一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用

文档序号:26947645发布日期:2021-10-12 20:10阅读:275来源:国知局
一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用

1.本发明涉及一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用,属于发酵 工程技术领域。


背景技术:

2.酪醇是一种具有特殊药理作用的酚类有机化合物。酪醇的生产有植物提取、 化学合成和微生物发酵等方法。由于化学合成法成本较低,因此其为目前酪醇 的主要生产方法。
3.采用微生物发酵法生产酪醇主要以葡萄糖为原料,原料成本低且可再生, 生产过程不易形成有毒物质,是一种有发展前景的酪醇制备方法。现有技术中, 酪醇微生物发酵法的主要缺点是酪醇产量较低和发酵周期较长,已报道的酪醇 发酵方法中产量最高为3.9g/l,发酵时间为48hr(xu w,yang c,xia y,et al. high

level production of tyrosol with noninduced recombinant escherichia coli bymetabolic engineering.agricultural and food chemistry,2020,68:4616

4623)。
4.由于使用合适的宿主菌是提高发酵速度的有效方法,因此从自然界中筛选 大肠杆菌,进一步构建产酪醇重组大肠杆菌,最终获得发酵时间显著短于已见 报道的同类菌种的重组大肠杆菌是十分有效的手段。


技术实现要素:

5.本发明的目的是克服上述不足之处,提供一株缩短发酵周期的产酪醇重组 大肠杆菌及其应用,所述菌株用于酪醇发酵,具有较短的发酵周期。
6.本发明的技术方案,一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌yc166,已 保藏于中国典型培养物保藏中心,地址中国武汉,武汉大学,分类命名为大肠 杆菌yc166(escherichia coli yc166),保藏日期2021年4月12日,保藏编号 cctcc no:m2021358。
7.所述产酪醇重组大肠杆菌yc166的构建方法如下:
8.(1)自然界筛选:首先以大肠杆菌标准株k12为参照,选择菌落与k12 菌株相近的菌落,测序后与mg1655基因序列比较,得到同源性高的197株菌 株;
9.(2)高生物量宿主菌筛选:将步骤(1)所得197株大肠杆菌培养后制备 为电转化感受态细胞,将重组质粒pkk223
‑3‑
aro10*转入上述大肠杆菌感受态 细胞中,筛选其中能够获得转化子并且转化子具有产酪醇和高菌体浓度特点的 宿主菌yec039、yec104和yec166;
10.(3)宿主菌改造:对步骤(2)所得高菌体浓度宿主菌yec039、yec104 和yec166进行产酪醇竞争途径基因feab、phea、tyrb和芳香族全局调控阻遏 蛋白基因tyrr的敲除,最终得到能够完成敲除工作的宿主菌yec166,敲除基 因后得到的重组菌yec166δfeabδpheaδtyrbδtyrr;
11.(4)缩短发酵周期的产酪醇重组菌的获得:取步骤(3)获得的大肠杆菌yec166δfeabδpheaδtyrbδtyrr再进一步通过电转化转入控制酪醇合成的 关键酶基因aro10*表
达的重组质粒pkk223
‑3‑
aro10*,即获得缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌yec166δfeabδpheaδtyrbδtyrr/pkk223
‑3‑
aro10*,该菌株简称为yc166。
12.进一步地,步骤(1)中以大肠杆菌标准株k12为参照,选择菌落与k12菌株相近的菌落,得到800株菌株,全部进行16srdna测序,将测序结果与大肠杆菌mg1655的基因组序列中的16srdna基因序列(geneid:944897)进行比较,以序列同源性高于98.5%为标准用于下一步实验;最后获得197株菌株,编号为yec001

yec197,上述大肠杆菌分别在江南大学中国高校工业微生物资源信息平台(http://www.cicim

cu.jiangnan.edu.cn)和无锡先秦生物科技有限公司进行保藏后用于后续实验。
13.所述大肠杆菌mg1655的基因组序列公布于美国国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov),登陆号:nc_000913。
14.其中16srdna基因序列分析的方法首先按文献[隋新华.原核生物进化与系统分类学实验教程.北京:科学出版社,2011:62页

69页]获取菌株的16srdna基因的pcr产物,pcr产物送上海生工生物技术服务公司测序,获得序列后再按上述文献的方法进行序列同源性分析。
[0015]
进一步地,步骤(2)中将在大肠杆菌中控制酪醇合成关键酶苯丙酮酸脱羧酶基因表达的重组质粒pkk223
‑3‑
aro10*转入yec001

yec197菌株培养后制备所得电转化感受态细胞中,用质粒pkk223
‑3‑
aro10*电转化上述筛选获得的大肠杆菌的感受态细胞,获得转化子的是其中81株菌株;将上述81株转化子分别接种m9y培养基,摇瓶发酵并间隔12小时检测菌体浓度,发酵至48小时检测酪醇产量,筛选出宿主菌编号为yec039、yec104和yec166的三株宿主菌。
[0016]
所述重组质粒pkk223
‑3‑
aro10*为在大肠杆菌中控制酪醇合成关键酶苯丙酮酸脱羧酶基因表达的重组质粒,公开于cuiyang,xianzhongchen,junzhuangchang,lihuazhang,weixu,weishen,youfan.reconstructionoftyrosolsyntheticpathwaysinescherichiacoli.中国化学工程学报:英文版.2018,26(12):2615

2621。该质粒转入大肠杆菌后可以控制大肠杆菌合成酪醇,可能由于aro10*基因的高表达影响了菌株氨基酸代谢的正常进行,转入上述质粒的大肠杆菌转化子的生长一般比较慢,明显慢于转入了空质粒的对照菌株。
[0017]
进一步地,步骤(3)中feab基因的敲除中,参考美国国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的大肠杆菌mg1655的基因组序列(登录号:nc_000913)中的feab基因序列(geneid:8115427)以及该基因上下游约各500碱基的序列,设计feab基因敲除的引物pfeab01、pfeab02。引物序列如下:
[0018]
引物pfeab01序列(seqidno:1):5
’‑
cagcgaaaaaagtgacttttcttgtcgctgcgtacactgaaatcacactgggggctggagctgcttc
‑3’

[0019]
引物pfeab02序列(seqidno:2):5
’‑
ttaataccgtacacacaccgacttagtttcacaccaaccgtccagccagtattccggggatccgtcgacc
‑3’

[0020]
同时设计用于基因敲除重组菌鉴定的引物pfeabu(seqidno:3)、pfeabd(seqidno:4)和pkan02(seqidno:5),其序列如下:
[0021]
pfeabu序列:5
’‑
gactataggaaataagtc
‑3’

[0022]
pfeabd序列:5
’‑
ctctgctgaaaccatgg
‑3’

[0023]
pkan02序列:5
’‑
tgaacaagatggattgcacg
‑3’

[0024]
进一步地,步骤(3)中phea基因敲除中,参考大肠杆菌mg1655的基因组序列(登录号:nc_000913)中的phea基因序列(geneid:8114416)以及该基因上下游约各500碱基的序列,设计phea基因敲除的引物pphea01(seqidno:6)、pphea02(seqidno:7)。引物序列如下:
[0025]
引物pphea01序列:5
’‑
aggcaacactatgacatcggaaaacccgttactggcgctgcgagagaaaaggctggagctgcttc
‑3’

[0026]
引物pphea02序列:5
’‑
cagacgggtcataatcagattgtggttgcgcagtaccagcaacgcttcaaccaattccggggatccgtcgacc
‑3’

[0027]
同时设计用于phea基因敲除重组菌鉴定的引物ppheau(seqidno:8)、pphead(seqidno:9),其序列如下:
[0028]
引物ppheau序列:5
’‑
tcctttatattgagtgtatcg
‑3’

[0029]
引物pphead序列:5
’‑
tggcctgaatatccagatag
‑3’

[0030]
进一步地,步骤(3)中tyrb基因的敲除中,参考大肠杆菌mg1655的基因组序列(登录号:nc_000913)中的tyrb基因序列(geneid:8115375)以及该基因上下游约各500碱基的序列,设计tyrb基因敲除的引物ptyrb01(seqidno:10)、ptyrb02(seqidno:11)。引物序列如下:
[0031]
ptyrb01引物序列:5
’‑
gcttatggagcgttttaaagaagaccctcgcagcgacaaagtgaatttaagtatggctggagctgcttc
‑3’

[0032]
ptyrb02引物序列:5
’‑
ttacatcaccgcagcaaacgcctttgccacacgttgtacatttgccgattccggggatccgtcgacc
‑3’

[0033]
同时设计用于tyrb基因敲除重组菌鉴定的引物ptyrbu(seqidno:12)、ptyrbd(seqidno:13),其序列如下:
[0034]
引物ptyrbu序列:5
’‑
tgacgcctacgctgg
‑3’
[0035]
引物ptyrbd序列:5
’‑
tttcactgcaggctgggtag
‑3’
[0036]
进一步地,步骤(3)中tyrr基因的敲除中,参考大肠杆菌mg1655的基因组序列(登录号:nc_000913)中的tyrr基因序列(geneid:945879)以及该基因上下游约各500碱基的序列,设计tyrr基因敲除的引物ptyrr01(seqidno:14)、ptyrr02(seqidno:15)。引物序列如下:
[0037]
ptyrr01引物序列:5
’‑
ttttcaggtgaaggttcccatgcgtctggaagtcttttgtgaagaggctggagctgcttc
‑3’

[0038]
ptyrr02引物序列:5
’‑
ttactcttcgttcttcttctgactcagaccatattcccgcaacttattggcattccggggatccgtcgacc
‑3’

[0039]
同时设计用于tyrr基因敲除重组菌鉴定的引物ptyrru(seqidno:16)、ptyrrd(seqidno:17),其序列如下:
[0040]
引物ptyrru序列:5
’‑
gtgcccgtttttccgtc
‑3’

[0041]
引物ptyrrd序列:5
’‑
gattacgaagcagctctggc
‑3’

[0042]
所述产酪醇重组大肠杆菌yc166的应用,将其应用于酪醇的摇瓶发酵或发酵罐发酵获取。
[0043]
进一步地,采用产酪醇重组大肠杆菌yc166进行发酵,接种量为1%,培养基为m9yb发酵培养基;30℃、200r/min发酵,发酵时间为24h。
[0044]
本发明的有益效果:本发明提供的产酪醇重组大肠杆菌yc166相对于现有微生物发酵法制备酪醇的过程发酵水平相当,但发酵时间显著缩短,具有良好的工业化应用前景,具备产业化价值。
[0045]
生物材料样品保藏:一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌yc166,已保藏于中国典型培养物保藏中心,地址中国武汉,武汉大学,分类命名为大肠杆菌yc166(escherichiacoliyc166),保藏日期2021年4月12日,保藏编号cctccno:m2021358。
附图说明
[0046]
图1是feab基因删除的pcr验证电泳图;
[0047]
m:分子量标准dl2000;1:出发菌yec166的pcr鉴定;2:yec166δfeab的pcr鉴定。
[0048]
图2是phea,tyrb,tyrr基因删除的pcr验证;
[0049]
m:分子量标准dl2000;3:yec166δfeab;4:yec166δfeabδphea;5:yec166δfeabδphea;6:yec166δfeabδpheaδtyrb;7:yec166δfeabδpheaδtyrb;8:yec166δfeabδpheaδtyrbδtyrr
[0050]
图3是重组大肠杆菌yc166的发酵罐发酵酪醇时间

细胞密度/酪醇产量示意图。
具体实施方式
[0051]
以下实施例中用于液相检测的酪醇标样为sigma公司产品。其他试剂均购自国药集团化学试剂公司。分子生物学操作试剂均为大连宝生物工程有限公司产品。质粒提取试剂盒、pcr产物纯化及胶回收试剂盒等均为爱思进生物技术(杭州)有限公司产品。
[0052]
实施例1产酪醇重组大肠杆菌yc166的制备
[0053]
(1)从自然界中筛选大肠杆菌:在自然界中收集各种野生动物的粪便。适当稀释后在lb固体培养基上划线分离,以大肠杆菌标准株k12为参照,选择菌落与k12菌株相近的菌落,进一步镜检,保藏镜检结果为杆菌的菌落共计约800株。全部进行16srdna基因序列分析,将测序结果与美国国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的大肠杆菌mg1655的基因组序列(登录号:nc_000913)中的16srdna基因序列(geneid:944897)进行比较,以序列同源性为高于98.5%为标准用于下一步实验。其中16srdna基因序列分析的方法首先按文献[隋新华.原核生物进化与系统分类学实验教程.北京:科学出版社,2011:62页

69页]获取菌株的16srdna基因的pcr产物,pcr产物送上海生工生物技术服务公司测序,获得序列后再按上述文献的方法进行序列同源性分析。根据上述标准,共计鉴定获得大肠杆菌197株,编号为yec001~yec197。
[0054]
上述大肠杆菌分别在江南大学中国高校工业微生物资源信息平台(http://www.cicim

cu.jiangnan.edu.cn)和无锡先秦生物科技有限公司进行保藏后用于后续实验。
[0055]
(2)高生物量宿主菌的筛选:按照文献(周海岩.l

苯丙氨酸生产菌株的构建、代谢调控和发酵条件优化[d].博士学位论文,无锡,江南大学,2011)中的电转化感受态细胞制备及转化方法所述,将上述197株大肠杆菌分别培养后制备为电转化感受态细胞。
[0056]
培养大肠杆菌jm109/pkk223
‑3‑
aro10*大量提取质粒pkk223
‑3‑
aro10*。大肠杆菌jm109/pkk223

aro10*公开于[yangc,chenxz,changjz,etal.reconstructionoftyrosolsyntheticpathwaysinescherichiacoli[j].中国化学工程学报:英文版,2018(7):23

27.]。
[0057]
用质粒pkk223
‑3‑
aro10*电转化上述筛选获得的197株大肠杆菌的感受态细胞。经多次转化,其中81株菌获得了转化子。其余菌株有部分菌株自身具有氨苄青霉素抗性,其余菌株经过多次转化始终未能得到转化子,这些菌株做放弃处理。将上述81株转化子分别接种m9y培养基,摇瓶发酵并间隔12小时检测菌体浓度,发酵至48小时检测酪醇产量。剔除完全不产酪醇的菌株后,筛选最终菌体浓度最高菌株作为后续研究的材料。
[0058]
所述m9y培养基具体组成如下:磷酸二氢钾3g/l、十二水磷酸氢二钠17.1g/l、氯化铵1g/l、氯化钠0.5g/l、葡萄糖20g/l、酵母粉0.25g/l,115℃灭菌15min。单独配置1.25mol/l的硫酸镁溶液母液,单独灭菌,使用时在每l上述培养基中加入硫酸镁母液4ml。
[0059]
经筛选,81株转化子中有14株菌的发酵液未检测到酪醇,其余67株菌的发酵液中均能检测到酪醇,浓度在0.1~0.5之间。所有菌株均在培养至24hr时达到最高菌浓,其中宿主菌编号为yec039、yec104和yec166的三株宿主菌的转化子的菌浓明显高于其它菌株,以od600计算分别达到12.9,11.2和11.6。
[0060]
其中,yec039菌株在后续工作中始终未能实现基因敲除,最终被放弃。yec166及其转化子被用于后续实验。大肠杆菌yec166已分别保藏在江南大学中国高校工业微生物资源信息平台(http://www.cicim

cu.jiangnan.edu.cn)和本项目合作企业无锡先秦生物科技有限公司,该菌株在两家单位的保藏编号为cicimb6943和xq05159b。
[0061]
(3)宿主菌的改造:根据前述研究,产酪醇竞争途径基因feab、phea、tyrb和芳香族全局调控阻遏蛋白基因tyrr的敲除可以大幅度提高酪醇的产量。按照文献报导的方法(cuiyang,xianzhongchen,junzhuangchang,lihuazhang,weixu,weishen,youfan.reconstructionoftyrosolsyntheticpathwaysinescherichiacoli.中国化学工程学报:英文版.2018,26(12):2615

2621)将宿主菌yec166的上述4个基因敲除。具体操作方法如下:
[0062]
a、feab基因的敲除:参考美国国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的大肠杆菌mg1655的基因组序列(登录号:nc_000913)中的feab基因序列(geneid:8115427)以及该基因上下游约各500碱基的序列,设计feab基因敲除的引物pfeab01、pfeab02。引物序列如下:
[0063]
引物pfeab01序列:
[0064]5’‑
cagcgaaaaaagtgacttttcttgtcgctgcgtacactgaaatcacactgggggctggagctgcttc
‑3’
(seqidno:1);
[0065]
引物pfeab02序列:
[0066]5’‑
ttaataccgtacacacaccgacttagtttcacaccaaccgtccagccagtattccggggatccgtcgacc
‑3’
(seqidno:2);
[0067]
同时设计用于基因敲除重组菌鉴定的引物pfeabu、pfeabd和pkan02,其序列如下:
[0068]
pfeabu序列:5
’‑
gactataggaaataagtc
‑3’
(seqidno:3);
[0069]
pfeabd序列:5
’‑
ctctgctgaaaccatgg
‑3’
(seqidno:4);
[0070]
pkan02序列:5
’‑
tgaacaagatggattgcacg
‑3’
(seqidno:5)。
[0071]
以pkd13为模板,以pfeab01、pfeab02为引物进行pcr扩增获得feab基因敲除盒。取大肠杆菌yec166菌株,制备电转化感受态细胞。取质粒pkd46电转化上述yec166感受态细胞。进一步按照[yangc,chenxz,changjz,etal.reconstructionoftyrosolsyntheticpathwaysinescherichiacoli[j].中国化学工程学报:英文版,2018(7):23

27.]所述的方法进行feab基因敲除、标记基因弹出和辅助质粒消除。最终获得已经删除了feab基因并且不含任何标记基因和重组质粒的大肠杆菌yec166δfeab。
[0072]
图1是重组菌的电泳鉴定图。鉴定引物pfeabu和pfeabd分别与feab基因被敲除部分的上游和下游序列对应,基因删除前引物间基因片段长度约为1789bp,删除基因并弹出标记基因后引物pfeabu和pfeabd引物间长度大约为407bp。由图1可见,pcr产物大小与预计的一致,可见重组菌yec166δfeab构建成功。
[0073]
b、phea基因的删除:参考大肠杆菌mg1655的基因组序列(登录号:nc_000913)中的phea基因序列(geneid:8114416)以及该基因上下游约各500碱基的序列,,设计phea基因敲除的引物pphea01、pphea02。引物序列如下:
[0074]
引物pphea01序列:
[0075]5’‑
aggcaacactatgacatcggaaaacccgttactggcgctgcgagagaaaaggctggagctgcttc
‑3’
(seqidno:6);
[0076]
引物pphea02序列:
[0077]5’‑
cagacgggtcataatcagattgtggttgcgcagtaccagcaacgcttcaaccaattccggggatccgtcgacc
‑3’
(seqidno:7);
[0078]
同时设计用于phea基因敲除重组菌鉴定的引物ppheau、pphead,其序列如下:
[0079]
引物ppheau序列:5
’‑
tcctttatattgagtgtatcg
‑3’
(seqidno:8);
[0080]
引物pphed序列:5
’‑
tggcctgaatatccagatag
‑3’
(seqidno:9);
[0081]
以pkd13为模板,以pphea01、pphea02为引物进行pcr获得phea基因敲除盒。取上一步骤获得的重组大肠杆菌yec166δfeab菌株,制备电转化感受态细胞。取质粒pkd46电转化上述yec166δfeab感受态细胞。进一步按照材料方法中方法6的方法用上述phea基因敲除盒进行phea基因敲除、标记基因弹出和辅助质粒消除。最终获得不含任何标记基因和重组质粒的大肠杆菌yec166δfeabδphea。图2a是重组菌的电泳鉴定图。鉴定引物ppheau和pphead分别与phea基因被敲除部分的上游和下游序列对应,基因删除前ppheau和pphead引物间基因片段长度约为1294bp,删除基因并弹出标记基因后大约为493bp。由图2a可见,pcr产物大小与预计的一致,可见重组菌yec166δfeabδphea构建成功。
[0082]
c、tyrb基因的敲除
[0083]
参考大肠杆菌mg1655的基因组序列(登录号:nc_000913)中的tyrb基因序列(geneid:8115375)以及该基因上下游约各500碱基的序列,,设计tyrb基因敲除的引物ptyrb01、ptyrb02。引物序列如下:
[0084]
ptyrb01引物序列:
[0085]5’‑
gcttatggagcgttttaaagaagaccctcgcagcgacaaagtgaatttaagtatggctggagctgcttc
‑3’
(seqidno:10);
[0086]
ptyrb02引物序列:
[0087]5’‑
ttacatcaccgcagcaaacgcctttgccacacgttgtacatttgccgattccggggatccgtcgacc
‑3’
(seqidno:11);
[0088]
同时设计用于tyrb基因敲除重组菌鉴定的引物ptyrbu、ptyrbd,其序列如下:
[0089]
引物ptyrbu序列:5
’‑
tgacgcctacgctgg
‑3’
(seqidno:12);
[0090]
引物ptyrbd序列:5
’‑
tttcactgcaggctgggtag
‑3’
(seqidno:13);
[0091]
以ptyrb01和ptyrb02为引物,以pkd13为模板进行pcr扩增,获得tyrb基因敲除盒。按照上述敲除feab基因的方法敲除上一步骤获得的重组菌大肠杆菌yec166δfeabδphea的tyrb基因,并消除辅助质粒同时弹出基因敲除标记基因,获得重组菌大肠杆菌yec166δfeabδpheaδtyrb。鉴定引物ptyrbu和ptyrbd分别与tyrb基因被敲除部分的上游和下游序列对应,基因删除前引物间基因片段长度约为1220bp,删除基因并弹出标记基因后大约为261bp。由图2b可见,pcr产物大小与预计的一致,可见重组菌yec166δfeabδpheaδtyrb构建成功。
[0092]
d、tyrr基因的敲除:参考大肠杆菌mg1655的基因组序列(登录号:nc_000913)中的tyrr基因序列(geneid:945879)以及该基因上下游约各500碱基的序列,,设计tyrr基因敲除的引物ptyrr01、ptyrr02。引物序列如下:
[0093]
ptyrr01引物序列:5
’‑
ttttcaggtgaaggttcccatgcgtctggaagtcttttgtgaagaggctggagctgcttc
‑3’
(seqidno:14);
[0094]
ptyrr02引物序列:5
’‑
ttactcttcgttcttcttctgactcagaccatattcccgcaacttattggcattccggggatccgtcgacc
‑3’
(seqidno:15);
[0095]
同时设计用于tyrr基因敲除重组菌鉴定的引物ptyrru、ptyrrd,其序列如下:
[0096]
引物ptyrru序列:5
’‑
gtgcccgtttttccgtc
‑3’
(seqidno:16);
[0097]
引物ptyrrd序列:5
’‑
gattacgaagcagctctggc
‑3’
(seqidno:17);
[0098]
以pkd13为模板,以ptyrr01和ptyrr02为引物,pcr获得tyrr基因敲除盒。按照上述敲除feab基因的方法敲除上一步骤获得的重组大肠杆菌yec166δfeabδpheaδtyrb的tyrr基因,并消除辅助质粒同时弹出基因敲除标记基因,获得重组菌大肠杆菌yec166δfeabδpheaδtyrbδtyrr。鉴定引物ptyrru和ptyrrd分别与tyrr基因被敲除部分的上游和下游序列对应,基因删除前引物ptyrru和ptyrrd间基因片段长度约为1730bp,删除基因并弹出标记基因后大约为355bp。由图2c可见,pcr产物大小与预计的一致,可见重组菌yec166δfeabδpheaδtyrbδtyrr构建成功。
[0099]
最后将重组质粒pkk223

aro10*转化上述重组菌yec166δfeabδpheaδtyrbδtyrr的感受态细胞,获得重组菌yec166δfeabδpheδtyrbδtyrr/pkk223
‑3‑
aro10*,为便于叙述,该重组菌命名为大肠杆菌yc166,用于后续产酪醇发酵的研究。
[0100]
上述基因敲除pcr模板质粒pkd13(含基因其敲除专用的卡那霉素抗性基因),red重组辅助质粒pkd46、pcp20为前述文献公开后保藏。
[0101]
上述菌株命名为缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌yc166,已保藏于中国典型培养物保藏中心,地址中国武汉,武汉大学,分类命名为大肠杆菌yc166(escherichiacoliyc166),保藏日期2021年4月12日,保藏编号cctccno:m2021358。
[0102]
以下实施例中细胞浓度的检测过程如下:
[0103]
紫外分光光度计在600nm处检测细胞密度od600;需要检测细胞干重是 按以下方法进行:取1ml待测菌液,12000r/min离心10min,弃上清,去离 子水重复洗涤3次后烘箱烘干至恒重;称重,根据前期研究结果yc166细胞 干重dcw(y)与od600(x)的比值为:0.382:1。
[0104]
hplc法检测发酵液中酪醇含量
[0105]
样品处理:将发酵液在100℃中加热10min,去除蛋白,离心收集上清, 水系微孔滤膜过滤。
[0106]
液相条件:以1ml/min的80%的0.1%甲酸和20%纯甲醇作为流动相;色 谱柱为博纳艾杰尔c18色谱柱(4.6
×
250mm,孔径为5μm);柱温30℃;检 测波长为276nm紫外检测器,进样量为10μl。
[0107]
标曲测定:通过标样倍比稀释,通过上述条件进行检测,以酪醇浓度为横 坐标,酪醇标品的hplc峰面积为纵坐标,测定得到酪醇浓量(g
·
l
‑1)标准 曲线为:y=7054x

564.5(r2=0.9998)。
[0108]
hplc的检测仪器为:高效液相色谱安捷伦,型号为1260hplc。
[0109]
实施例2产酪醇重组大肠杆菌yc166的摇瓶发酵
[0110]
将重组菌yec166/pkk

223
‑3‑
aro10*、yc166按如下步骤进行摇瓶发酵:
[0111]
(1)在含100μg/ml氨苄青霉素的lb平板划线分离培养获得单菌落;
[0112]
(2)选取单菌落,接种20ml lb液体培养基,37℃过夜培养;
[0113]
(3)上述菌液,接种(1%接种量接种)50ml m9yb发酵培养基,30℃、 200r/min发酵48h。每隔24h取样一次,用于检测酪醇产量和细胞浓度。
[0114]
m9yb培养基(一种改良的m9y培养基用于产酪醇重组菌的初筛):磷酸 二氢钾3g/l、十二水磷酸氢二钠17.1g/l、氯化铵1.3g/l、氯化钠0.5g/l、葡 萄糖2.5g/l、酵母粉0.25g/l,115℃灭菌15min。单独配置1.25mol/l的硫酸 镁溶液母液,单独灭菌,使用时在每l上述培养基中加入硫酸镁母液5ml。
[0115]
结果显示两株菌均在发酵至24h时达到最高菌体浓度和酪醇产量。其中以 od600计算的菌体浓度分别为12.3和11.3,酪醇产量分别为0.16g/l和1.9g/l。 这个实验可见,宿主菌yc166中feab等四个基因的敲除可以大幅度提高酪醇 的产量。
[0116]
xu等报道的ymg5a*在摇瓶发酵条件下酪醇的最高发酵水平为10.92mm (大约为1.84g/l)(xu w,yang c,xia y,et al.high

level production of tyrosolwith noninduced recombinant escherichia coli by metabolic engineering. agricultural and food chemistry,2020,68:4616

4623),yc166摇瓶发酵最终水平 比ymg5a*提高不明显,但yc166的发酵时间只有24h而ymg5a*需要48h。 ymg5a*在进行摇瓶发酵时必须添加碳酸钙以中和菌株产生的副产物有机酸, 其中醋酸是主要副产物,估计可以达到0.5mm,而yc166在摇瓶发酵时产酸 很少,其副产物主要也是醋酸,总量在0.1mm以下。摇瓶发酵时在yc166的 发酵液中添加碳酸钙对发酵影响不明显,我们采用xu等报道的添加碳酸钙的 摇瓶发酵方法同样进行yc166的发酵,结果酪醇产量依然在1.9g/l左右,发 酵时间为24h,这可能是由于yc166很少产生,碳酸钙作为一种中和剂在发酵 过程中作用不明显。
[0117]
本实施例中yc166的发酵培养基是m9yb,其成分中葡萄糖和氯化铵的量 相比xu等采用的m9y要略高一点,这个差异对酪醇的最终产量可能会有影响, 对缩短发酵周期一般
不可能有明显的作用。为谨慎起间我们ymg5a*也进行了 同样的实验,结果显示ymg5a*在m9yb培养基中的最终发酵水平依然在1.8 g/l左右而发酵周期反而有所延长,超过了48h。
[0118]
实施例3重组大肠杆菌yc166的发酵罐发酵
[0119]
将重组大肠杆菌yc166按如下步骤进行发酵罐发酵:
[0120]
(1)将所需发酵的菌株在固体lb培养基上培养获得单菌落;
[0121]
(2)选取单菌落,接种20ml lb培养基,37℃过夜培养;
[0122]
(3)上述菌液,接种(一般按1%接种量接种)装有50ml lb培养基的 500ml三角瓶(一般需要同时接种6瓶),控制初始菌浓在od600=0.05,在37℃ 按200r/min进行摇瓶培养,一般是2

3h左右可以达到od
600
=0.25左右,进行 菌体扩大培养;
[0123]
(4)将上述培养的菌液以10%的接种量,接种至装有2l m9y培养基的5 l发酵罐中。发酵过程以氨水作为中和剂,恒定ph=7
±
0.5;
[0124]
(5)发酵过程中每4h取样,取样时测定葡萄糖浓度。根据葡萄糖检测结 果,如果糖含量低于5g/l则加入补料培养基至葡萄糖浓度为5g/l。取出的样品 同时用于检测酪醇产量和细胞浓度。
[0125]
结果如图3所示。采用xu等报道的酪醇发酵罐发酵方法(同本发明处理 方法中的方法2)进行发酵罐发酵,结果如图3所示。由图3可见,yc166在 发酵至24h的时候达到酪醇最高水平,为3.3g/l。本课题组前期获得的产酪醇 重组菌ymg5a*在同样条件下发酵获得的酪醇最高水平为3.9g/l,但发酵时间 为48h。从xu等的报道看,ymg5a*在发酵至24h的时候,其发酵液中酪醇 的含量大概在1.9g/l左右,显然yc166的发酵速度显著高于ymg5a*。
[0126]
本实施例采用的发酵方法与xu等报道的完全一致,从发酵结果看,yc166 的发酵水平与ymg5a*接近而发酵周期则大幅度缩短。
当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1