一种毕赤酵母高效转化感受态细胞的制备方法和转化方法与流程

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种毕赤酵母高效转化感受态细胞的制备方法和转化方法。
背景技术：
：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以pichia酵母表达系统最为人熟知，广泛应用于外源蛋白的表达。毕赤酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体ppicz在多克隆位点(mcr)3′端带有his-tag和c-mycepitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在mcr5′端引入了alphafactor(α-factor)用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。进行克隆时，选择ecori，只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即完成。另外ppicz系列选用zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇，同时甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的iptg便宜。pichia酵母表达系统的步骤包括：第一步，构建载体；第二步，将dna转化入pichia酵母中；第三步，挑克隆筛选；第四步，表达；第五步，发酵和产物纯化。感受态细胞的制备和转化是分子生物学研究的基础实验，可用于基因克隆以及文库构建等研究领域。现有技术中，毕赤酵母感受态不佳时，在转化dna量较少且长度较长的质粒dna，或转化连接产物中存在较高含量的杂质时，转化会失败，如何提供一种较佳状态的毕赤酵母感受态细胞，避免转化失败，是本领域人员关注的重点方向。技术实现要素：鉴于上述问题，提出了本发明以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种毕赤酵母感受态细胞的制备方法。本发明实施例提供一种毕赤酵母感受态细胞的制备方法，所述方法包括：接种毕赤酵母进行第一培养，后转接进行第二培养，得到第一菌液；将所述第一菌液进行第三培养，得到第二菌液；将所述第二菌液依次用细胞渗透压保护液、细胞膜透性增强液、细胞稳定液和细胞dna保护液进行重悬活化，得到感受态细胞。可选的，所述细胞渗透压保护液的ph范围为7.5-9.0，包括缓冲液、透性化试剂、dna保护剂和山梨醇溶液，所述细胞渗透压保护液中所述缓冲液、所述二甲基亚砜和所述dna保护剂的摩尔比例为10-20∶1-1.5∶10-20；所述细胞膜透性增强液的ph范围为7.5-9.0，包括所述缓冲液、醋酸锂、所述dna保护剂和所述山梨醇溶液，所述细胞膜透性增强液中所述缓冲液、所述醋酸锂和所述dna保护剂的摩尔比例为10-20∶50-100∶10-20；细胞稳定液包括山梨醇溶液和/或无菌水。可选的，所述山梨醇溶液为0.8-1.4mol/l，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷，其浓度为8-12mmol/l；所述二甲基亚砜的质量浓度分数为3-5％；所述dna保护剂包括二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦，所述dna保护剂的浓度为8-12mmol/l；醋酸锂的浓度为75-85mmol/l；细胞dna保护液包括鲑鱼精dna和所述山梨醇溶液，所述鲑鱼精dna的浓度为8-12mg/ml。可选的，所述透性化试剂包括异丙醇、甘油、乙二醇、丙二醇、甘露醇、乙酰胺和二甲基亚砜中任意一种。可选的，所述第二菌液在冰浴环境中进行所述重悬活化，在温度为-80℃中进行所述定量保存。一种毕赤酵母感受态细胞，所述感受态细胞的活性度为85％-95％。所述感受态细胞的活性度为85％-95％，具有极高的转化效率，用质粒(浓度为5ug/u1)转化，可以得到2×103个转化子；pcr鉴定成功率达到90％以上。一种共表达毕赤酵母工程菌株在中在质粒dna量为10ug-15ug，且质粒dna长度为2100bp-2400bp，质粒dna的质量分数为0.1％-0.2％时的应用。一种所述的感受态细胞的转化方法，包括：将含目标基因的质粒转化进入所述感受态细胞进行扩增，获得扩增后毕赤酵母；从所述扩增后毕赤酵母提取质粒，后定点突变，得到突变质粒；将所述突变质粒与辅助质粒共转化到所述感受态细胞中；加入透性化试剂对突变质粒的表达进行优化，并鉴定表达量。可选的，所述转化的方式为电转化，取吸光值吸光值od600为0.9-1.4的所述第二菌液得到的所述感受态细胞60～100μl，与10～20μg所述突变质粒混匀后，选用电压为1.4～2.3kv，转化时间为3～5ms。一种共表达毕赤酵母工程菌株在表达具有生物活性的功能蛋白；表达医用产品牛胰蛋白酶原或乙型肝炎病毒前s1蛋白或人白介素-2中的应用。本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：本发明实施例中依次使用细胞渗透压保护液、细胞膜透性增强液、细胞稳定液和细胞dna保护液进行重悬活化，可以保护毕赤酵母细胞的活性，同时维持细胞内细胞液的活性流动，提高感受态细胞膜通的通透性，减少对酵母本身细胞产生损害；同时保护要转化的dna，因为外源基因被转入真核生物的时候，会被识别并被降解，加入细胞dna保护液，而使外源要转化的dna得以被保护，进而转化，从而提升转化效率。改变的细胞膜的通透性，促进感受态的形成使细胞易于吸收外界dna；同时使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态，便于能够摄取外源性dna，形成转化子，可以获得状态较佳的感受态细胞，该状态下，在转化dna量较少且长度较长的质粒dna，或转化连接产物中存在较高含量的杂质时，转化表达效果佳。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是表达载体为ppic9k的图谱；图2是毕赤酵母转化平板对比图；图3是常规方法制备的感受态转化后pcr鉴定结果图；图4是本发明的实施例感受态转化后pcr鉴定结果图；图5是本发明的实施例不同电场强度对电转化影响的效果图；图6是本发明的实施例不同溶液制备感受态细胞转化效果图；图7是本发明的实施例不同透性化试剂对毕赤酵母进行处理后的培养效果图；图8是本发明的实施例6不同质粒dna进行转化培养图；图9为本发明的实施例6c组转化后蛋白的sds-page图。具体实施方式下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：根据本发明一种典型的实施方式，一种毕赤酵母感受态细胞的制备方法，所述方法包括：接种毕赤酵母进行第一培养，后转接进行第二培养，得到第一菌液；将所述第一菌液进行第三培养，得到第二菌液；将所述第二菌液依次用细胞渗透压保护液、细胞膜透性增强液、细胞稳定液和细胞dna保护液进行重悬活化，得到感受态细胞。接种毕赤酵母、培养，后在吸光值od600为1.4-1.7时转接培养，得到转接培养后菌液；培养板不易超过两周，挑取大的圆的单菌落，挑菌以少为易，转接前测定种子od600值，但前提是要保证种子生长时间约24h。保证菌株的活性和可繁殖性，选择吸光值od600为1.4-1.7的原因是在600nm下，形状规则的(近似球球形)微生物菌浓(干重)和吸光度有线性关系，酵母菌可以看成近似的球形，因此需要用od600来检测其菌体浓度。将所述转接培养后菌液培养14-18h，在吸光值od600＝0.9-1.4时收菌、后分装，得到分装后菌液；转接培养的原因是使毕赤酵母生长保持在对数生长期，此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌已适应了培养基环境，细菌活力旺盛，开始高速生长繁殖，活菌数以稳定的几何级数极快增长。细胞dna保护液可以进行预冷，原因是以最大限度保证细胞活性和转化效率。作为一种可选的实施方式，所述细胞渗透压保护液的ph范围为7.5-9.0，包括缓冲液、透性化试剂、dna保护剂和山梨醇溶液，所述细胞渗透压保护液中所述缓冲液、所述二甲基亚砜和所述dna保护剂的摩尔比例为10-20∶1-1.5∶10-20；所述细胞膜透性增强液的ph范围为7.5-9.0，包括所述缓冲液、醋酸锂、所述dna保护剂和所述山梨醇溶液，所述细胞膜透性增强液中所述缓冲液、所述醋酸锂和所述dna保护剂的摩尔比例为10-20∶50-100∶10-20；细胞稳定液包括山梨醇溶液和/或无菌水。作为一种可选的实施方式，所述山梨醇溶液为0.8-1.4mol/l，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷，其浓度为8-12mmol/l；所述二甲基亚砜的质量浓度分数为3-5％；所述dna保护剂包括二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦，所述dna保护剂的浓度为8-12mmol/l；醋酸锂的浓度为75-85mmol/l；细胞dna保护液包括鲑鱼精dna和所述山梨醇溶液，所述鲑鱼精dna的浓度为8-12mg/ml。利用碱性的li+可以改变细胞膜的通透性，促进感受态的形成使细胞易于吸收外界dna。liac可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态，便于能够摄取外源性dna，形成转化子。但是过高浓度liac会改变酵母细胞膜结构，并对酵母本身细胞产生损害。因此需要选择合适的liac添加浓度，保证在不损害酵母细胞的同时增加酵母细胞的通透性，同时使质粒与细胞膜接触更紧密，促进转化。由于li+在碱性条件下才具备改变细胞膜通透性的能力，所以添加时应当使其存在于碱性的缓冲中，常用ph范围为7.5-9.0。二甲基亚砜(dmso)是一种含硫有机化合物，分子式为(ch3)2so，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。dmso也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。所述细胞渗透压保护液中缓冲液、二甲基亚砜、二硫苏糖醇，其摩尔比例为10-20∶1-1.5m∶10-20；原因是降低dna间的偶联反应，在dna溶液中加入，反应一段时间后除去，就可以降低dna的二聚化，比例取值过大造成的不利影响是去除不彻底，降低dna的纯度，比例取值过小造成的不利影响是减少dna二聚化效果不明显。细胞膜透性增强液的中所述缓冲液、醋酸锂、所述二硫苏糖醇、所述山梨醇溶液其摩尔比例为10-20∶50-100∶10-20；原因是增加毕赤酵母细胞转化时细胞膜的通透性，比例取值过大造成的不利影响是含有金属离子，浓度过高会对细胞造成损伤，比例取值过小造成的不利影响是增加细胞膜通透性不明显。dna保护剂液可以采用tcep。细胞稳定液包括水和、或山梨醇溶液，是一种非极性溶液，可以用于稳定和保护毕赤酵母。作为一种可选的实施方式，细胞dna保护液包括鲑鱼精dna和所述山梨醇溶液；鲑鱼精dna是为了保护要转化的dna，因为外源基因被转入真核生物的时候，会被识别并被降解，加入一定的鲑鱼精dna，使的毕赤酵母会因降解鲑鱼精dna，而使外源dna得以转化，从而提升转化效率。作为一种可选的实施方式，所述透性化试剂包括异丙醇、甘油、乙二醇、丙二醇、甘露醇、乙酰胺和二甲基亚砜中任意一种。作为一种可选的实施方式，所述第二菌液在冰浴环境中进行所述重悬活化，在温度为-80℃中进行所述定量保存。一种毕赤酵母感受态细胞，所述感受态细胞的活性度为85％-95％。此状态感受态细胞活性强，转化表达效果优异。一种共表达毕赤酵母工程菌株在中在质粒dna量为10ug-15ug，且质粒dna长度为2100bp-2400bp，质粒dna的质量分数为0.1％-0.2％时的应用。常规在转化dna量较少且长度较长的质粒dna，或连接产物中存在较高含量的杂质时，感受态细胞的转化情况会导致转化表达失败，本申请的感受态细胞适宜这种质粒dna的转化。一种所述的感受态细胞的转化方法，包括：将含目标基因的质粒转化进入所述感受态细胞进行扩增，获得扩增后毕赤酵母；从所述扩增后毕赤酵母提取质粒，后定点突变，得到突变质粒；将所述突变质粒与辅助质粒共转化到所述感受态细胞中；加入透性化试剂对突变质粒的表达进行优化，并鉴定表达量。定点突变，是指选择特定的位置进行突变，得到突变质粒；突变质粒和辅助质粒工转化，可以按照宿主偏好细胞的密码子进行点突变，提高质粒整合到宿主中的效率。加入透性化试剂可以提高感受态细胞在转化时的通透性，制备感受态细胞如果通透性太高，不易保存，且细胞活性不高。透性化试剂对细胞通透性只有瞬时作用，可以提高细胞活性。选择突变质粒的原因是提高质粒整合到宿主中的效率，和选择辅助质粒的原因是防止目的基因降解，因为外源基转入真核物的时候，会被识别并降解，加入定鲑鱼精dna使酵母降解鲑鱼精dna使目的dna成功转化。作为一种可选的实施方式，所述转化的方式为电转化，取吸光值吸光值od600为0.9-1.4的所述第二菌液得到的所述感受态细胞60～100μl，与10～20μg所述突变质粒混匀后，选用电压为1.4～2.3kv，转化时间为3～5ms。选择物料比为60～100μl：10～20μg的原因是在此物料比的配置下，转化效率最该高，能得到更多的转化子，比例取值过大或过小会使感受态细胞过多或质粒量过多，以至达不到最高转化效率。电压为1.4～2.3kv，转化时间为3-5ms。的原因是在此电转化的条件下的电转效率最高，比例取值过大造成的不利影响是电压过大会超过毕赤酵母的承受极限，导致细胞活性大幅下降，比例取值过小造成的不利影响是电压过小不足以刺激宿主细胞，导致质粒整合到宿主中的量下降。一种共表达毕赤酵母工程菌株在表达具有生物活性的功能蛋白；表达医用产品牛胰蛋白酶原或乙型肝炎病毒前s1蛋白或人白介素-2中的应用。下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请的一种毕赤酵母感受态细胞的制备方法进行详细说明。质粒和菌株：表达载体为ppic9k来自于武汉华美生物有限公司；表达菌株gs115购自来自武汉华美生物工程有限公司；培养基及试剂：培养基购自赛默飞世尔科技公司、质粒提取试剂盒购自常州天地人和生物科技有限公司。仪器：恒温摇床，垂直电泳系统，水平电泳系统，高速冷冻离心机，金属浴，全能成像仪。实施例1制备感受态细胞取100ul菌液接至装液量为100mlypd培养基的500ml三角瓶中，30℃，250rpm，培养过夜(14-18h)，直到od600＝0.9-1.4，以1.2收菌最好，收菌要迅速。菌液转入两个预冷的50ml离心管，每个50ml3000g，4℃离心5min，弃上清。每管用30ml细胞渗透压保护液重悬，常温静止30min后离心，每管用5ml细胞膜透性增强液重悬，同上离心，弃上清。每管用5ml冰无菌水重悬，同上离心，弃上清。每管用5ml冰1.2m山梨醇重悬，同上离心，弃上清。每管用500ul细胞dna保护液重悬，每管用1ml预冷ep管分装，感受态细胞保存在-80冰箱，两周内可用。细胞渗透压保护液：10mmtris，ph8.5、4％dmso、10mmdtt、0.8m山梨醇细胞膜透性增强液：10mmtris，ph8.5、80mmliac、10mmdtt、0.8m山梨醇细胞dna保护液：10mg/ml鲑鱼精dna、1.2m山梨醇(细胞dna保护液使用前沸水浴5mmin，随后放置冰上待用)实施例2电转化和pcr扩增预热eppendorf电穿孔仪，参数调为1.5kv，5ms；取一支新鲜制备的或两周内-80℃冻存的65ul电感受态细胞，加入20ul线性化的ppic9k(ppic3.5k)重组质粒(约10ug)，如图1，轻轻混匀，转入预冷的0.2cmeppendorf电转杯中，在超净台上轻轻敲击使混合物流到电击杯底部，冰浴5分钟。(所有的操作不要离开冰)；在5s内立即加入总体积为1ml预冷的1moll山梨醇至电转杯中，分别将内容物转移至灭菌的1.5ml离心管中；用1ml枪头轻柔取200ul涂于rdb平板上；30℃倒置培养3-5d，观察平板上转化子出现情况。pcr鉴定：在准备好的平板上随机标记1-20个单斑，按照表1配置pcr体系。表1，25ulpcr溶液的组分。p1p2dntpbuffertaq酶水0.20.21.620.215.85540505395将配置好的25ulpcr溶液分装到23个0.5mlep管，标记为1-20、-(阴性对照)、+(阳性对照)；在超净工作台用10ul枪头粘取标记好的单斑边缘吹匀在对应编号的ep管内(以上所有步骤都要在冰上进行)。将ep管放入pcr板按照下表对pcr仪设置进行pcr。设置具体为：1.temp94.0℃，time1000s；2.temp94.0℃，time0045；3.temp52.0℃，time0045；4.temp72.0℃，time0200；5.goto2，35moretimes；6.temp72.0℃，time1000；7.temp16.0℃，timeforever。pcr鉴定：将pcr后的样品点入点样孔，电泳15min然后在紫外仪上观察是否有亮带。亮带为阳性斑。转化后的菌株接种到培养基中，为图2中b图；图2中a图为常规方法制备的感受态细胞培养情况，从转化平板上可以看出，常规方法制备的感受态转化后得到的转化子个数为0.5x103个，而新方法制备的感受态转化得到的转化子可以达到2x103个，转化效率提升了4倍。本发明实现了通过真核毕赤酵母系统对感受态制备方法的优化，获得了高效率的转化，以及提升了转化后pcr鉴定35％的阳性率，为后期筛选高表达的菌株提供了可能。实施例3不同电场强度电转预热eppendorf电穿孔仪，参数调为1.0kv、1.5kv和2.3kv，其他同实施例2，观察观察平板上转化子出现情况。如图5，从左到右依次为电场强度为1.0kv、1.5kv和2.3kv。图5，说明了不同电场强度对电转化效率的影响。合适的电转强度可以提高转化子的存活强度。实施例4不同溶液制备感受态细胞本实施例采采用不同细胞渗透压保护液/细胞膜透性增强液/细胞膜dna保护液的具体成分不同比例对转化效率的影响，其他同实施例1。分别采用：a组采用细胞渗透压保护液为10mmtris，ph8.5、1.5mdmso、5mmdtt、0.8m山梨醇；细胞膜透性增强液为：10mmtris，ph8.5、160mmliac、10mmdtt、0.8m山梨醇；细胞膜dna保护液比例为：10mg/ml鲑鱼精dna、1.2m山梨醇，对毕赤酵母进行处理。b组采用细胞渗透压保护液为10mmtris，ph8.5、1.5mdmso、10mmdtt、0.8m山梨醇；细胞膜透性增强液为：10mmtris，ph8.5、80mmliac、10mmdtt、0.8m山梨醇；细胞膜dna保护液比例为：20mg/ml鲑鱼精dna、1.2m山梨醇，对毕赤酵母进行处理。c组采用细胞渗透压保护液为10mmtris，ph8.5、1.5mdmso、30mmdtt、0.8m山梨醇；细胞膜透性增强液为：10mmtris，ph8.5、40mmliac、10mmdtt、0.8m山梨醇；细胞膜dna保护液比例为：20mg/ml鲑鱼精dna、0.8m山梨醇，对毕赤酵母进行处理。如图6，图中从左到右为a组、b组和c的转化子培养情况，可以看出b组的转化子生长较佳，毕赤酵母感受态细胞生长较好，适宜用于转化。实施例5不同透性化试剂制备感受态细胞本实施例采不同采用透性化试剂和没有采用透性化试剂对毕赤酵母进行处理，观察其转化效果，分别采用二甲基亚砜作为透性化试剂、乙酰胺作为透性化试剂和未使用透性化试剂对毕赤酵母进行处理，其他同实施例1。实验效果如图7，图中从左到右为二甲基亚砜作为透性化试剂、乙酰胺作为透性化试剂和未使用透性化试剂对毕赤酵母进行处理后的培养情况，可以看出二甲基亚砜作为透性化试剂、乙酰胺作为透性化试剂的转化子生长较佳，毕赤酵母感受态细胞生长较好，适宜用于转化。实施例6不同质粒dna进行转化a组采用质粒dna量为5ng，且质粒dna长度为3000bp、连接产物中存在较高杂质含量，进行转化，感受态细胞采用实施例1中的感受态细胞，其他实验方法同实施例2；b组采用质粒dna量为10ng，质粒dna长度为2349bp的hsp90b1基因，用普通感受态制备方式制备的感受态进行转化，进行转化，感受态细胞采用常规的感受态细胞，其他实验方法同实施例2。c组采用质粒dna量为10ng，质粒dna长度为2349bp的hsp90b1基因，用普通感受态制备方式制备的感受态进行转化，进行转化，感受态细胞采用实施例1中的感受态细胞，其他实验方法同实施例2。转化子培养结果如图8，图中从左到右为a组、b组和c的转化子培养情况，a组和b组转化失败，c组转化情况良好，放大后得到的蛋白，sds-page检测，如图9，蛋白表达良好。附图1-3的详细说明：图1是本发明优选实例的质粒图谱；ppic9k质粒图谱，其中编码parp14的基因片段通过ecori和noti限制性内切酶位点构建到载体。ppic9k质粒存在kan基因，允许利用卡那抗性在原核宿主中筛选多克隆拷贝，同时在真核宿主中提供g418抗性。ppic9k质粒能够使用的毕赤酵母宿主菌是km71或gs115。其利用alpha因子分泌信号肽，分泌表达蛋白。为了将基因插入gs115或km71的aox区，使用saci限制性内切酶线性化质粒(gs115中产生his+mut+基因型，km71中产生his+muts基因型)；为了将基因插入gs115或km71的his4区，使用sali或者stui限制性内切酶线性化质粒(gs115中产生his+mut+基因型，km71中产生his+muts基因型)。图2转化后的菌株接种到培养基中，转化平板对比，图中，a为常规方法制备的感受态毕赤酵母，b为本发明的实施例感受态毕赤酵母。从转化平板上可以看出，常规方法制备的感受态转化后得到的转化子个数为0.5x103个，而新方法制备的感受态转化得到的转化子可以达到2x103个，转化效率提升了4倍。图3、图4中泳道1至泳道20为单菌落鉴定结果；-为阴性对照，+为阳性对照。从pcr鉴定中可以看出，常规方法制备的感受态，转化后pcr鉴定，20个斑中，较为明显阳性的为1-7、9、11、14、15、18，共12个，阳性率为60％；新方法制备的感受态，转化后pcr鉴定，20个斑中，较为明显阳性的为1-9、11-20，共19个，阳性率为95％。改变感受态制备方式后，阳性率提升了35％。最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。序列表<110>武汉华美生物工程有限公司<120>一种毕赤酵母高效转化感受态细胞的制备方法和转化方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2349<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gatgacgaagttgacgttgacggtactgtcgaagaggacttgggaaagtctagagaaggt60tccagaactgacgacgaggttgttcaaagagaggaagaggctattcagctggacggtttg120aacgcttcccagatcagagaattgagagagaagtccgagaagttcgctttccaggctgag180gtcaacagaatgatgaagctgatcatcaactccctgtacaagaacaaagagatcttcctg240agagagctgatctccaacgcttctgatgctctggacaagatcagattgatctccttgact300gacgagaacgctttggctggtaacgaagagttgaccgtcaagatcaagtgcgaccgtgag360aagaacttgttgcacgttactgacactggtgtcggtatgaccagagaagagttggtcaag420aacttgggtactatcgccaagtctggtacttccgagttcctgaacaagatgactgaagct480caagaggacggtcaatctacctccgagttgattggtcaattcggtgtcggtttctactcc540gctttcttggttgctgacaaggttatcgttacctccaagcacaacaacgacactcagcac600atttgggaatctgactccaacgagttctccgttattgctgacccaagaggtaacaccctt660ggtagaggtactaccatcaccttggtcttgaaagaagaggcctccgactacttggagttg720gacaccatcaagaacctggtcagaaagtactcccagttcatcaacttcccaatctacgtc780tggtcctccaagactgagactgttgaagaaccattggaagaggacgagactgcccaagaa840gaaaaagaagaagccgacgacgaagctgctgtcgaggaagaagaagaggaaaagaagcct900aagaccaagaaggtcgaaaagaccgtttgggactgggaactgatgaacgacattaagcca960atctggcagaggccatccaaagaggttgaagaggacgagtacaaggccttctacaagagc1020ttctccaaagaatctgacgacccaatggcctacatccactttactgctgaaggtgaggtt1080accttcaagtccatcctgttcgttccaacttctgctccaagaggtttgttcgacgaatac1140ggttccaagaagtctgactacatcaagctgtacgtcaggcgtgttttcatcactgatgac1200ttccacgacatgatgcccaagtacctgaacttcgttaagggtgttgttgactccgacgac1260ttgccattgaacgtttccagagaaaccttgcagcagcacaagctgttgaaggtcatcaga1320aagaagctggtccgtaagaccctggacatgatcaagaagatcgccgacgaaaagtacaac1380gataccttctggaaagagttcggcaccaacatcaagttgggtgttattgaggaccactcc1440aacagaactagattggccaagctgctgagattccaatcttctcaccactccactgacatc1500acttccctggaccaatacgtcgagagaatgaaggaaaagcaagacaagatctacttcatg1560gccggttcctccagaaaagaggctgaatcttctccattcgtcgagaggttgctgaagaag1620ggttacgaggttatctacttgaccgagccagttgacgaatactgtatccaggctttgcca1680gagttcgacggtaagagatttcagaacgttgccaaagagggtgtcaagttcgacgagtct1740gaaaagtccaaagagtccagagaggctaccgagaaagaattcgagcctttgttgaactgg1800atgaaggacaaggccctgaaggataagatcgagaaggctgttgtttcccagagattgact1860gaatccccatgtgctttggttgcttcccaatacggttggtccggtaacatggaaagaatc1920atgaaggctcaggcttaccagaccggtaaggacatttccactaactactacgcctctcag1980aagaaaaccttcgagatcaacccaagacacccactgatcagagacatgctgagaagagtc2040aaagaggatgaggacgacaagaccgttatggacttggccgttgttttgttcgagactgct2100actctgagatccggttacttgttgccagacactaaggcttacggtgacagaatcgagagg2160atgttgagactgtccttgaacattgacccagaggctcaggttgaggaagaacctgaagaa2220gaaccagaggataccactgaggacactactgacgattctgagcaagacgaagaagaaact2280gacgctggcgctgaggaagaggaagaagaacaagaaactgagaaagaacccaccgagaag2340gacgaattg2349当前第1页12