基、苯胺、对甲基苯胺、4-丁基苯胺、异丙基胺或2-乙基己胺。
根据本发明优选的，通式ii所示的磺胺苯甲酰胺类衍生物是下列化合物之一：
二、磺胺苯甲酰胺类衍生物的制备方法
磺胺苯甲酰胺类衍生物的制备方法，以1,4-苯并二氧六环-6-甲酸为原料，经过磺化反应，酰化反应，磺酰化反应，得到产物ii；
反应路线如下：
其中r1，r2，r3，r4，r5如通式ii所述。
试剂及其条件：(i)氯磺酸，0℃，6-12h，140-150℃；(ii)氯化亚砜，n,n-二甲基甲酰胺，3-5h，80℃；(iii)乙腈，不同类型的苯胺，8h，60℃；(iv)二氯甲烷，n,n-二异丙基乙胺，不同类型的胺，8h，45℃。
所述的不同类型的苯胺选自：3-氯-4-氟苯，3-氟苯胺，4-氟苯胺，邻氟苯胺，3,5-二氟苯胺，3,4,5-三氟苯胺，3-氟-4-甲基苯胺。
所述的不同类型的胺选自环己胺、环戊胺、羟基哌啶、4-氨基-1,2,4-三氮唑、咪唑、吗啉基、苯胺、对甲基苯胺、4-丁基苯胺、异丙基胺或2-乙基己胺。
本发明磺胺苯甲酰胺类衍生物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将氯磺酸(18ml，277.54mmol)并降温至0℃，低温下缓慢加入1,4-苯并二氧六环-6-甲酸(5.0032g，27.75mmol)，升至室温，100℃回流反应6h；反应结束后冷却至室温，逐滴加入150ml冰水中，抽滤，水洗，干燥得搭配化合物2；
(2)将中间体2(1g,3.58mmol)溶于10ml氯化亚砜中，加入2滴n,n-二甲基甲酰胺，80℃回流反应，反应结束后冷却至室温，旋蒸得到中间体3；
(3)将中间体3溶于20ml乙腈中，加入不同类型的苯胺，60℃回流反应，反应结束后冷却至室温，浓缩，干法上样，快速制备硅胶色谱柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶，得到化合物i，所取的苯胺选自3-氯-氟苯胺，3-氟苯胺，4-氟苯胺，邻氟苯胺，3,5-二氟苯胺，3,4,5-三氟苯胺，3-氟-4-甲基苯胺。
(4)将化合物i溶于二氯甲烷中，加入不同类型的胺，加入3倍量的n,n-二异丙基乙胺,45℃回流反应,反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去二氯甲烷，加水，乙酸乙酯进行萃取，合并有机相,饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥，浓缩，干法上样，快速制备硅胶色谱柱分离，重结晶得到目标化合物，所述的不同类型的胺选自环己胺、环戊胺、羟基哌啶、4-氨基-1,2,4-三氮唑、咪唑、吗啉基、苯胺、对甲基苯胺、4-丁基苯胺、异丙基胺或2-乙基己胺。
三、磺胺苯甲酰胺类衍生物的应用
本发明公开了磺胺苯甲酰胺衍生物抗hbv活性筛选结果及其作为抗hbv抑制剂的应用。通过实验证明本发明的磺胺苯甲酰胺衍生物可作为经典的hbv非核苷类抑制剂应用。
如表1所示，对所合成的目标化合物ii(5b-5t)进行了体外抗hbv活性评价,通过cck-8法测定了10μm药物浓度下细胞的死亡率；同时，通过定量pcr法测定了1μl药物浓度下抑制hbvdna复制活性，选择先导化合物5a和上市药物恩替卡韦为阳性对照，其中5b，5c和5k表现了较好的抑制hbvdna复制活性。
如表2所示，根据初筛结果，对初筛目标化合物5b，5c，5j进行进一步体外抗hbv活性评价，通过cck-8法测定了药物在不同浓度下的细胞毒性；通过pcr法测定了药物在不同浓度下抑制hbvdna复制活性。选择先导化合物5a和上市药物恩替卡韦为阳性对照,每个化合物设置五个浓度梯度(10μm，2μm，0.4μm，0.08μm和0.012μm),分别计算出半数抑制浓度cc50、ic50和选择性系数si。
本发明的磺胺苯甲酰胺衍生物是一类结构新型的非核苷类hbv抑制剂，可作为抗hbv的先导化合物。
本发明的磺胺苯甲酰胺类衍生物可作为非核苷类hbv抑制剂应用。具体地说作为hbv抑制剂用来制备抗乙肝药物。
一种抗hbv药物组合物，包括本发明的磺胺苯甲酰胺类衍生物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
本发明公开此类磺胺苯甲酰胺类衍生物、其制备方法、抗hbv活性筛选结果及其作为抗hbv抑制剂的首次应用，实验证明磺胺苯甲酰胺类衍生物可作为hbv抑制剂用于制备抗乙肝药物。
具体实施方式
通过下述实例有利于理解本发明，但是不能限制本发明的内容，在下列实例中所有目标化合物的编号与上文相同。
合成路线：
试剂及其条件(i)氯磺酸，0℃，6-12h，140-150℃；(ii)氯化亚砜，n,n-二甲基甲酰胺，3-5h，80℃；(iii)乙腈，不同类型的苯胺，8h，60℃；(iv)二氯甲烷，n,n-二异丙基乙胺，不同类型的胺，8h，45℃。
实施例1：化合物2的制备，取50ml圆底烧瓶，加入氯磺酸(18ml，277.54mmol)并降温至0℃，低温下缓慢加入1,4-苯并二氧六环-6-甲酸(5.0032g，27.75mmol)，升至室温，100℃回流反应6h。反应结束后冷却至室温，逐滴加入150ml冰水中，抽滤，水洗，干燥得棕黄色固体7.0040g，产率90.6％。
化合物2的波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ12.54(s,4h),7.52(d,j＝1.6hz,1h),7.18(d,j＝2.0hz,1h),4.31(d,j＝4.0hz,2h),4.28(d,j＝4.8hz,2h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ166.63,144.15,143.44,140.33,120.71,120.59,117.91,64.73,64.12.
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实施例2：化合物3的制备，取25ml圆底烧瓶，将中间体2(1g,3.58mmol)溶于10ml氯化亚砜中，加入2滴n,n-二甲基甲酰胺，80℃回流反应，反应结束后冷却至室温，旋蒸得黄色油状产物1.17g。
实施例3：化合物i的制备，取100ml圆底烧瓶，将中间体3溶于20ml乙腈中，加入不同类型的苯胺，60℃回流反应，反应结束后冷却至室温，浓缩，干法上样，快速制备硅胶色谱柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶。
实施例4：中间体4的制备
取100ml圆底烧瓶，将中间体3(1g，3.37mmol)溶于20ml乙腈中，加入3-氯-4-氟苯胺(0.5886g，3.37mmol)，60℃回流反应，反应结束后冷却至室温，浓缩，干法上样，快速制备硅胶色谱柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶，所得为黄色固体，获得1.0969g黄色固体，产率为91％。
中间体4
中间体4波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.32(s,1h),8.14–7.93(m,1h),7.79–7.58(m,1h),7.38(dt,j＝8.8,1.2hz,2h),7.17(d,j＝2.0hz,1h),4.33(dd,j＝27.6,3.1hz,4h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ164.24(d,j＝11hz),153.97(d,j＝201hz),143.22,141.98,141.18,136.54(dd,j＝11,3hz),124.48(d,j＝9hz),121.58(d,j＝9hz),120.53(t,j＝8hz),119.16,117.44,117.22,116.94(d,j＝3hz),65.10,64.26.
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实施例5：化合物5b的制备
取25ml圆底烧瓶，将中间体4(720mg，1.7mmol)溶于10ml二氯甲烷中，加入环戊胺(156μl，1.7mmol)n,n-二异丙基乙胺(570μl,5.1mmol)，40℃回流反应。反应结束后冷却至室温，加入水(20mlx3)，合并有机相，饱和食盐水洗(20mlx3)，无水硫酸钠干燥，浓缩，干法上样，快速制备色谱硅胶柱分离，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶，获得0.21g白色固体粉末，产率27％，熔点176.6-178.1℃。
化合物5b
化合物5b波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.43(s,1h),8.02(dd,j＝6.7,2.2hz,1h),7.71–7.53(m,3h),7.48–7.32(m,2h),4.42(dd,j＝30.3,3.0hz,4h),2.05–0.93(m,9h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ163.37,153.93(d,j＝242hz),144.75,144.22,136.35(d,j＝3hz),134.24,125.68,121.70,120.65(d,j＝7hz),120.28,119.77,119.59,117.48(d,j＝12hz),
65.37,64.35,54.94,32.97,23.28.
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实施例6：化合物5c的制备
取25ml圆底烧瓶，将化合物4(300mg，0.7mmol)溶于10ml二氯甲烷中，加入环己胺(70μl，0.7mmol)，n,n-二异丙基乙胺(330μl,2.1mmol)，40℃回流反应。反应结束后冷却至室温，旋蒸除去二氯甲烷，加入水(40ml)，乙酸乙酯萃取三次(20mlx3)，合并有机相，饱和食盐水洗(20mlx3)，无水硫酸钠干燥，浓缩，二氯甲烷-正己烷混合溶剂重结晶，获得0.18g白色固体粉末，产率54％，熔点167.8-168.8℃。
化合物5c
化合物5c波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.43(s,1h),8.02(dd,j＝6.7,2.0hz,1h),7.65(d,j＝6.8hz,2h),7.57(d,j＝1.6hz,1h),7.50–7.36(m,2h),4.99–3.92(m,4h),2.93(s,1h),1.60(d,j＝7.8hz,4h),1.37–0.96(m,6h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ163.26,153.68(d,j＝232hz),144.66,144.19,136.36(d,j＝4hz),135.05,125.64,120.64(d,j＝7hz),120.00,119.77,119.59,117.60,117.32(d,j＝14hz),65.35,64.35,52.61,33.68,25.33,24.76.
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实施例7：化合物5d制备
操作同例5，所不同的是把环戊胺换成4-羟基哌啶。白色固体粉末，产率50％，熔点174.6-181.3℃。
化合物5d
化合物5d波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.48(s,1h),8.02(dd,j＝6.8,2.5hz,1h),7.78–7.58(m,1h),7.55–7.38(m,2h),7.31(d,j＝2.1hz,1h),4.70(d,j＝3.7hz,1h),4.43(dd,j＝29.6,3.0hz,4h),3.56(dd,j＝7.0,3.5hz,1h),3.22–3.00(m,2h),2.78(t,j＝8.1hz,2h),1.96–1.68(m,2h),1.62–1.29(m,2h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ163.26,144.92(d,j＝102hz),136.36,128.06,126.15,121.69,120.95,120.63(d,j＝7hz),119.77,119.59,118.26,117.61,117.40,65.39,64.36,64.05,43.55,33.28.
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实施例8：化合物5e的制备，操作同例5，所不同的是把环戊胺换成4-氨基-1,2,4-三氮唑，产物褐色固体，产率为18％，熔点252.1-253.2℃。
化合物5e的波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.44(s,1h),8.00(dd,j＝6.8,2.4hz,1h),7.66–7.59(m,1h),7.55(t,j＝8.9hz,1h),7.50(d,j＝2.3hz,1h),7.47–7.38(m,3h),7.30–6.88(m,1h),4.48(d,j＝41.6hz,4h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ162.57,154.44(d,j＝243hz),152.80,147.18,144.52,136.12,(d,j＝3hz),133.96,132.76,129.80,126.04,122.15,121.82,120.72(d,j＝7hz),119.79,118.99,117.34,65.72,65.34.
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实施例9：化合物5f的制备，操作同例5，所不同的是把环戊胺换成咪唑，产物为白色固体，产率22％，熔点220.9-222.8；
化合物5f波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.54(s,1h),8.41(s,1h),7.99(dd,j＝6.8,2.3hz,1h),7.88–7.81(m,2h),7.77(d,j＝2.2hz,1h),7.66–7.56(m,1h),7.43(t,j＝9.1hz,1h),7.13(s,1h),4.42(dd,j＝28.5,3.2hz,4h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ162.76,153.98(d,j＝242hz),147.28,144.92,137.77,136.21,(d,j＝3hz),131.67,129.27,127.01,121.09,120.55(d,j＝7hz),119.83,118.79,117.93,117.67,117.45,65.57,64.36.
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实施例10：化合物5g的制备，操作同例5，所不同的是把环戊胺换成吗啉基，产物为白色固体，产率78.7％，熔点249.5-252.2。
化合物5g波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.39(s,1h),10.14(s,1h),7.99(dd,j＝6.8,2.3hz,1h),7.66–7.57(m,1h),7.53(d,j＝2.0hz,1h),7.42(t,j＝9.1hz,1h),7.32(d,j＝2.0hz,1h),7.03(q,j＝8.4hz,4h),4.38(dd,j＝32.7,2.9hz,4h),2.19(s,3h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ163.22,154.16(d,j＝253hz),145.73,144.51,137.77,136.35(d,j＝2.9hz),126.78,126.30,121.69,121.13,120.63(d,j＝7.0hz),119.68(d,j＝18.5hz),118.45,117.60,117.39,65.72,65.4.
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实施例11：化合物5h的制备，操作同例5，所不同的是把环戊胺换成苯胺，产物为白色固体，产率为41％，熔点223.0-226.8℃。
化合物5h
化合物5h波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.41(t,j＝47.3hz,2h),7.98(d,j＝6.8hz,1h),7.69–
7.49(m,2h),7.45–7.31(m,3h),7.30–7.20(m,1h),7.19–7.09(m,1h),7.03(t,j＝7.3hz,1h),4.38(d,j＝33.2hz,4h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ163.04(d,j＝9.9hz),154.53(d,j＝242.1hz),136.25,131.58(s),129.76(s),125.86(d,j＝10.5hz),124.54(s),122.02(s),121.68(d,j＝5.2hz),120.98–120.08(m),119.70(d,j＝18.5hz),118.02(s),117.50(dd,j＝14.9,6.8hz),65.41(s),64.31(s).
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实施例12：化合物5i的制备，操作同例5，所不同的是把环戊胺换成对甲基苯胺，产物为白色固体，产率为70％，熔点229.1-237.0℃。
化合物5i
化合物5i波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.39(s,1h),10.14(s,1h),7.99(dd,j＝6.8,2.3hz,1h),7.66–7.57(m,1h),7.53(d,j＝2.0hz,1h),7.42(t,j＝9.1hz,1h),7.32(d,j＝2.0hz,1h),7.03(q,j＝8.4hz,4h),4.38(dd,j＝32.7,2.9hz,4h),2.19(s,3h).
13c-nmr(101mhz,dmso)δ163.11,153.95(d,j＝242hz),145.24,144.20,136.25,135.41,133.83,132.29,130.16,125.73,121.68,120.70,120.59,120.51,119.70(d,j＝18.3hz),117.58(d,j＝18.3hz),117.38,65.36,64.30,20.75.
esi-ms：calculatedforc22h18clfn2o5s[m-h]-476.06090,found475.05130.
实施例13：化合物5j的制备，操作同例5，所不同的是把环戊胺换成4-正丁基苯胺，产物为白色固体，产率为75％，熔点168.9-171.9℃。
化合物5j
化合物5j波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.38(s,1h),10.14(s,1h),7.99(d,j＝4.8hz,1h),7.64–
7.57(m,1h),7.51(s,1h),7.41(t,j＝9.1hz,1h),7.32(d,j＝1.3hz,1h),7.05(dd,j＝19.2,8.3hz,4h),4.59–4.13(m,4h),2.46(t,j＝7.6hz,2h),1.58–1.37(m,2h),1.24(dd,j＝14.6,7.3hz,2h),0.84(t,j＝7.3hz,3h).
13c-nmr(101mhz,dmso)δ163.10,153.94(d,j＝242hz),145.23,144.20,138.78,136.29,135.59,132.37,129.47,125.73,121.66,120.73,120.6,120.56,120.43,119.69(d,j＝18.4hz),117.5(d,j＝6hz),117.37,5,65.36,64.30,34.54,33.51,22.15,14.19.
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实施例14：化合物5k的制备，操作同例5，所不同的是把环戊胺换成异丙胺，产物为白色固体，产率为66％，熔点170.4-172.3℃。
化合物5k
化合物5k波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.43(s,1h),8.02(dd,j＝6.8,2.4hz,1h),7.76–7.51(m,3h),7.51–7.34(m,2h),4.42(dd,j＝29.8,3.1hz,4h),3.23(dd,j＝13.1,6.6hz,1h),0.98(d,j＝6.5hz,6h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ163.37,154.23(d,j＝252.4hz),144.71,144.23,135.37,134.55,125.71,121.69,120.65(d,j＝7hz),120.12,119.77,117.61,117.39,111.69,65.35,64.36,46.77,23.72.
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实施例15，化合物5l的制备，操作同例5，所不同的是把环戊胺换成2-乙基己胺，产物为白色固体，产率为40％，熔点190.9-193.7℃。
化合物5l
化合物5l波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.43(s,1h),8.01(d,j＝5.5hz,1h),7.76–7.25(m,5h),4.41(d,j＝28.9hz,4h),2.63(s,2h),1.46–1.04(m,9h),0.96–0.63(m,6h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ163.37,153.98(d,j＝246hz),144.78,144.27,136.30,133.37,125.71,121.71,120.64,120.21,119.71,119.63,117.60,117.43,65.37,64.36,45.81.30.62,28.62,23.74,22.87,14.39,10.99.
esi-ms：calculatedforc23h28clfn2o5s[m-h]-498.13915,found497.12875.
实施例16：化合物5m的制备，操作同例5，所不同的是把环戊胺换成对羟基环己胺，产物为黄色固体，产率为58％，熔点201.1-202.4℃。
化合物5m结构
化合物5m波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.42(s,1h),8.01(dd,j＝6.8,2.4hz,1h),7.62(m,3h),7.41(dd,j＝12.3,9.2hz,2h),4.73–3.81(m,5h),3.30(d,j＝9.2hz,1h),3.13–2.72(m,1h),1.67(dd,j＝32.9,11.1hz,4h),1.39–0.87(m,4h).
13c-nmr(100mhz,dmso)δ163.36,154.24(d,j＝242hz),144.69,144.21,136.33(d,j＝3.0hz),134.86,125.66,121.71,120.66(d,j＝7hz)),120.02,119.78,119.60,117.37(t,j＝21hz),68.02,65.35,64.34,52.14,33.98,31.44.
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实施例17：化合物5n的制备，首先操作同例4，将3-氯-4-氟苯胺换成3-氟苯胺，后续操作同例16，产物为白色固体，产率为40％，熔点111.1-120.1℃；
化合物5n
化合物5n波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.43(s,1h)7.70(d,j＝11.6hz,1h),7.62(d,j＝7.0hz,1h),7.56(d,j＝2.0hz,1h),7.52–7.35(m,3h),6.95(td,j＝8.5,2.2hz,1h),4.66–4.14(m,5h),3.33–3.26(m,1h),3.05–2.76(m,1h),1.68(dd,j＝31.9,11.5hz,4h),1.30–0.90(m,4h).
13c-nmr(101mhz,dmso)δ163.79,162.44,(d,j＝209hz)144.66,144.20,140.81(d,j＝11.0hz),134.85,130.94(d,j＝9.5hz),125.95,119.96,117.17,116.02,110.85(d,j＝21hz),106.99(d,j＝27hz),68.02,65.33,64.35,55.37,52.14,33.98,31.44.
esi-ms：calculatedforc21h23fn2o6s[m-h]-450.12609,found449.11536.
实施例18：化合物5o的制备，首先操作同例4，将3-氯-4-氟苯胺换成对氟苯胺，后续操作同例16，产物为白色固体，产率为42％，熔点205.1-207.5℃；
化合物5o
化合物5o波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.30(s,1h),7.73(dd,j＝8.1,5.3hz,2h),7.63(d,j＝6.9hz,1h),7.55(s,1h),7.38(s,1h),7.21(t,j＝8.7hz,2h),4.45(dd,j＝26.2,23.1hz,5h),3.29(s,1h),2.94–2.80(m,1h),1.67(dd,j＝33.1,11.4hz,4h),1.35–0.75(m,4h).
13c-nmr(101mhz,dmso)δ163.07,159.27,(d,j＝333hz)144.62,144.16,135.71,134.76,126.13,122.04,(d,j＝8hz),119.97,117.03,115.99,115.76,68.01,66.29,64.39,52.12,33.98,31.44.
esi-ms：calculatedforc21h23fn2o6s[m-h]-450.12609,found449.11542.
实施例19：化合物5p的制备，首先操作同例4，将3-氯-4-氟苯胺换成邻氟苯胺，后续操作同例16，产物为白色固体，产率为45％，熔点200.0-200.8℃.
化合物5p
化合物5p波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.06(s,1h),8.04(t,j＝8.6hz,1h),7.79(d,j＝1.6hz,1h),7.65(d,j＝7.0hz,1h),7.43(d,j＝1.7hz,1h),7.38–7.28(m,1h),7.27–7.17(m,2h),4.47(d,j＝51.4hz,5h),3.31–3.25(m,1h),2.97–2.82(m,1h),1.68(dd,j＝33.1,11.5hz,4h),1.13(ddd,j＝35.5,17.0,8.7hz,4h).
13c-nmr(101mhz,dmso)δ162.57,154.23(d,j＝241hz),145.29,144.37,134.93,126.25(d,j＝11.1hz),125.03,124.61,123.87,120.91,117.87,115.97(d,j＝19.2hz),68.03,65.67,64.21,52.17,34.00,31.44.
esi-ms：calculatedforc21h23fn2o6s[m-h]-450.12609,found449.12653.
实施例20：化合物5q的制备，首先操作同例4，将3-氯-4-氟苯胺换成3,5-二氟苯胺，后续操作同例16，产物为白色固体，产率为35％，熔点219.3-219.9℃；
化合物5q
化合物5q波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.59(s,1h),7.63(d,j＝7.0hz,1h),7.56(d,j＝2.1hz,1h),7.46(d,j＝7.7hz,2h),7.41(d,j＝2.1hz,1h),6.98(t,j＝5.7hz,1h),4.42(dd,j＝29.4,3.3hz,5h),3.31–3.25(m,1h),3.00–2.81(m,1h),1.68(dd,j＝32.7,12.0hz,4h),1.26–0.98(m,4h).
13c-nmr(101mhz,dmso)δ163.77,162.77(d,j＝199hz)144.69,144.23,134.92,125.58,119.95,117.36,103.25,102.96,99.53,68.01,65.37,64.36,52.14,33.97,31.43.
esi-ms：calculatedforc21h22f2n2o6s[m-h]-468.11666,found467.10590.
实施例21：化合物5r的制备，首先操作同例4，将3-氯-4-氟苯胺换成3,4,5-三氟苯胺，后续操作同例16，产物为白色固体，产率为50％，熔点225.1-228.0℃；
化合物5r
化合物5r波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.57(s,1h),7.69–7.60(m,3h),7.56(d,j＝1.9hz,1h),7.41(d,j＝1.9hz,1h),4.64–4.13(m,5h),3.30(d,j＝4.2hz,1h),2.89(s,1h),1.67(dd,j＝34.3,11.6hz,4h),1.43–0.91(m,4h).
13c-nmr(101mhz,dmso)δ163.70,150.65(d,j＝202hz),144.69,144.24,134.94,125.38,119.95,117.41,104.74,104.50,68.01,65.38,64.36,52.14,,33.97,31.43.
esi-ms：calculatedforc20h21f3n2o3s[m-h]-486.10724,found485.09830.
实施例22：化合物5s的制备，首先操作同例4，将3-氯-4-氟苯胺换成3-氟-4-甲基苯胺，后续操作同例16，产物为白色固体，产率为42％，熔点201.1-202.4℃；
化合物5s
化合物5s波谱数据
1h-nmr(400mhz,dmso)δ10.18(s,1h),7.62(d,j＝6.9hz,2h),7.58–7.50(m,2h),7.38(d,j＝1.7hz,1h),4.41(dd,j＝31.0,3.2hz,5h),3.29(dd,j＝9.0,5.0hz,1h),3.00–2.75(m,1h),2.24(s,3h),1.68(dd,j＝31.9,11.7hz,4h),1.25–0.94(m,5h).
13c-nmr(101mhz,dmso)δ162.96,157.43(d,j＝238hz),144.65,144.13,135.15,134.78,126.07,124.80(d,j＝18hz),123.29(d,j＝5hz),120.02,119.53(d,j＝8hz),117.05,115.57,115.34,68.02,65.32,64.33,52.14,33.99,31.43,14.83.
esi-ms：calculatedforc22h25fn2o6s[m-h]-464.14174,found463.13527.
实施例23：目标化合物体外抗hbv细胞活性筛选实验
测试原理
hbv稳定转染的肝癌细胞hepad38细胞株，在进行细胞培养时能够分泌hbv病毒颗粒(包含hbsag,hbeag和dna)。在抗hbv目标化合物的干预下，细胞分泌hbsag和hbeag的含量和产生的dna会有所变化,因此检测细胞分泌到培养上清中的hbsag的和hbeag的含量以及产生的hbvdna,参照未加药对照组的含量可以计算出样品药物的抗病毒活性。以恩替卡韦为阳性对照药，用定量pcr法检测药物抑制hbvdna含量50％时浓度数值ic50；运用cck-8检测样品药物导致50％细胞死亡的数值浓度为cc50值，并计算出待测化合物的“选择系数”(selectivityindex)，计算公式:si＝cc50/ic50。
(1)细胞毒性实验
配成实验所需样品储备浓度(100μm)，每个样品用hepad38细胞培养液配制稀释浓度(1μm)进行初步活性筛选，设立空白对照并以恩替卡韦为的阳性对照药加入96孔板细胞培养板，每浓度3复孔,每2天换同浓度药液并设无药细胞对照组，共培养10天。用cck-8法检测细胞存活率，确定药物对hepad38细胞的毒性。对毒性小的化合物用hepad38细胞培养液配制5个稀释浓度(10μm、2μm、0.4μm、0.08μm和0.012μm/l)，设立空白对照并以恩替卡韦和先导化合物5a作为阳性对照药。加入96孔板细胞培养板，每浓度3复孔，每2天换同浓度药液并设无药细胞对照组，共培养10天。用cck-8法检测细胞存活率，确定药物对hepad38细胞的毒性。
(2)抑制hbvdna活性实验(定量pcr方法)
hepad38细胞在96孔细胞培养板中培养24小时后，加入所配10μm、2μm、0.4μm、0.08μm和0.012μm含药培养液,继续培养10天(每2天换液一次),收集上清液，用定量pcr法检测细胞上清hbvdna含量。
表1活性化合物和上市药物恩替卡韦的抗乙肝病毒活性
如表1所示，根据初步筛选的结果，对初筛的目标化合物5b，5c和5k进一步的体外抗hbv活性评价，通过cck-8法测定了药物在不同浓度下的细胞毒性；通过定量pcr法测定了药物在不同浓度下抑制hbvdna的活性。以上市药物恩替卡韦为阳性对照，每个化合物设置五个浓度梯度(10μm、2μm、0.4μm、0.08μm和0.012μm)，分别计算出半数抑制浓度cc50、ic50和选择性系数si。
活性结果表明，目标化合物5b，5c，5k都表现了较小的细胞毒性，其cc50＞10μm，5k表现出较好的抗hbvdna复制的活性。其ic50为0.00096μm，虽然不如上市的药物恩替卡韦，但是仍然可以进行进一步的修饰研究。