一种PI3Kα选择性抑制剂及其制备方法和应用

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种pi3kα选择性抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

癌症一直被认为是世界上每个国家人口的主要死亡原因，它严重威胁着人类的生命健康。根据国际癌症研究机构的最新研究报告，在全球范围内，2020年有1930万新的癌症病例和近1000万的癌症死亡。所以无论人类的发展水平如何，这种疾病都是世界各地发病率和死亡率的重要原因。目前，癌症的临床治疗用药主要分为传统的细胞毒类药物和新型的分子靶向药物。近年来，由于靶向分子药物具有较明确的作用靶点而提高对癌细胞的选择性，降低了对正常组织的毒性等原因，靶向分子药物已开始走进全球抗癌市场的中心舞台。癌症的分子靶向治疗是以癌细胞的标志性分子为靶点，干预细胞发生癌变的环节，如通过抑制癌细胞增殖、干扰细胞周期、诱导癌细胞分化、抑制癌细胞转移、诱导癌细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成等途径达到治疗癌症的目的。肿瘤的生长因子受体、信号转导分子、细胞周期蛋白、细胞凋亡调节因子、蛋白水解酶、血管内皮生长因子等都可以作为癌症治疗的分子靶点。

磷脂酰肌醇-3-激酶(pi3k)-蛋白激酶b(akt/pkb)-哺乳动物雷帕霉素靶标(mtor)途径是哺乳动物肿瘤免疫中一条重要的信号通路，它与细胞增殖、细胞周期进程、细胞存活、细胞生长及血管生成等密切相关。此通路的激活与肿瘤细胞的凋亡、迁移、肿瘤的发生发展及耐药性密切相关。该通路的上游成员pi3k是一类高度保守的脂质激酶家族，它能够整合生长因子、细胞因子和其他环境信号，将它们转化为细胞内信号，调节多种信号通路从而调节人的细胞和生物功能。在体内，pi3k可将磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(pip2)磷酸化生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(pip3)，pip3再作为第二信使，激活下游的akt、mtor等，从而发挥对细胞过程及生理功能的调控作用。在各种癌症中经常发现pi3k的激活突变、扩增等，这使得它成为抗癌治疗的主要药物靶点。

根据结构特点和底物分子可将pi3k其分为ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型三类。i类pi3k根据其调控方式进一步分为ia类和ib类。其中ⅰa型pi3k与肿瘤关系最为密切，是药物开发中非常活跃的领域。其根据催化亚基的不同又可分为pi3kα、pi3kβ和pi3kδ等3个亚型。其中pi3kα由催化亚基p110α和调节亚基p85组成。癌症基因组图谱(tcga)计划对3000多种癌症的突变情况进行了研究，将编码pi3kα的基因pik3ca列为第二大最常见的突变癌基因。它的热点突变主要集中在螺旋区和激酶结构域，包括e542k，e545k和h1047r。它突变后在异常激活pi3kα的同时，还能抑制抑癌基因pten的表达，因此pi3kα历来都是各种抗癌药物研发中极为重要的靶点。

现在研究的pi3k抑制剂主要有泛-pi3k抑制剂和特异选择性pi3k抑制剂。泛-pi3k抑制剂可作用于所有亚型蛋白，它们缺乏对单一亚型的针对性，因此具有不同程度的潜在毒性，大多数已经停止研发。与之相反的，趋向于特异亚型的抑制剂，它们结合某一种或两种亚型，具有较小的脱靶毒性。截止目前，pi3k有4款抑制剂上市，分别为2014年被批准的pi3kδ抑制剂idelalisib、2017年上市的pi3kα/δ抑制剂copanlisib、2018年被批准的pi3kδ/γ抑制剂duvelisib和2019年上市的pi3kα抑制剂alpelisib。除此之外，还有几十种抑制剂进入临床研究，不过上市及进入临床研究的抑制剂，特异性抑制剂占大多数。在不良反应的为难之下，现在的研究更多偏向亚型特异性的pi3k抑制剂。目前，只有一款pi3kα选择性抑制剂上市，诺华公司研制的alpelisib在2019年被批准用于与氟维司群联合使用，治疗携带pik3ca基因突变的、患有hr⁺/her^2-晚期或转移性乳腺癌的、接受内分泌治疗方案之中或之后疾病进展的绝经后女性和男性患者。此外，处于临床研究的pi3kα抑制剂有6个，包括ch-5132799、cyh-33、inavolisib、serabelisib、asn-003和lx-086。然而，现在在研的pi3kα抑制剂，关于实体瘤的临床反馈除了对乳腺癌效用明显外，其它实体瘤的临床结果并不理想，所以，研发人员还需探索新型pi3kα选择性抑制剂，以便用于更多的癌症的治疗。

技术实现要素：

发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种全新母核的三嗪环骈苯并噁唑类化合物，对pi3kα具有明显的抑制作用，因此可用于制备对pi3kα具有高选择性的抑制剂，进而有望开发出治疗与pi3k信号通路相关的疾病如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、白血病等的靶向药物。本发明还提供所述该类化合物及其中间体的具体制备方法和医药用途。

技术方案：本发明提供一种如下式(i)所示的三嗪环骈苯并噁唑类化合物或其药物上可接受的盐：

其中，x选自n、s；y选自o、n；

r1独立地选自以下其中一种：

r2独立地选自以下其中一种：

r3独立地选自氢、c1-c8烷基、c3-c8环烷基、-c(o)r4、-s(o)2r5、r4独立地选自c1-c8烷基、c3-c8环烷基、无取代或被对位r7取代的苯基；

r5独立地选自c1-c8烷基；

r6独立地选自氢、羟基、巯基、氰基、硝基、三氟甲基、c1-c8烷基、c1-c8烷氧基、-c(o)or8、-c(o)nhr9；

r7、r8、r9分别独立地选自氢、c1-c8烷基。

优选的，x选自n、s；y选自o、n；

优选的，r1独立地选自以下其中一种：

优选的，r2独立地选自以下其中一种：

优选的，r3独立地选自氢、异丙基、环戊烷、-c(o)r4、-s(o)2r5、r4选自甲基、异丙基、环己烷、无取代的苯环；r5选自甲基；r6选自氢、氰基、硝基、三氟甲基、异丙基、甲氧基、-c(o)or8、-c(o)nhr9，r8选自氢、甲基，r9选自氢。

本发明提供的所述化合物或其药学上可接受的盐：具体优选自i-1至i-46：

本发明所述的化合物或其药物上可接受的盐的制备方法，其化学反应路线为：

由化合物a与化合物b在钯催化剂的作用下经偶联反应制备化合物i。

本申请所述的化合物或其药物上可接受的盐，其中用于成盐的酸包括无机酸及有机酸，所述无机酸包括盐酸、硫酸、磷酸和甲磺酸，有机酸包括乙酸、三氯乙酸、丙酸、丁酸、马来酸、对甲苯磺酸、苹果酸、丙二酸、肉桂酸、柠檬酸、富马酸、樟脑酸、二葡糖酸、天冬氨酸和酒石酸。优选的，本发明所述药物上可接受的盐主要为盐酸盐。

本申请还提供了一种药用组合物，包含通式(i)所述的化合物或其药学上可接受的盐、互变及立体异构体、代谢产物、代谢前体、溶剂化合物或前药，以及药学上可接受的载体。所述药物组合物可以是片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂等制剂学上常规的制剂形式。

本申请还提供了通式(i)所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备pi3kα靶点抑制剂中的应用。进一步的，所述化合物或其药学上可接受的盐可用于制备治疗受pi3k调控的疾病的药物中的应用。优选的，治疗与pi3k信号通路相关的疾病为癌症、免疫病症或炎性病症，癌症主要包括胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、、骨癌、脑癌、头颈癌、肠癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤等。

本申请化合物或其药学上可接受的盐还可以与其他特定靶点的药物联用，如本申请中化合物与紫杉醇联合应用于胃癌，具有协同治疗作用。

有益效果：相比较于现有技术，本申请提供了一种全新母核的三嗪环骈苯并噁唑类化合物，本申请经过生物化学活性测试，该类化合物对pi3kα具有良好的抑制活性，因此这些化合物能够为受pi3k调控的疾病治疗提供有效且选择性更好的抑制剂，进而有望开发出治疗与pi3k信号通路相关的疾病如胃癌、乳腺癌、卵巢癌、白血病等的靶向药物。

附图说明

图1是化合物i-7抑制人胃癌细胞mgc-803异种移植瘤在小鼠体内的生长；

图2是化合物i-7给药期间人胃癌细胞mgc-803异种移植瘤小鼠的体重变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

本发明中合成使用到的原料都是直接购买或者通过常规操作制备，商购原料无特殊说明均未处理直接用于化学反应。

中间反应物的合成

1)4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉(m1)的合成

将原料三聚氯氰(10.0g,1.0eq.)用丙酮溶解，加入三乙胺(10.9g，2.0eq.)，将吗啉(4.72g,1.0eq.)溶液用丙酮稀释后置于滴液漏斗中，-10℃下缓慢滴入反应瓶。待吗啉溶液滴完，立即用tlc板监测反应，原料基本反应完，停止反应。将其倒入碎冰中，抽滤，水洗，得到白色固体11.67g，直接投下一步。这一步吗啉的当量一定控制在1.0倍，否则会出现三取代的副产物，增加后处理步骤。其次，吗啉溶液需要用丙酮稀释后，低温缓慢加入，否则也会出现三取代的副产物。白色固体，产率92％，ms(esi)m/z236.1[m+h]⁺.

2)4-(4-氯-6-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉(m2)的合成

将中间体m1(235.07mg,1.0eq.)溶于四氢呋喃中，加入dipea(193.88mg,1.5eq.)作为碱，将原料n-甲基磺酰哌嗪(164.23mg,1.0eq.)用四氢呋喃稀释后在冰浴的条件下滴加入反应瓶，tlc监测反应，反应结束后加水，用dcm萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，通过快速制备液相色谱进一步纯化。得白色固体185mg，产率51％，ms(esi)m/z363.8[m+h]⁺.

3)4-(4-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉(m3)的合成

参照中间化合物m2的合成方法，白色固体，产率82％，ms(esi)m/z313.8[m+h]⁺.

4)4-(4-氯-6-(4-异丙基哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉(m4)的合成

参照中间化合物m2的合成方法，白色固体，产率85％，ms(esi)m/z327.8[m+h]⁺.

5)1-(4-(4-氯-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(m5)的合成

参照中间化合物m2的合成方法，白色固体，产率67％，ms(esi)m/z327.8[m+h]+.

6)4-(4-氯-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(m6)的合成

参照中间化合物m2的合成方法，白色固体，产率80％，ms(esi)m/z385.9[m+h]+.

7)4-(4-氯-6-(4-(三氟甲基)哌啶-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉(m7)的合成

参照中间化合物m2的合成方法，白色固体，产率68％，ms(esi)m/z352.8[m+h]+.

8)4,4'-(6-氯-1,3,5-三嗪-2,4-二基)二吗啉(m8)的合成

参照中间化合物m1的合成方法，白色固体，产率95％，ms(esi)m/z286.7[m+h]+.

9)4-氯-6-吗啉代-n-(四氢-2h-吡喃-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺(m9)的合成

参照中间化合物m2的合成方法，白色固体，产率55％，ms(esi)m/z300.8[m+h]+.

10)4-氯-6-吗啉代-n-(3-(三氟甲基)苯基)-1,3,5-三嗪-2-胺(m10)的合成

参照中间化合物m2的合成方法，白色固体，产率78％，ms(esi)m/z360.7[m+h]+.

11)n-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-4-氯-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-胺(m11)的合成

参照中间化合物m2的合成方法，白色固体，产率58％，ms(esi)m/z336.7[m+h]+.

12)5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二恶硼硼烷-2-基)苯并[d]恶唑-2-胺(m12)的合成

将原料2-氨基-5-溴苯并噁唑(100mg,1.0eq.)和联硼酸频那醇酯(131mg,1.1eq.)，以醋酸钾(138.4mg,3.0eq.)作为碱，1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(34.4mg,0.1eq.)作为催化剂，1,4二氧六环作为溶剂加入三口反应瓶，用氩气保护，105℃下反应12h,用长针头取反应液用tlc监测反应，原料反应完停止反应。趁热抽滤，过滤掉盐及金属催化剂，剩余反应液减压浓缩，粗产物通过快速制备液相色谱进一步纯化。这一步要注意反应时间，因为以醋酸钾作为碱，如果时间超过12h，产物氨基端容易上一个乙酰基，生成副产物。淡褐色固体67mg，产率55％，ms(esi)m/z261.1[m+h]+.

13)6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺(m13)的合成

参照中间化合物m12的合成方法。不过苯并噻唑环反应活性降低，用最初的1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯作为催化剂，大部分原料剩余，且产物与原料极性相似，后处理很难分离。所以在尝试了1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯作为催化剂，醋酸钾或者碳酸铯作为碱的情况下，我们换为[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物作为催化剂，醋酸钾或者碳酸铯作为碱，相比之下醋酸钾效果更好。以1,4-二氧六环作为溶剂，用氩气保护，105℃下反应12h,用长针头取反应液用tlc监测反应，原料反应完停止反应。趁热抽滤，过滤掉盐及金属催化剂，剩余反应液减压浓缩，粗产物通过快速制备液相色谱进一步纯化。淡褐色固体，产率50％，ms(esi)m/z277.2[m+h]+.

14)2,5-二溴苯并[d]恶唑(m14)的合成

将原料2-氨基-5-溴苯并噁唑(229mg,1.0eq.)和溴化铜(335mg,1.5eq.)溶于乙腈中，0℃下滴加亚硝酸异戊酯(140mg,1.2eq.)的乙腈溶液，反应在0℃下保持1h，用tlc监测反应，反应完毕后加入水，析出固体，过滤干燥。白色固体，产率58％，ms(esi)m/z277.9[m+h]+.

15)5-溴-n-环戊基苯并[d]恶唑-2-胺(m15)的合成

将中间体m14(90mg,1.0eq.)和环戊胺(77mg,3.0eq.)溶于1,4二氧六环，80℃过夜反应，tlc监测反应，反应完后，减压浓缩反应液，粗产物通过快速制备液相色谱进一步纯化。白色固体，产率40％，ms(esi)m/z282.2[m+h]+.

16)5-溴-n-异丙基苯并[d]恶唑-2-胺(m16)的合成

参照中间化合物m15的合成方法。白色固体，产率52％,ms(esi)m/z256.1[m+h]+.

17)n-环戊基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧戊环-2-基)苯并[d]恶唑-2-胺(m17)合成

参照中间化合物m12的合成方法。白色固体，产率65％,ms(esi)m/z331.4[m+h]+.

18)n-异丙基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧戊环-2-基)苯并[d]恶唑-2-胺(m18)合成

参照中间化合物m12的合成方法。白色固体，产率65％,ms(esi)m/z305.4[m+h]+.

19)6-溴-n，n-二甲基苯并[d]噻唑-2-胺(m19)合成

将原料4-溴-2-碘苯甲胺(19.4g,1.0eq.)和福美钠(21g,2.0eq.)，在醋酸酮(12g,1.0eq.)和碳酸钾(18.4g,2.0eq.)的存在下，用n,n-二甲基甲酰胺作为溶剂，直接一锅法，120℃反应6h，tlc监测反应，反应结束后加水，用dcm萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，通过快速制备液相色谱进一步纯化。白色固体，产率49％，ms(esi)m/z257.0[m+h]+.

20)n，n-二甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3-二氧戊环-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺(m20)合成

参照中间化合物m12的合成方法。白色固体，产率52％,ms(esi)m/z307.4[m+h]+.

21)2-氯-4,6-双(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪(m21)合成

参考m2的合成，白色固体，产率76％，ms(esi)m/z441.0[m+h]+.这一步控制控制好相应胺的当量为2.0eq.。且反应过程中可能会直接析出固体，可直接抽滤出来，再通过快速制备液相色谱进一步纯化。

22)n2，n4-双(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-6-氯-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(m22)合成

参考m2的合成，白色固体，产率71％，ms(esi)m/z386.8[m+h]+.

23)1,1'-(((6-氯-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(哌嗪-4,1-二基))双(乙-1-酮)(m23)合成

参照中间化合物m2的合成，白色固体，产率82％，ms(esi)m/z368.8[m+h]+.

化合物i-1至i-46的合成

实施例1

1)5-(4-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-1)的合成：

将中间体m2(100mg,1.0eq.)和m12(91mg,1.0eq.)溶于乙二醇二甲醚，将碳酸钠(74.2mg,2.0eq.)作为碱用少量水溶解后加入反应瓶中，加入四(三苯基膦)钯(40.5mg,0.1eq.)作为催化剂，氩气保护，92℃反应24h。tlc监测反应，反应完后趁热过滤，过滤掉盐及金属催化剂，剩余反应液用dcm萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，通过快速制备液相色谱进一步纯化,白色固体109mg，产率68％,¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.16(d,j＝1.7hz,1h),8.08(dd,j＝8.3,1.7hz,1h),7.53(s,2h),7.39(d,j＝8.3hz,1h),4.02–3.66(m,12h),3.20(d,j＝6.0hz,4h),2.89(s,3h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso-d6)δ170.19,165.06,164.94,163.79,150.96,144.19,132.87,121.48,115.36,108.39,66.50,45.76,43.75,42.75,34.27ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc19h24n8o4s(m+h)+461.1714,found:461.1712.

实施例2

2)5-(4-(4-乙基哌嗪-1-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-2)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率82％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.13(d,j＝1.6hz,1h),8.06(dd,j＝8.4,1.7hz,1h),7.52(s,2h),7.37(d,j＝8.4hz,1h),3.79–3.64(m,12h),2.41–2.35(m,6h),1.03(t,j＝7.1hz,3h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h26n8o2(m+h)+411.2251,found:411.2247.

实施例3

3)5-(4-(4-异丙基哌嗪-1-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-3)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率67％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.14(d,j＝1.6hz,1h),8.06(dd,j＝8.4,1.7hz,1h),7.52(s,2h),7.38(d,j＝8.4hz,1h),3.86–3.65(m,12h),2.73-2.66(m,1h),2.51-2.47(m,4h),0.99(d,j＝6.5hz,6h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc21h28n8o2(m+h)⁺425.2408,found:425.2406.

实施例4

4)1-(4-(4-(2-氨基苯并[d]噁唑-5-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)乙基-1-酮(i-4)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率81％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.15(d,j＝1.6hz,1h),8.08(dd,j＝8.7,1.4hz,1h),7.55(s,2h),7.39(d,j＝8.4hz,1h),3.83–3.53(m,12h),3.53(s,4h),2.06(s,3h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso)δ170.07,168.90,165.05,165.01,163.79,150.93,144.20,132.95,121.45,115.35,108.37,66.50,45.89,43.75,43.36,21.79ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h24n8o3(m+h)⁺425.2044,found:425.2044.

实施例5

5)4-(4-(2-氨基苯并[d]噁唑-5-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(i-5)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率53％，¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.41(d,j＝1.6hz,1h),8.22(dd,j＝8.5,1.7hz,1h),7.31(d,j＝8.4hz,1h),5.41(s,2h),3.92-3.49(m,16h),1.50(s,9h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc23h30n8o4(m+h)⁺483.2463,found:483.2453.

实施例6

6)5-(4-吗啉代-6-(4-(三氟甲基)哌啶-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-6)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率62.5％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.14(d,j＝1.6hz,1h),8.07(dd,j＝8.4,1.7hz,1h),7.52(s,2h),7.38(d,j＝8.4hz,1h),4.92(d,j＝46.4hz,2h),3.82–3.65(m,8h),2.94(t,j＝12.9hz,2h),2.74–2.65(m,1h),1.92(d,j＝12.6hz,2h),1.45–1.33(m,2h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h22f3n7o2(m+h)⁺450.1860,found:450.1841.

实施例7

7)6-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-7)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率68％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.15(d,j＝1.6hz,1h),8.08(dd,j＝8.4,1.7hz,1h),7.55(s,2h),7.38(d,j＝8.4hz,1h),3.84-3.65(m,16h).¹³cnmr(126mhz,dmso)δ169.67,164.68,163.43,150.56,143.85,132.60,121.08,114.99,107.97,66.13,43.37ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc18h21n7o3(m+h)⁺384.1779,found:384.1767.

实施例8

8)5-(4-吗啉代-6-(((四氢-2h-吡喃-4-基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-8)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率85％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.13(dd,j＝5.1,1.6hz,1h),8.07-8.01(m,1h),7.51(s,2h),7.46(d,j＝7.7hz,1h),7.41–7.27(m,1h),4.16(dt,j＝7.7,3.9hz,1h),3.88–3.64(m,10h),3.47–3.38(m,2h),1.84(dd,j＝12.6,5.7hz,2h),1.58–1.48(m,2h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc19h23n7o3(m+h)+398.1935,found:398.1922.

实施例9

9)5-(4-吗啉代-6-((3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-9)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率51％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.03(s,1h),8.49(s,1h),8.19(d,j＝1.6hz,1h),8.11(dd,j＝8.3,1.7hz,1h),7.89(d,j＝8.3hz,1h),7.57(d,j＝6.3hz,3h),7.44(d,j＝8.4hz,1h),7.35(d,j＝7.8hz,1h),3.96–3.70(m,8h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc21h18f3n7o2(m+h)⁺458.1547,found:458.1540.

实施例10：

10)5-(4-(苯并[d][1,3]二噁唑-5-基氨基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-10)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率49％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.57(s,1h),8.16(s,1h),8.07(dd,j＝8.4,1.7hz,1h),7.55(s,2h),7.42(d,j＝8.4hz,1h),7.14(dd,j＝8.5,2.1hz,1h),6.88(d,j＝8.4hz,1h),6.00(s,2h),3.91–3.69(m,8h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso-d6)δ170.04,164.70,164.11,163.49,150.64,147.07,143.92,142.39,134.24,132.49,120.98,114.94,112.83,108.13,108.05,102.32,100.96,66.08,43.50ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc21h19n7o4(m+h)⁺434.1571,found:434.1564.

实施例11

11)5-(4-吗啉代-6-(哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺盐酸盐(i-11)的合成：

将实施例5的化合物置于反应瓶中，以二氯甲烷为溶剂，通入盐酸气，反应2h，减压蒸发多余溶剂，得白色固体，产率100％，¹hnmr(400mhz,d2o)δ8.08–8.04(m,1h),7.99–7.90(m,1h),7.49–7.42(m,1h),4.13(s,4h),3.85–3.77(m,8h),3.35–3.32(m,4h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc18h22n8o2(m+h)⁺383.1938,found:383.1935.

实施例12

12)4-(4-(2-(苄基氨基)苯并[d]恶唑-5-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(i-12)的合成：

将实施例5中的化合物(300mg,1.0eq.)用n,n-二甲基甲酰胺溶解后，在冰浴下加入nah(28mg,1.1eq.)反应2h，将溴苄(117mg,1.1eq.)用n,n-二甲基甲酰胺稀释后缓慢滴入反应瓶，室温反应3h，tlc监测反应，反应完后加水淬灭反应，并用大量水洗掉dmf，用dcm萃取3次，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，通过快速制备液相色谱进一步纯化。白色固体141mg，产率40％,¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.01(dd,j＝8.3,1.7hz,1h),7.73(d,j＝1.7hz,1h),7.43–7.40(m,2h),7.38–7.29(m,3h),7.22(d,j＝8.4hz,1h),6.94(s,1h),5.07(s,2h),3.78–3.64(m,12h),3.42–3.38(m,4h),1.43(s,9h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc30h36n8o4(m+h)⁺573.2932,found:573.2916.

实施例13

13)n-环戊基-5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-13)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率59％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.22(d,j＝1.6hz,1h),8.08–8.06(m,2h),7.39(d,j＝8.4hz,1h),4.05(d,j＝6.2hz,1h),3.88–3.65(m,16h),1.95(q,j＝5.1hz,2h),1.70(dq,j＝9.0,3.2,2.8hz,2h),1.59(dq,j＝13.2,5.1hz,4h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc23h29n7o3(m+h)⁺452.2405,found:452.2405.

实施例14

14)5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)-n-异丙基苯并[d]噁唑-2-胺(i-14)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率75％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.21(d,j＝1.6hz,1h),8.06(dd,j＝8.4,1.7hz,1h),7.98(d,j＝7.5hz,1h),7.38(d,j＝8.3hz,1h),3.90–3.65(m,16h),1.23(d,j＝6.5hz,6h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc21h27n7o3(m+h)⁺426.2248,found:426.2240.

实施例15

15)n-苄基-5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-15)的合成：

参照实施例12的合成，白色固体，产率55％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.01(dd,j＝8.3,1.7hz,1h),7.72(d,j＝1.7hz,1h),7.43–7.27(m,5h),7.22(d,j＝8.3hz,1h),6.90(s,1h),5.05(s,2h),3.78–3.64(m,16h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso)δ169.18,164.91,146.85,136.54,133.27,132.78,129.17,128.22,122.18,108.46,107.75,66.45,60.23,45.87,43.71ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc25h27n7o3(m+h)⁺474.2248,found:474.224.

实施例16

16)6-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)-n-(4-甲氧基苄基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-16)的合成：

参照实施例12的合成，白色固体，产率45％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ7.99(dd,j＝8.3,1.7hz,1h),7.74(d,j＝1.6hz,1h),7.36(d,j＝8.6hz,2h),7.20(d,j＝8.3hz,1h),6.95(s,1h),6.91(d,j＝8.6hz,2h),4.99(s,2h),3.72(s,3h),3.79–3.66(m,16h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso)δ168.84,164.54,158.87,146.44,132.87,132.29,129.31,128.08,121.62,114.11,107.89,107.29,66.06,55.14,44.90,43.33ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc26h29n7o4(m+h)⁺504.2354,found:504.2347.

实施例17

17)6-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)-n-(4-异丙基苄基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-17)的合成：

参照实施例12的合成，白色固体，产率50％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.01(dd,j＝8.3,1.6hz,1h),7.79(d,j＝1.6hz,1h),7.32(d,j＝7.8hz,2h),7.21(d,j＝8.2hz,3h),6.89(s,1h),5.02(s,2h),3.84-3.64(m,16h),2.89-2.80(m,1h),1.16(d,j＝6.9hz,6h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc28h33n7o3(m+h)⁺516.2718,found:516.2713.

实施例18

18)5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)-n-(4-硝基苄基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-18)的合成：

参照实施例12的合成，白色固体，产率48％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.25(d,j＝2.0hz,1h),8.23(d,j＝1.9hz,1h),8.04(dd,j＝8.4,1.6hz,1h),7.76(s,1h),7.66(d,j＝8.4hz,2h),7.26(d,j＝8.3hz,1h),7.00(s,1h),5.24(s,2h),3.78–3.63(m,16h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso-d6)δ169.19,164.91,147.43,146.93,144.68,133.20,132.87,129.17,124.30,122.37,108.54,107.35,66.45,45.20,43.71ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc25h26n8o5(m+h)⁺519.2099,found:519.2094.

实施例19

19)4-(((5-(4,6-4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-基)胺)甲基)苄腈(i-19)的合成：

参照实施例12的合成，白色固体，产率51％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.04(dd,j＝8.4,1.6hz,1h),7.86(d,j＝8.0hz,2h),7.72(d,j＝1.6hz,1h),7.58(d,j＝8.0hz,2h),7.25(d,j＝8.3hz,1h),7.01(s,1h),5.19(s,2h),3.81–3.63(m,16h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso-d6)δ169.20,164.92,146.91,142.55,133.20,133.11,132.86,128.93,122.35,119.10,110.89,108.54,107.41,66.46,49.06,45.42,43.72ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc26h26n8o3(m+h)⁺499.2201,found:499.2186.

实施例20

20)5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)-n-(4-(三氟甲基)苄基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-20)的合成：

参照实施例12的合成，白色固体，产率52％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.03(dd,j＝8.3,1.7hz,1h),7.74(d,j＝7.6hz,3h),7.61(d,j＝8.1hz,2h),7.24(d,j＝8.4hz,1h),6.96(s,1h),5.17(s,2h),3.77–3.63(m,16h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc26h26f3n7o3(m+h)⁺542.2122,found:542.2106.

实施例21

21)4-(((5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-基)氨基)甲基)苯甲酰胺(i-21)的合成：

参照实施例12的合成，白色固体，产率35％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.02–7.97(m,2h),7.86(d,j＝7.9hz,2h),7.68(s,1h),7.47(d,j＝7.9hz,2h),7.38(s,1h),7.22(d,j＝8.3hz,1h),6.93(s,1h),5.10(s,2h),3.76–3.63(m,16h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso)δ168.81,167.50,164.53,146.51,139.47,133.72,132.89,132.36,127.97,127.60,121.78,108.04,107.24,66.08,45.22,43.34ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc26h28n8o4(m+h)⁺517.2306,found:517.2301.

实施例22

22)4-(((5-(4,6-4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-基)胺)甲基)苯甲酸甲酯(i-22)的合成：

参照实施例12的合成，白色固体，产率62％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.01(dd,j＝8.3,1.7hz,1h),7.95(d,j＝8.2hz,2h),7.69(s,1h),7.54(d,j＝8.0hz,2h),7.23(d,j＝8.3hz,1h),6.95(s,1h),5.14(s,2h),3.84(s,3h),3.79–3.62(m,16h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso)δ169.18,166.38,164.90,146.89,142.23,133.26,132.77,130.05,129.39,128.39,122.22,108.46,107.50,66.44,52.62,45.57,43.70ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc27h29n7o5(m+h)⁺532.2303,found:532.2299.

实施例23

23)4-(((5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-基)氨基)甲基)苯甲酸(i-23)的合成：

将实施例22的化合物用无水四氢呋喃溶解，加入四氢铝锂，加入水，常温搅拌过夜，用稀盐酸调ph至弱酸性，析出白色固体，产率90％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.01(dd,j＝8.3,1.7hz,1h),7.93(d,j＝8.2hz,2h),7.66(d,j＝1.7hz,1h),7.50(d,j＝8.0hz,2h),7.23(d,j＝8.3hz,1h),5.15(s,2h),3.76–3.63(m,16h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso-d6)δ168.01,166.97,164.44,159.00,146.49,138.43,134.47,130.87,130.69,129.84,128.51,124.55,110.84,110.67,66.04,46.93,43.33ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc26h27n7o5(m+h)⁺518.2146,found:518.2146.

实施例24

24)5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)-n，n-二甲基苯并[d]噁唑-2-胺(i-24)的合成：

将实施例7的化合物(600mg,1.0eq.)溶于n,n-二甲基甲酰胺中，冰浴下，缓慢加入氢化钠(69mg,1.1eq.)反应2h后，将碘甲烷用n,n-二甲基甲酰胺稀释后于滴液漏斗中缓慢滴入反应瓶，随时用tlc板监测反应进程，反应完后，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取3次，减压浓缩反应液，粗产物通过快速制备液相色谱进一步纯化，得白色固体138mg，产率21％,¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.27(dd,j＝8.7,2.1hz,1h),8.21(d,j＝2.1hz,1h),7.22(d,j＝8.7hz,1h),3.94(s,3h),3.86–3.65(m,16h),3.29(s,3h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h25n7o3(m+h)⁺412.2092,found:412.2071.

实施例25

25)n-(5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-基)乙酰胺(i-25)的合成：

将实施例7的化合物(100mg,1.0eq.)溶于无水吡啶中，冰浴下，缓慢滴加乙酰氯(22.7mg,1.1eq.)反应，随时用tlc板监测反应进程，反应完后，加1n盐酸淬灭反应，用二氯甲烷萃取3次，减压浓缩反应液，粗产物通过快速制备液相色谱进一步纯化。得白色固体62mg，产率56％,¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.75(s,1h),8.51(d,j＝1.6hz,1h),8.33(dd,j＝8.5,1.7hz,1h),7.68(d,j＝8.5hz,1h),3.90–3.65(m,16h),2.24(s,3h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso-d6)δ169.56,165.05,156.45,150.38,134.01,124.40,118.28,110.03,66.51,43.80,24.40ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h23n7o4(m+h)⁺426.1884,found:426.1875.

实施例26

26)n-(5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-基)异丁酰胺(i-26)的合成：

参照实施例25的合成，白色固体，产率55％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.70(s,1h),8.50(d,j＝1.6hz,1h),8.33(dd,j＝8.6,1.7hz,1h),7.68(d,j＝8.5hz,1h),3.90–3.66(m,16h),2.84–2.79(m,1h),1.14(d,j＝6.8hz,6h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc22h27n7o4(m+h)⁺454.2197,found:454.2184.

实施例27

27)n-(5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-基)环己烷甲酰胺(i-27)的合成：

参照实施例25的合成，白色固体，产率53％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.66(s,1h),8.50(d,j＝1.7hz,1h),8.33(dd,j＝8.6,1.7hz,1h),7.67(d,j＝8.6hz,1h),3.90–3.66(m,16h),1.86(d,j＝12.5hz,2h),1.78–1.75(m,2h),1.65(d,j＝10.7hz,1h),1.45-1.34(m,2h),1.30–1.21(m,4h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc25h31n7o4(m+h)⁺494.251,found:494.2505.

实施例28

28)n-(5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-基)苯甲酰胺(i-28)的合成：

参照实施例25的合成，白色固体，产率58％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.18(s,1h),8.57(s,1h),8.38(d,j＝8.7hz,1h),8.03(d,j＝7.6hz,2h),7.75–7.65(m,2h),7.57(t,j＝7.6hz,2h),3.91–3.67(m,16h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc25h25n7o4(m+h)⁺488.2041,found:488.2041.

实施例29

29)n-(5-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]恶唑-2-基)乙磺酰胺(i-29)的合成：

将实施例7的化合物(100mg,1.0eq.)溶于二氯甲烷中，加入三乙胺(52.6mg,2.0eq.),冰浴下滴加乙基磺酰氯(40.2mg,1.2eq.),室温下过夜反应。tlc板监测反应进程，反应完后，水淬灭反应，用二氯甲烷萃取3次，减压浓缩反应液，粗产物通过快速制备液相色谱进一步纯化，得白色固体41mg，产率33％,¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ12.52(s,1h),8.28–8.25(m,2h),7.59(d,j＝8.7hz,1h),3.87–3.65(m,16h),3.17(q,j＝7.3hz,2h),1.27(t,j＝7.3hz,3h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h25n7o5s(m+h)⁺476.1711,found:476.1711.

实施例30

30)6-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺(i-30)的合成：

参照实施例7的合成，白色固体，产率35％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.67(d,j＝1.7hz,1h),8.24(dd,j＝8.4,1.8hz,1h),7.76(s,2h),7.36(d,j＝8.5hz,1h),3.86–3.65(m,16h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc18h21n7o2s(m+h)⁺400.155,found:400.1538.

实施例31

31)n-(6-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噻唑-2-基)乙酰胺(i-31)的合成：

参照实施例25的合成，白色固体，产率54％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ12.50(s,1h),8.99(d,j＝1.6hz,1h),8.42(dd,j＝8.6,1.7hz,1h),7.77(d,j＝8.5hz,1h),3.91–3.66(m,16h),2.23(s,3h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h23n7o3s(m+h)⁺442.1656,found:442.1655.

实施例32

32)6-(4,6-二吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)-n，n二甲基苯并[d]噻唑-2-胺(i-32)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率39％，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.66(d,j＝1.7hz,1h),8.38(dd,j＝8.5,1.7hz,1h),7.57(d,j＝8.5hz,1h),3.92–3.76(m,16h),3.24(s,6h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h25n7o2s(m+h)⁺428.1863,found:428.1858.

实施例33

33)4-(4-(2-氨基苯并[d]噻唑-6-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(i-33)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率38％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.67(d,j＝1.7hz,1h),8.24(dd,j＝8.5,1.8hz,1h),7.76(s,2h),7.36(d,j＝8.5hz,1h),3.94–3.65(m,12h),3.41(t,j＝5.3hz,4h),1.43(s,9h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc23h30n8o3s(m+h)⁺499.2234,found:499.2236.

实施例34

34)6-(4-吗啉代-6-(4-(三氟甲基)哌啶-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺(i-34)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率35％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.66(d,j＝1.6hz,1h),8.24(dd,j＝8.4,1.8hz,1h),7.76(s,2h),7.37(d,j＝8.5hz,1h),4.93(d,j＝87.8hz,2h),3.84–3.65(m,8h),2.92(t,j＝12.8hz,2h),2.69–2.62(m,1h),1.92(d,j＝12.6hz,2h),1.44-1.33(m,2h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h22f3n7os(m+h)⁺466.1631,found:466.1621.

实施例35

35)1-(4-(4-(2-氨基苯并[d]噻唑-6-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(i-35)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率45％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.67(d,j＝1.8hz,1h),8.25(dd,j＝8.5,1.8hz,1h),7.77(s,2h),7.37(d,j＝8.5hz,1h),3.88–3.65(m,12h),3.55–3.51(m,4h),2.06(s,3h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h24n8o2s(m+h)⁺441.1816,found:441.1811.

实施例36

36)6-(4-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺(i-36)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率32％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.68(d,j＝1.7hz,1h),8.25(dd,j＝8.5,1.8hz,1h),7.77(s,2h),7.37(d,j＝8.5hz,1h),4.02–3.65(m,12h),3.18(t,j＝5.1hz,4h),2.90(s,3h)ppm；¹³cnmr(126mhz,dmso-d6)δ169.42,168.76,164.66,164.55,155.98,131.08,129.27,126.09,121.19,117.02,66.13,45.38,43.37,42.35,33.91ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc19h24n8o3s2(m+h)⁺477.1486,found:477.1479.

实施例37

37)4-(4-(2-(二甲基氨基)苯并[d]噻唑-6-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(i-37)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率51％，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.66(d,j＝1.7hz,1h),8.38(dd,j＝8.5,1.7hz,1h),7.57(d,j＝8.5hz,1h),3.92-3.52(m,12h),3.51(t,j＝4.9hz,4h),3.24(s,6h),1.50(s,9h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc25h34n8o3s(m+h)⁺527.2547,found:527.2541.

实施例38

38)n，n-二甲基-6-(4-吗啉代-6-(哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺盐酸盐(i-38)的合成：

参照实施例11的合成，白色固体，产率100％，¹hnmr(400mhz,d2o)δ8.52–8.48(m,1h),8.30–8.26(m,1h),7.46(t,j＝8.6hz,1h),4.17(s,4h),3.89(s,4h),3.79(t,j＝4.7hz,4h),3.36–3.32(m,10h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h26n8os(m+h)⁺427.2023,found:427.2023.

实施例39

39)n，n-二甲基-6-(4-(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺(i-39)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率37％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.75(s,1h),8.30(d,j＝8.5hz,1h),7.48(d,j＝8.5hz,1h),4.03–3.65(m,12h),3.19(s,10h),2.89(s,3h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc21h28n8o3s2(m+h)⁺505.1799,found:505.1798.

实施例40

40)n，n-二甲基-6-(4-吗啉代-6-((3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺(i-40)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率47％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.00(s,1h),8.74(d,j＝1.8hz,1h),8.48(s,1h),8.32(dd,j＝8.5,1.8hz,1h),7.91(d,j＝9.2hz,1h),7.57(t,j＝8.0hz,1h),7.52(d,j＝8.5hz,1h),7.35(d,j＝7.7hz,1h),4.04–3.70(m,8h),3.20(s,6h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc23h22f3n7os(m+h)⁺502.1631,found:502.1626.

实施例41

41)n，n-二甲基-6-(4-吗啉代-6-(4-(三氟甲基)哌啶-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噻唑-2-胺(i-41)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率51％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.74(d,j＝1.7hz,1h),8.29(dd,j＝8.5,1.8hz,1h),7.48(d,j＝8.5hz,1h),5.05(s,1h),4.82(s,1h),3.86–3.65(m,8h),3.18(s,6h),2.92(t,j＝13.0hz,2h),2.68–2.65(m,1h),1.94–1.90(m,2h),1.44-1.33(m,2h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc22h26f3n7os(m+h)⁺494.1944,found:494.1933.

实施例42

42)6-(4,6-双(4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-胺(i-42)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率56％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.17(d,j＝1.7hz,1h),8.09(dd,j＝8.4,1.7hz,1h),7.55(s,2h),7.41(d,j＝8.4hz,1h),3.98(d,j＝42.8hz,8h),3.19(d,j＝5.3hz,8h),2.90(s,6h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc20h27n9o5s2(m+h)⁺538.1649,found:538.1645.

实施例43

43)6-(2-氨基苯并[d]噁唑-6-基)-n2，n4-双(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(i-43)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率53％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.66(s,2h),8.17(s,1h),8.07(d,j＝8.4hz,1h),7.57(s,3h),7.47(d,j＝8.4hz,2h),7.16(s,2h),6.88(s,2h),6.01(s,4h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc24h17n7o5(m+h)⁺484.1364,found:484.1363.

实施例44

44)1,1'-(((6-(2-氨基苯并[d]恶唑-6-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(哌嗪-4,1-二基))双(乙-1-酮)(i-44)的合成：

参照实施例1的合成，白色固体，产率60％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.16(d,j＝1.7hz,1h),8.08(dd,j＝8.4,1.7hz,1h),7.55(s,2h),7.40(d,j＝8.4hz,1h),4.02-3.52(m,16h),2.06(s,6h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc22h27n9o3(m+h)⁺466.2310,found:466.2304.

实施例45

45)甲基4-((((6-(4,6-双(4-乙酰基哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-基)氨基)甲基)苯甲酸酯(i-45)的合成：

参照实施例12的合成，白色固体，产率45％，¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.04–7.96(m,3h),7.69(s,1h),7.56(d,j＝7.9hz,2h),7.25(d,j＝8.3hz,1h),6.96(s,1h),5.15(s,2h),3.87-3.74(m,11h),3.52–3.50(m,8h),2.07(s,6h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc31h35n9o5(m+h)⁺614.2834,found:614.2829.

实施例46

46)4-((((6-(4,6-双(4-乙酰基哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯并[d]噁唑-2-基)氨基)甲基)苯甲酸(i-46)的合成：

参照实施例11的合成，白色固体，产率85％，¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.75(s,1h),8.30(d,j＝8.7hz,1h),7.99(d,j＝7.9hz,3h),7.70(d,j＝8.0hz,3h),5.64(s,2h),3.81-3.73(m,8h),3.53–3.50(m,8h),2.08(s,6h)ppm；hrms(esi)m/zcalcd.forc30h33n9o5(m+h)⁺600.2677,found:600.2677.

应用例生物学评价实验

(一)pi3kα激酶活性检测方法

1.测试原理

本实验中使用的pi3kα激酶活性测试方法采用adp-glo的方法，通过将脂质底物与重组酶和atp孵育来进行脂质激酶反应，并使用adp-glo^tm激酶测定法测量激酶活性。adp-glo^tm激酶测定分两个步骤进行：首先，在激酶反应之后，添加atp消耗试剂以终止脂质激酶反应并消耗任何剩余的atp，仅留下adp。其次，添加检测试剂以同时将adp转换为atp，并使用偶联的萤光素酶/萤光素反应将新合成的atp转换为荧光信号。

2.测试步骤

(1)化合物的配制

化合物用100％dmso溶解为10mm存储液，于氮气柜避光存放。以pi103作为阳性对照化合物。在pi3kα激酶上进行化合物的筛选，起始浓度为30μm，3倍稀释，10个浓度，复孔检测。

(2)反应过程

1)配制1×kinasebuffer。

2)化合物浓度梯度的配制：受试化合物测试浓度为30000nm起始，3倍稀释，10个浓度，复孔测试。在384孔板中梯度稀释成100倍终浓度的10个不同浓度的溶液。用echo转移50nl到384孔板的化合物孔；阴性对照孔和阳性对照孔中分别加50nl的dmso。

3)用1×kinasebuffer配制2倍终浓度的激酶溶液。

4)在化合物孔和阳性对照孔分别加2.5μl的2倍终浓度的激酶溶液；在阴性对照孔中加2.5μl的1×kinasebuffer。

5)1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育10分钟。

6)用1×kinasebuffer配制2倍终浓度的atp和底物p1p2的混合溶液。

7)加入2.5μl的2倍终浓度的atp和底物的混合溶液，起始反应。

8)将384孔板1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温反应60分钟。

9)加入5μladp-gloreagent，1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育180分钟。

10)加入10μlkinasedetectionreagent，1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育30分钟。

11)用envision酶标仪读取发光值rlu。

(3)数据分析

1)计算公式

inhibition％＝100-((rlu-mean(nc))/(mean(pc)-mean(nc)))×100

其中：rlu：样品的化学发光值；mean(nc)：阴性对照孔均值；mean(pc)：阳性对照孔比值均值。

2)拟合量效曲线

以浓度的log值作为x轴，百分比抑制率为y轴，采用分析软件graphpadprism5的log(inhibitor)vs.response-variableslope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活性的ic50值。

公式如下：y＝bottom+(top-bottom)/(1+10^((logic50-x)*hillslope))

测得的ic50值如下表1，从实验结果可以看出，本发明实例化合物对pi3kα激酶活性具有很强的抑制活性。

表1本申请化合物对pi3kα激酶活性的ic50测量值

(二)对i类pi3k四个亚型的选择性测试

选择pi3kα激酶活性最好的实施例化合物进行pi3k(p110δ/p85α)、pi3k(p110β/p85α)和pi3k(p120γ)激酶的ic50值检测，测试发明中的化合物是否为pi3kα选择性抑制剂。试验以pi103作为阳性对照化合物。试验方法与步骤与(1)中相同，只是在pi3k(p110δ/p85α)，pi3k(p110β/p85α)和pi3k(p120γ)激酶上进行化合物的筛选，起始浓度为10μm，3倍稀释，10个浓度，单孔检测。

测得的ic50值如下表2，从实验结果可以看出，本发明实例化合物对pi3kα激酶活性具有较好的选择性。

表2本申请化合物对pi3k四个亚型激酶活性的ic50测量值

(三)对多种癌细胞增殖抑制作用测定

化合物对人胃癌(mgc-803)细胞系、前列腺癌(pc3)细胞系、乳腺癌(mcf-7)细胞系、三阴性乳腺癌(mda-mb-231)细胞系、肝癌(hepg2)细胞系、卵巢癌(skov-3)细胞系、多发性骨髓瘤(rpmi8226)细胞系、人慢性髓系白血病(k562)细胞系、人神经胶质瘤(u251)细胞系和人急性淋巴母细胞白血病(molt-4)细胞系等10种癌细胞增殖抑制作用通过以下的方法进行测试。

1.测试原理

此实验使用cellcountingkit-8(cck8)法测试化合物对多种癌细胞增殖抑制作用。利用wst-8快速检测细胞增殖/毒性试验。wst是一种四唑盐，在电子载体的存在下，被活细胞内的脱氢酶还原生成水溶性的橙黄色formazan。通过比色法检测formazan生成量反映实验中活细胞数。

2.测试步骤

(1)种板：将对数生长期细胞以1×10⁵cells/孔接种于96孔板，置于37℃，5％co2条件下培养，直至细胞90％融合后，用无血清的dmem培养基或rpmi-1640培养基或f12k培养基等相应细胞培养基培养孵育2h使细胞同步化。

(2)加药：向培养板加入梯度稀释的不同浓度的待测化合物溶液100μl，将培养板在37℃，5％co2培养箱条件下孵育72小时；

(3)cck8检测：孵育结束后，每孔加入10μlcck8溶液，37℃培养箱放置4小时后，于酶标仪检测od450下的个孔的od值，计算细胞增值抑制率。抑制率＝(对照组od值－实验组od值)/对照组od值×100％；

(4)得出数据后，graphpadprism6拟合得出ic50。

本发明中的实施例7化合物对多种癌症细胞增殖活性的试验进行测定，测得的ic50值见表3。结果可以看出化合物能够有效抑制多种癌细胞的生长，ic50值都在0.43-1.33μm。其中对血液瘤抑制效果更好，人慢性髓系白血病细胞系k562的抑制能达到0.429μm，多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226的抑制达到0.537μm，人急性淋巴母细胞白血病molt-4的抑制达到0.606μm，对实体瘤也有较好抑制效果，胃癌细胞系mgc-803的抑制能达到1.089μm。

表3实施例7化合物对多种癌细胞增殖活性抑制ic50

(四)化合物急性毒性测定

进行实施例化合物7的急性毒性试验，以制定安全用药范围。预实验显示受试药物有一定毒性，在预实验中药物灌胃800mg/kg剂量可引起4/4只小鼠死亡，在灌胃350mg/kg剂量下0/4只小鼠死亡。所以在预实验的基础上，试验使用icr雌性小鼠，设置720，648，583.2，524.9，472.4，425.2，382.6七个剂量浓度以及生理盐水对照组，每个剂量组10只小鼠，以灌胃的方式给药1次，记录各组小鼠中毒症状及死亡情况，并对死亡动物进行尸检，观察期为14天。具体情况见表4。

结果显示，化合物7对小鼠有一定毒性，较高剂量下给药后会引起小鼠死亡。灌胃给药的ld50值为496.9116(474.5824～520.2914)mg/kg。对死亡小鼠进行尸检，选择最低剂量382.6mg/kg和最高剂量720mg/kg剂量组的小鼠对心、肝、脾、肺、肾器官进行he染色，结果显示药物对器官无明显毒性。

表4实施例7化合物的急性毒性试验数据

回归方程为：y＝-15.7287+7.6879x；(r＝0.9977)

a＝0.01时，查得的r为：0.8740

(其中y为概率单位加5后的值，x为剂量的对数logx)

所以ld50＝496.9116mg/kg

置信系数a＝0.05时的置信区间为：474.5824≤ld50≤520.2914,0.0200

(五)化合物药代动力学测定

进行实施例7的各项药代动力学特征测试，本试验共使用6只sd大鼠，将它们分为两组，分别尾静脉注射(1mg/kg)和灌胃(10mg/kg)给予实施例7，在给药前后11个时间点，静脉注射组于给药后2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h；灌胃组于给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h自眼眶后静脉丛采集血样约0.25ml。采用lc-ms/ms法测定sd大鼠血浆样本中化合物的浓度，用winnolin软件计算药代动力学参数。结果见表5。

结果显示，sd大鼠单次静脉注射1mg/kg实施例7和灌胃给予10mg/kg后，静脉注射给药主要药代动力学参数为：半衰期(t1/2)为6.29h，达峰时间(tmax)为0.033h，最大血药浓度(cmax)为454.7ng/ml,曲线下面积(auc0-∞)为2922.4hr*ng/ml，清除率(cl)为342.9ml/hr/kg，平均驻留时间(mrt0-∞)为8.53h。灌胃给药主要药代动力学参数为：半衰期(t1/2)为3.89h，达峰时间(tmax)为9.33h，最大血药浓度(cmax)为2256.7ng/ml,曲线下面积(auc0-∞)为38114.3hr*ng/ml，平均驻留时间(mrt0-∞)为9.50h。最重要的是化合物实施例7的口服生物利用度f为130.42％。其中口服生物利用度f超出100％，是因为口服给药剂量是静脉给药剂量的10倍，由此导致口服给药的血药浓度高于静脉给药，当血药浓度较高时，机体对药物的清除会达到饱和，即出现非线性pk，在此情况下会导致f>100％。药代数据表明化合物实施例7在sd大鼠体内具有良好的药代特征，代谢较好，有较好的吸收和暴露量，生物利用度较高。

表5实施例7化合物的药代动力学参数

(六)化合物体内抗胃癌活性测定

1.试验耗材

(1)实验动物

来源、种系、品系：spf级balb/c裸小鼠，由常州卡文斯实验动物有限公司提供。实验动物生产许可证：scxk(苏)2016-0010；实验动物使用许可证：syxk(苏)2017-0040。日龄：采购时4-6周，开始给药时6-8周。体重：采购时体重16-18g，开始给药时体重为18-20g。性别：雄性。每组动物数：5只。

(2)细胞株

人胃癌细胞mgc-803由中国科学院上海细胞所提供，于含10％胎牛血清的df12培养基中培养。

(3)受试药物

化合物i7、阳性药紫杉醇。

2.试验方法

(1)药物配置

阳性药紫杉醇(10mg/kg)：称取约2mg阳性对照化合物粉末溶于2ml生理盐水，配成浓度为1mg/ml药物，腹腔注射给药，给药体积为0.2ml/20g体重，每三天给药一次。化合物i7(30mg/kg)：称取约6mg待测试化合物粉末溶于2ml生理盐水，配成浓度为3mg/ml药物，口服灌胃给药，给药体积为0.2ml/20g体重，每天一次。i7(30mg/kg)+阳性药紫杉醇(10mg/kg)联合用药：i7(3mg/ml药物)，口服灌胃给药，给药体积为0.2ml/20g体重，每天一次。阳性药紫杉醇(1mg/ml药物)，腹腔注射给药，给药体积为0.2ml/20g体重，每三天给药一次。

(2)试验方法

人胃癌细胞mgc-803异种移植瘤模型，由人胃癌细胞mgc-803接种于裸鼠腋下皮下而建立。取对数生长期的mgc-803细胞，在无菌条件下，接种于28只balb/c裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5×10⁶个/只。用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至85mm³左右时挑选生长状态良好且肿瘤大小均一性好的荷瘤裸鼠20只，随机分成4组，每组5只，分别为阴性空白组、阳性药紫杉醇对照组、化合物i7给药组和化合物i7+阳性药物紫杉醇联合用药组。阳性药紫杉醇(10mg/kg)，腹腔注射，每三天一次，共7次；化合物i7(30mg/kg)每天口服灌胃给药一次，即1天给药一次，共22天；联合用药组化合物i7(30mg/kg)+阳性药紫杉醇(10mg/kg)，i7口服灌胃给药一次，即1天给药一次，共给药21天，阳性药紫杉醇(10mg/kg)(腹腔注射，每三天一次)共7次；同时隔天测量并记录裸鼠肿瘤体积及动物体重，并随时记录老鼠死亡率。第22天时处死小鼠，手术剥取瘤块称重，液氮罐保存肿瘤组织，计算抑瘤率(％)。

(3)实验结果

实验结果如图1所示，当给药第9天时，空白组小鼠肿瘤生长良好，给药组、阳性药组和联合用药组的小鼠肿瘤与其相比有明显减小。当给药22天后，与空白组相比，i7给药组、阳性药组和联合用药组对人胃癌细胞mgc-803裸鼠移植瘤的肿瘤生长抑制率分别为41.5％、60.3％、63.9％，相对肿瘤增殖率t/c(％)分别为53.2％、39.6％和30.2％。药物给药期间，无小鼠死亡，且各个给药组的小鼠都正常生长，如图2，小鼠的体重和对照组的小鼠没有明显差异。

总的来说，化合物i7在30mg/kg的给药浓度下能够有效抑制胃癌肿瘤的生长，并且化合物i7与传统胃癌患者常用药物紫杉醇的联合用药能够在体内起到协同作用，肿瘤抑制率达到63.9％。同时，小鼠在给药期间无死亡，正常生长，体重并没有明显下降，说明药物在治疗剂量下的毒性是可接受的。