猫杯状病毒反向遗传平台及其构建方法

1.本技术属于分子生物学领域和兽医领域，具体地，本技术提供了一种猫杯状病毒反向遗传平台及其构建方法。


背景技术：

2.猫杯状病毒(feline calicivirus,fcv)曾属于小rna病毒科杯状病毒属，1981年国际病毒分类委员(ictv)将其单独列为杯状病毒科。目前，杯状病毒科由札幌病毒属、兔病毒属、水疱疹病毒属、纽伯病毒属以及诺如病毒属5个属构成。fcv于1957年被首次分离，主要感染家猫，也可以感染狮、虎、豹等猫科动物，对猫科动物的健康造成一定威胁。 fcv在1998年前以一种非致病性的形式存多年，死亡率偏低。1998年至今，fcv导致的具有极高死亡率的恶性全身性系统疾病在意大利，法国和德国等国家被相继报道，此类毒株被命名为fcv vsd株。fcv vsd株感染主要引起皮下水肿、口腔溃疡、跛行、耳廓、足垫等皮肤不同程度的溃烂等临床症状，死亡率较高。2009年martino等从患有肠炎的犬粪便中分离到fcv，进一步证实fcv具有跨物种传播的风险。
3.rna病毒的反向遗传学研究的核心是构建病毒的感染性克隆，即病毒的人工构建。不同病毒遗传物质的性质和病毒基因组转化为病毒mrna的途径是不同的，通常病毒反向遗传平台构建常以此选择复制机制以及表达策略。目前fcv反向遗传平台研究中，都是根据fcv单一的限制性核酸酶酶切识别位点进行全基因组克隆，然而传统的pcr克隆耗时耗费力，过程相对复杂。


技术实现要素：

4.针对以上问题，申请人对pbluescript ii sk(+)进行修饰，在基因组5’末端和3’末端分别引入t7 rna聚合酶启动子、fcv(dl19)株5’utr、fcv(dl19)株3
′
utr、 poly(a)尾以及丁型肝炎病毒核酶(hdvrz)序列。构建了表达绿色荧光蛋白重组质粒，将重组质粒转染bhk
‑
t7细胞系中，发现绿色荧光蛋白可良好表达。以分离到的国内流行株fcv(dl19)株为研究对象，将其基因组分为4段克隆，利用融合pcr将其全基因组融合为2段后依次克隆到改造好的pbluescript ii sk(+)质粒上，并在4505bp处引入遗传标记位点，构建fcv(dl19)株全长cdna重组质粒。测序显示，重组质粒构建成功。为下一步fcv拯救及基因组结构、新型疫苗、rna病毒载体等方面研究奠定基础。
5.一方面，本技术提供了一种猫杯状病毒反向遗传平台的制备方法，其特征在于，包括将猫杯状病毒全基因组连接到改造后的pbluescript ii sk(+)载体上。
6.进一步地，所述改造后的pbluescript ii sk(+)载体在5’末端和3’末端引入t7 rna 聚合酶启动子、猫杯状病毒5’utr、猫杯状病毒3
′
utr、poly a尾以及丁型肝炎核酶序列。
7.进一步地，所述猫杯状病毒全基因组为猫杯状病毒dl19株的全基因组。
8.进一步地，所述制备方法还包括使用核酸序列为seq id no.1
‑
8的四对引物扩增
全基因组cdna；并对相应扩增产物进行融合pcr的步骤。
9.进一步地，所述制备方法包括还包括将融合pcr获得的插入片段无缝克隆连接至改造后的pbluescript ii sk(+)载体上的步骤。
10.进一步地，将融合pcr获得的插入片段无缝克隆连接至改造后的pbluescript ii sk(+) 载体上后获得的猫杯状病毒感染性克隆序列为seq id no.9。
11.另一方面，本技术还提供了按照上述方法制备的猫杯状病毒反向遗传平台，其为猫杯状病毒感染性克隆。
12.进一步地，所述猫杯状病毒感染性克隆序列为seq id no.9。
13.另一方面，本技术还提供了上述猫杯状病毒反向遗传平台在猫杯状病毒拯救、基因组结构、疫苗、病毒载体研究方面的应用。
14.本技术中的方法中所用的pcr试剂不局限于本技术中记载过的种类，本领域技术人员可以根据《分子克隆》等工具书自行配置或者购买市售产品。
15.本技术的猫杯状病毒反向遗传平台可用于以已知方法进行病毒拯救、基因组结构、疫苗、病毒载体研究，可也用于反向遗传平台其他的已知和研究中的应用。
附图说明
16.图1为fcv(dl19)株全长感染性克隆构建策略；
17.图2为egfp重组载体转染结果(a:转染组；b:对照组)；
18.图3为fcv(dl19)全长rt
‑
pcr结果电泳图(m:dl
‑
5000dna相对分子质量标准； 1:m:dl
‑
5000dna marker；1:g1(2.5kb)；2:g2(2kb)；g3(1.6kb)；g4(1.5kb)m:dl
‑
5000 dna marker；1:g1(2.5kb)；2:g2(2kb)；g3(1.6kb)；g4(1.5kb))；
19.图4为fcv(dl19)in
‑
fusion pcr结果电泳图(m:dl
‑
5000dna相对分子质量标准； 1:g1；2:g2)。
具体实施方式
20.材料和试剂
21.毒株、载体与质粒：
22.质粒pbluescript ii sk(+)和f81细胞由本实验室保存。
23.主要试剂、耗材及仪器：
24.试剂：xholⅰ、ecorⅰ限制性核酸内切酶为neb产品，购自北京宝林科生物科技有限公司。
25.实施例1序列分析及引物的设计
26.根据fcv(dl19)株序列，使用dna man和dna star进行引物设计，利用在线生物学软件novopro(https://www.novopro.cn/tools/rest_summary.html)对fcv(dl19株)序列中限制性酶切位点进行分析，选取4505处xholⅰ酶切位点，进行同源臂引物设计。引物由北京华大生物科技有限公司合成，引物序列如表1所示。
27.表1 fcv基因组引物序列
[0028][0029][0030]
实施例2病毒总rna的提取及cdna的获取
[0031]
病毒总rna的提取按照trizol reagent说明书进行，具体步骤如下：
[0032]
1)将存于
‑
80℃冰箱的样品取出，待样品完全融化恢复至室温；
[0033]
2)按照200μl氯仿/ml trizol加入氯仿，旋涡震荡15s使样品充分混匀，在室温条件下静置3min；
[0034]
3)4℃，12,000rpm离心15min后，样品分为三层，缓慢的吸取最上层含有rna的水相 (大约450μl)置于新的1.5ml ep管内，1：1加入预冷的异丙醇，将液体温和混匀后在冰上放置10min；
[0035]
5)取出混匀的液体在4℃12,000rpm的条件下离心10min，弃去上清后，可在ep管壁和管底发现凝胶沉淀；
[0036]
6)沿ep管壁加入1ml 75％酒精(depc水配制)，下上轻轻颠倒，弃上清液；
[0037]
7)4℃12,000rpm离心5min，用移液器尽量吸弃管底液体(勿触及沉淀)，开盖室温干燥 5min；
[0038]
8)每个样品加入50μl的depc水，充分混匀；
[0039]
取参考tiangen反转录试剂盒说明书，以获得rna为模板进行反转录，20μl反转录反应体系及程序如下：
[0040]5×
fastking
‑
rt supermix
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4μl
[0041]
rna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2μl
[0042]
rnase
‑
free ddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14μl
[0043]
反转录程序：42℃，15min，95℃，3min。cdna置于
‑
20℃保存备用。
[0044]
实施例3表达egfp重组载体构建
[0045]
为了进一步验证pbluescript ii sk(+)修饰后载体系统是否可用，在pbluescript ii sk (+)修饰载体fcv 5’utr后插入egfp全基因组，构建表达egfp重组载体，进行拯救系统微基因组系统验证。
[0046]
表达egfp重组载体转染：
[0047]
将bhk
‑
t7接种6孔细胞板，待细胞铺满孔底80％左右时，使用lipofectamine 2000 转染构建好的pbluescript ii sk(+)
‑
egfp，转染后48h在荧光显微镜下观察egfp基因表达情况。
[0048]
使用lipofectamine 2000转染构建好的pbluescript ii sk(+)
‑
egfp，转染后48h，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况，如图2所示，绿色荧光蛋白报告基因表达良好。
[0049]
实施例4 pbluescript ii sk(+)
‑
g1g2的构建
[0050]
fcv感染性克隆构建策略：
[0051]
将fcv(dl19)株全基因组分为g1、g2连接到改造后的pbluescript ii sk(+)载体上。构建策略如图1所示：
[0052]
pbluescript ii sk(+)
‑
g1g2的构建：
[0053]
fcv(dl19)株p1～p4片段的获得：
[0054]
用表1中4对引物扩增出fcv(dl19)株相应目的片段，50μl反应体系如下：
[0055][0056]
pcr反应程序：95℃，3min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，5 min。
[0057]
分别扩增的g1、g2、g3和g4片段，经过1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示，扩出大小为2.5kb、2kb、1.6kb、1.5kb的目的片段，片段大小符合预期，如图3所示。
[0058]
fcv(dl19株)基因组pcr产物的回收和纯化：
[0059]
操作步骤参考axygen通用型dna胶回收试剂盒说明书。
[0060]
in
‑
fusion pcr：
[0061]
通过以上反应分别获得fcv(dl19株)基因组的g1～g4片段，分别以g1、g2和g3、 g4片段为模板，进行融合pcr，扩增片段g1和g2。50μl反应体系如下：
[0062][0063]
g1、g2、g3和g4 4个片段进行胶回收，经in
‑
fusion pcr获得g1、g2片段，如图 4
‑
3所示。
[0064]
pbluescript ii sk(+)酶切及胶回收纯化
[0065]
将改造后的质粒按照neb xholⅰ酶说明书进行酶切，50μl酶切体系如下：
[0066]
pbluescript ii sk(+)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1ug
[0067]
xhol
ⅰꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μl
[0068]
rnase
‑
free ddh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
up to 50μl
[0069]
酶切程序：37℃，2h；65℃，20min。
[0070]
胶回收纯化按dna小量凝胶回收试剂盒说明进行，。胶回收产物分别命名为fcv (dl19)株
‑
g1和fcv(dl19)株
‑
g2。
[0071]
pbluescript ii sk(+)
‑
g1的构建：
[0072]
按照clonexpress ultra one step cloning kit说明书将fcv(dl19)株
‑
g1片段无缝克隆连接到酶切胶回收的pbluescript ii sk(+)载体上。20μl无缝克隆体系反应体系如下：
[0073][0074]
使用移液器缓慢吸打混匀，短暂离心后置于pcr仪进行后续反应。反应程序：50℃，15min；结束后立即取出，并置于冰上冷却。
[0075]
重组产物的转化，操作过程参考clonexpress ultra one step cloning kit说明书。提取单菌落，进行菌液pcr鉴定。25μl菌液pcr反应体系及反应程序如下：
[0076][0077]
菌液pcr反应程序：95℃，3min；95℃，15s，60℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
[0078]
将菌液pcr鉴定阳性的菌液送至金唯智生物科技(北京)有限公司进行测序鉴定，
测序结果正确的质粒命名pbluescript ii sk(+)
‑
g1。
[0079]
将测序正确的质粒进行质粒提取，操作步骤参照tiangen天根无内毒素质粒大提试剂盒说明书进行。
[0080]
pbluescript ii sk(+)
‑
g1g2的构建：
[0081]
pbluescript ii sk(+)
‑
g1经xholⅰ酶切后胶回收，将fcv(dl19)株
‑
g2片段以无缝克隆方式连接到pbluescript ii sk(+)
‑
g1，进行转化。无缝克隆反应体系、条件及操作步骤同上。
[0082]
将fcv(dl19)株基因组分为g1和g2 2个片段利用无缝克隆的方法连接到修饰好的pbluescript ii sk(+)载体上，经pcr鉴定及测序，结果显示pbluescript ii sk(+)
‑
g1g2 的构建成功。
[0083]
结论：
[0084]
本技术的研究首先对pbluescript ii sk(+)进行修饰改造，在基因组5’末端和3’末端分别引入t7 rna聚合酶启动子、fcv(dl19)株5’utr、fcv(dl19)株3’utr、poly(a)尾以及丁型肝炎核酶(hdvrz)序列。为了验证改造后的载体是否可正常发挥作用，采用无缝克隆的方法构建了表达egfp重组载体，将重组载体转染bhk
‑
t7细胞系，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白报告基因表达良好，经微基因组系统验证该拯救系统有效。
[0085]
赵艳丽、李伍新、左智敏等在构建fcv反向遗传平台研究中，都是根据fcv单一的限制性核酸酶酶切识别位点进行全基因组克隆，然而传统的pcr克隆耗时耗费力，过程相对复杂。本实验采用了无缝克隆技术，简化了载体的构建过程，快速、高效获得构建重组质粒。本章研究将fcv(dl19)株基因组分为两段连接到改造好的pbluescript ii sk (+)载体，构建了fcv(dl19)株全长感染性克隆质粒，为后续病毒拯救、基因组结构研究奠定基础。