毛竹PeDREB3基因及其在植物抗寒性调控中的应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及毛竹pedreb3基因及其在植物抗寒性调控中的应用。

背景技术：

毛竹(phyllostachysedulis)是禾本科(gramminales)竹亚科(bambusoideae)刚竹属(phyllostachys)散生竹种，大多喜温暖湿润气候，在地理分布上以南方为主。虽然在20世纪50-60年代进行了大规模“南竹北移”的引种工作，使一些抗性较强的散生竹引种到黄河流域以北地区，竹子引种工作取得了较大的成功，但是，温度一直是竹类植物在中国黄河流域以北地区中较难进一步推广应用的主要限制因素。因此，进行竹种改良、培育抗寒性强的竹子新品种非常必要，这也是扩大竹子分布范围的一种重要途径。而研究寒冷条件下毛竹体内相关基因的功能则是进行新品种培育的分子基础，对于揭示竹子的抗寒分子机制，进而突破常规育种的局限性，加快竹子育种进程具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供毛竹pedreb3基因及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供毛竹pedreb3基因，其氨基酸序列为如下(1)或(2)：

(1)如seqidno.1所示；

(2)如seqidno.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(1)衍生的氨基酸序列。毛竹pedreb3基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明采用如下方法克隆得到pedreb3基因：

(1)从毛竹叶片材料中提取总rna，并将提取得到的总rna反转录为cdna。本发明中，毛竹总rna的提取采用本领域常用的提取细胞总rna的方法即可，本发明的实施例中具体采用trizol法。

(2)在提取得到毛竹总rna后，将所述总rna反转录合成cdna。在本发明中，cdna的合成采用本领域常规的cdna合成方法即可，无其他特殊要求；本发明的实施例中具体采用宝生物工程(大连)有限公司的amr反转录试剂盒进行cdna的合成。

(3)在得到cdna之后，进行pedreb3基因的pcr扩增，得到目的片段。

(4)pcr扩增得到目的片段后，将所述目的片段进行测序，得到pedreb3基因；在pcr扩增后优选对目的片段进行纯化，对于纯化的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的dna纯化试剂盒进行即可。

(5)纯化完成后，优选将所述纯化后的目的片段连接到pgem-teasy载体，导入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，经菌落pcr验证为阳性克隆后进行测序。

第二方面，本发明提供所述毛竹pedreb3蛋白的编码基因。

优选地，所述毛竹pedreb3蛋白的编码基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

第三方面，本发明提供含有毛竹pedreb3蛋白的编码基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物细胞或组织。

第四方面，本发明提供毛竹pedreb3蛋白、毛竹pedreb3基因或含有该基因的生物材料在植物抗寒性调控中的应用。

本发明所述植物包括但不限于拟南芥、毛竹。

优选地，所述植物抗寒性调控为通过提高所述植物中毛竹pedreb3基因的表达量，提高所述植物的抗寒性。

第五方面，本发明提供毛竹pedreb3蛋白、毛竹pedreb3基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。

优选地，所述转基因植物为抗寒性提高的转基因植物。

第六方面，本发明提供毛竹pedreb3蛋白、毛竹pedreb3基因或含有该基因的生物材料在植物育种中的应用。

优选地，所述育种目的是为提高植物抗胁迫能力(优选为抗寒能力)。pedreb3基因参与毛竹寒冷胁迫应答，寒冷胁迫可诱导该基因的表达。

第七方面，本发明提供一种提高植物抗寒能力的方法，包括：利用基因工程手段，在植物中过表达毛竹pedreb3基因；

其中，所述过表达的方式选自(1)-(5)中的一种或多种的组合：

(1)通过导入含有所述基因的质粒；

(2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

(3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

(4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

(5)通过导入增强子；

所述植物包括拟南芥、毛竹。

本发明中，携带有所述目的基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中。

所述方法具体为：将毛竹pedreb3基因转入到拟南芥植株中，获得过表达毛竹pedreb3基因的转基因植株；

优选地，将毛竹pedreb3基因构建到植物表达载体pcambia2300上，转化农杆菌，然后浸染拟南芥花序，筛选转基因植株。

在本发明的一个具体实施方式中，植物表达载体pcambia2300-pedreb3的构建方法如下：

根据添加的酶切位点，用ecori和hindiii同时对pedreb3-teasy阳性重组质粒和表达载体pcambia2300进行双酶切。对酶切产物进行琼脂糖凝胶检测后回收，用t4dna连接酶将pedreb3基因片段连接到pcambia2300载体中，构建表达载体pcambia2300-pedreb3。

转基因拟南芥的制备方法如下：

采用冻融法将重组表达载体转化农杆菌gv3101，并采用浸花法转化拟南芥。将收获的种子播种在50mg/l的卡那霉素(kan)的1/2ms培养基上进行筛选。提取t1代拟南芥叶片rna并反转录为cdna，用引物pedreb3-f、pedreb3-r进行pcr鉴定。

第八方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因植物在植物育种中的应用。

以上所述的育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

本发明的有益效果在于：本发明首次克隆得到了毛竹pedreb3基因并揭示了毛竹pedreb3基因的生物学功能，通过构建pedreb3基因表达载体，异源转化拟南芥，考察pedreb3对转基因拟南芥抗寒性的影响，发现过表达pedreb3的拟南芥的抗寒性显著提高。本发明为毛竹转基因研究提供有力工具，为毛竹抗性分子育种提供有价值的候选基因。

附图说明

图1为本发明实施例2中pedreb3基因克隆pcr产物电泳图(a)以及pcambia2300-pedreb3酶切产物电泳图(b)；其中，a中泳道1为pedreb3pcr产物，b中泳道1为pcambia2300-pedreb3酶切产物，m为dnamarker，a中的dnamarker为dl2000，b中的dnamarker为dl15000。

图2为本发明实施例4中pedreb3基因在盐胁迫的毛竹根和叶中的相对表达量。

图3为本发明实施例4中pedreb3基因在低温胁迫的毛竹根和叶中的相对表达量。

图4为本发明实施例5中转pedreb3基因拟南芥和野生型拟南芥在4℃低温胁迫下的mda含量、cat、pod和sod酶活性的变化，其中，ck为培养箱25℃正常生长条件下的拟南芥，wt为野生型拟南芥植株，oe-1、oe-5和oe-7分别为不同的转pedreb3基因拟南芥植株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1毛竹pedreb3基因的克隆

以毛竹叶片为材料，按照trizolrna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取叶片总rna，取1ngrna按照反转录试剂盒反转录成cdna，用rnase消化cdna产物。

根据毛竹基因组数据库(http://www.forestrylab.org/db/phepacbio/extractseq/phe/index.php)，用oligo7软件设计引物通过pcr扩增pedreb3基因并电泳检测(图1的a)。

引物序列如下：

上游引物pedreb3-f：

5′-ggaattcatggcgaagaactacccggccg-3′；

下游引物pedreb3-r：

5′-ccgaagcttttatgcatcagcaaac-3′。

聚合酶链式反应条件如下：

20μl反应体系：10×pcrbuffer2.0μl，2.5mmdntpmix2μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，cdna模板2.0μl，lataqdnapolymerse0.2μl，ddh2o11.8μl。

pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；59℃退火30s；72℃延伸1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。

回收产物连接到pgem-teasy载体，转化dh5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌斑pcr检测，阳性克隆进行测序(上海生工生物工程公司)，测序结果准确无误。pedreb3基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

实施例2植物表达载体pcambia2300-pedreb3的构建

用ecori和hindiii双酶切连接有pedreb3片段的pgem-teasy，与ecori和hindiii双酶切的表达载体pcambia2300-camv35s(promega公司，美国)构建重组质粒，酶切体系如下(50μl)：

37℃酶切4h；产物经过琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(axygen)回收质粒pcambia2300-camv35s大片段和pedreb3小片段。用t4dna连接酶连接两个回收产物，连接反应体系如下(20μl)：

4℃过夜连接反应，将连接产物全部转化dh5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑选单克隆，菌落pcr验证后，扩大培养，提取质粒pcambia2300-pedreb3，进行测序和酶切验证(图1的b)，植物重组表达质粒pcambia2300-pedreb3构建成功。

实施例3植物表达载体pcambia2300-pedreb3转化拟南芥1、冻融法转化农杆菌gv3101菌株

将1ng重组表达载体质粒pcambia2300-pedreb3，加入100μl感受态细胞gv3101中，冰浴10min后，将感受态细胞在液氮中速冻5min，迅速转移至37℃恒温水浴锅中水浴5min,后放置冰上5min，于离心管中加入600μl的lb液体培养基，在28℃摇床中震荡培养2-3h，复苏菌体。吸取60μl菌液涂布在含有卡那霉素抗性(50mg/ml)和利福平(50mg/ml)抗性的yep固体培养基中，于28℃恒温摇床中倒置平板培养2-3d左右，至长出白色菌落。挑取单克隆菌落pcr检测后，选取阳性克隆摇菌培养。

2、拟南芥花序浸染

将上述阳性克隆接种于10mlyep(50μg/ml利福平+100μg/ml卡那霉素)液体培养基中，28℃培养箱震荡培养(160rpm)12h，取2ml培养液转移至200mlyep(50μg/ml利福平+100μg/ml卡那霉素)中，进行大量培养，28℃培养箱震荡培养(160rpm)12h，培养液浓度od600达到1.8-2.2μg/ml，取50ml培养液，用50ml离心管，4℃5000rpm离心5min，用转化液(ms2.2g，5％蔗糖，调ph至5.8，加0.2％silwetl-77混合)剧烈悬浮，将沉淀稀释至1.0μg/ml。制备200ml左右，以备浸染拟南芥。将刚开花的拟南芥地上部浸泡于转化液中3min，用保鲜膜包裹植株，暗培养12-16h后，去除保鲜膜，将植株置于培养箱中培养，待采收种子。

3、纯合子筛选

将t0代拟南芥种子置于离心管中，加1ml70％酒精消毒5min后，再用2.6％次氯酸钠溶液1ml，消毒10min，然后用无菌水清洗5遍。将种子均匀播种于筛选培养基上1/2ms+100mg/l卡那霉素，经4℃低温纯化2d后置于人工气候培养箱中培养至长出4片子叶，将绿色的、正常生长的阳性植株移栽至土壤中栽培，待成熟后分单株收取t1代种子，应用同样的方法筛选t1代幼苗，统计t1代各株系阳性植株与非阳性植株的比例，并将比例约为3:1的株系的阳性植株移栽至土壤中培养，获得t2代种子。应用同样方法筛选t2代幼苗，获得t3代种子。

4、阳性植株的pcr鉴定

提取阳性拟南芥叶片rna，反转录成cdna，用引物pedreb3-f、pedreb3-r进行pcr鉴定，发现阳性植株中均含有pedreb3，表明pedreb3成功转入拟南芥。

实施例4盐和低温胁迫下毛竹pedreb3基因表达量分析

1、材料处理

毛竹种子采集于广西壮族自治区，置于恒温光照培养箱中，昼夜温度是25℃/18℃，光周期为光/暗16h/8h，培养至三个月左右，用200mmnacl、4℃低温分别模拟高盐和低温胁迫，分别取处理后0h、1h、3h、6h、12h、24h的幼嫩的根以及相同部位的叶片，在液氮中迅速冷冻，-80℃冷冻保存。

2、cdna模板的合成

利用trizol试剂提取毛竹实生苗根和叶片中的总rna，使用无rna酶的dnasei(tiandz)去除基因组dna，用紫外分光光度计测量a260与a280的比值及rna浓度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性，利用生物工程(大连)有限公司的amr反转录试剂盒合成cdna第一条链，合成产物置于-20℃冰箱保存。

3、实时荧光定量pcr

通过实时荧光定量pcr(qrt–pcr)，检测目的基因表达情况。tip41基因作为内参基因。

引物序列如下：

tip41-f：5'-aaaatcattgtaggccattgtcg-3'，

tip41-r：5'-actaaattaagccagcgggagtg-3'；

pedreb35-f:5'-tcaagaacccgagcaagacg-3'；

pedreb35-r:5'-cgtaggagccgagccagat-3'。

10μl反应体系如下：

反应程序：94℃1min；94℃10s，60℃10s，72℃10s，45个循环。

其他反应参数均为系统默认设置，每个反应设置3个生物学重复，用roche480仪分析数据，利用2^-δδct法分析3次生物学实验数据。

4、实验结果与分析

盐和低温胁迫处理后，分别检测pedreb3基因在毛竹实生苗根和叶片中的表达情况，结果如图2、图3所示：低温和盐处理后，pedreb3在根和叶片中的表达量均呈现先上升后下降的趋势，且在根中的表达量高于叶片中。低温处理下，根和叶片中pedreb3表达量在均处理后的12h达到最高，分别为处理前的26倍和105倍。盐胁迫下，叶片中pedreb3表达量总体变化不大，而在根中呈现明显的上升趋势，在处理1h后达到处理前的16.6倍。

实施例5转pedreb3基因拟南芥耐低温性能分析

对转pedreb3基因拟南芥t3代幼苗和野生型幼苗进行4℃低温胁迫处理，并进行生理指标检测。正常生长条件下，转基因和野生型拟南芥的mda含量和三种酶活性无显著性差异。低温处理后，转基因拟南芥cat和pod酶活性高于野生型且差异性显著；转基因型和野生型拟南芥sod酶活性差异性虽然不显著，但总体来说，转基因型sod酶活性要高于野生型；处理后mda含量明显升高，且野生型拟南芥显著高于转基因型(图4)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>国际竹藤中心

<120>毛竹pedreb3基因及其在植物抗寒性调控中的应用

<130>khp211116507.4

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>229

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metvallysasnproserlysthrgluhisglyglyglyglyglygly

151015

alaalaserasnalaalaglusercysserglyserglyserlysgln

202530

thrvalvalargglntyrlysglyvalargmetargsertrpglyser

354045

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65707580

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180185190

phealaserprolysphemetasppheilealaalaglyalathrpro

195200205

phesersersertrpglugluproglugluaspglygluleumetarg

210215220

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225

<210>2

<211>690

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atggtcaagaacccgagcaagacggagcacggcggtggtggcggtggcgcggcgagtaat60

gcggctgagtcgtgcagcggcagcgggagtaagcagacggtggtgaggcagtacaaaggg120

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cggatctggctcggctcctacgccacgcccgaggccgccgcgcgagcctacgacgctgcg240

ctcctctgcctcaagggttccgacgccgtgctcaacttcccgtcctcctcctcgtcctcg300

tcccaccccgtcgataatcgccactcggactcggcggcgccgcccgacatgtccccgagg360

tccatccagcgcgtcgccgccgcggcagccgcggccttcgactccgggatcgtcgacgac420

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agcgctgacgtccaggagcacgcgacgtcgtcgtctgccgcggccaacgctagctcgctg540

ccggagggggaggagctgtggaccgagctggacgcgttcgcgtcgcccaagttcatggat600

tttatcgccgccggcgccacgccgttctcgtcgtcgtgggaggagcccgaggaggacggc660

gagctcatgaggctgtggagcttctgctag690

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cgtaggagccgagccagat19