有抗凝血和抗血小板活性的多靶点化合物及制法和用途的制作方法

本申请是国际申请日为2015年08月05日、进入中国国家阶段日期：2018年02月02日、发明名称为“有抗凝血和抗血小板活性的多靶点化合物及制法和用途”、国际申请号为：pct/cn2015/086173、国家申请号为201580082185.8的发明的分案申请。本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗凝血和拮抗血小板gpⅱb/ⅲa受体的多靶点化合物及其制备方法和用途。
背景技术：
：血栓形成是血栓性疾病发生的早期事件，并贯穿于疾病发展的始末。血小板活化与凝血系统激活在血栓形成过程中起着重要的作用，两者在体内具有紧密的联系。凝血系统激活后产生的凝血酶，是一个强有力的血小板活化因子，血小板活化后又将促进凝血过程。防治血栓性疾病的原则在于改善高凝状态，防止血栓扩大及新血栓形成，溶解血栓，然后疏通或重建血流通路，以防止组织缺血、坏死。血栓性疾病的治疗方法包括抗栓、溶栓、介入疗法及手术治疗，其中抗栓治疗包括抗血小板和抗凝治疗，它作为血栓性疾病，尤其是心血管疾病治疗的基石备受关注。抗凝血药物通过影响凝血因子，从而阻止血液凝固过程，防止血栓形成；抗血小板药物通过抑制血小板黏附、聚集以及释放等功能抑制血栓形成。目前临床上应用的凝血酶抑制剂主要有低分子肝素和比伐卢定，血小板gpⅱb/ⅲa受体拮抗剂主要有拉米非班、替罗非班等。上述药物具有出血倾向等副作用，存在一定的应用局限性。更重要的是，上述药物都是通过单一靶点抑制血栓形成，目前临床上多将不同作用靶点的药物联用，从而达到增加疗效、降低副作用的临床效果。但是联合用药目前存在剂量匹配、出血、作用协调等问题，这大大影响了临床抗栓效果。因此有必要开发一种能够通过多靶点抑制作用抑制血栓形成的技术方案，从而实现通过施用一种药物同时对不同作用靶点同时起效的效果，避免联合用药所带来的问题。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种能够同时靶向作用于凝血酶和血小板gpⅱb/ⅲa受体的多靶点拮抗化合物。本发明提供了一种抗凝血酶和拮抗血小板gpⅱb/ⅲa受体的多靶点拮抗化合物，所述化合物具有如式(1)所示的结构：a-l-b-l’-c式(1)，其中a和b为与凝血酶结合位点，c为与血小板gpⅱb/ⅲa受体结合位点，l为第一连接基团，l’为第二连接基团。可选的，l’的结构如式(2)所示：((gly)n1-(ser)n2)n3式(2)其中n1为1、2或3或4；n2为0或1；n3为0、1、2或3。可选的，l’的结构如式(3)所示：(glu-ala-ala-ala-lys)n1式(3)，其中n1为0、1、2或3。可选的，l’的结构如式(4)所示：(arg-val-leu-ala-glu-ala)n1式(4)，其中n1为0、1、2或3。可选的，a的结构如式(5)所示：a1-a2-a3-a4式(5)，其中a1为d-phe；a2为pro或pip；a3为arg、lys、orn或har；a4为pro、d-pro或ser。可选的，b的结构如式(6)所示：b1-b2-b3-b4-b5式(6)其中b1为任意两个酸性氨基酸组成的二肽；b2为val、leu、ile、nle或phe；b3为hyp，ser，pro或一种n-甲基氨基酸；b4为任意两个酸性氨基酸组成的二肽；b5为选自tyr、trp、phe、leu、nle、ile、val、cha和pro中的一种的氨基酸，或者b5为含有tyr、trp、phe、leu、nle、ile、val、cha或pro中的至少一种氨基酸的二肽。可选的，c的结构如式(7)所示：cys-har-c1-asp-trp-pro-c2式(7)，其中c1为gly或ser，c2为cys或cys的-oh被-nh2取代后获得的结构，式(7)中的两个巯基之间形成二硫键。可选的，l的结构如式(8)所示：l1-l2-l3-l4-gly-asp-l5式(8)，其中l1为gly、ala、val或gly-gly；l2为gly或cys；l3为gly、gly-gly、gly-gly-gly或右旋氨基酸；l4为asn或gln；l5选自phe、tyr、phe的苯环被取代后获得的衍生物和tyr的苯环被取代后获得的衍生物中的一种。可选的，a-l-b选自seqidno.1至seqidno.3所示多肽序列中的一种。可选的，所述化合物具有如式(9)所示的结构：x-a-l-b-l’-c-y式(9)其中，x选自氢、一个或两个c1-c6的烷基、一个或两个c2-c10的酰基、苄氧羰基或叔丁氧羰基中的一种；y选自oh、c1-c6的烷氧基、氨基、一个或两个c1-c4的烷基取代的氨基中的一种。可选的，所述化合物包括seqidno.4至seqidno.7所示的多肽结构中的一种多肽序列。可选的，所述化合物选自seqidno.4至seqidno.7所示的多肽结构中的一种。本发明还提供了所述的凝血酶和血小板gpⅱb/ⅲa受体多靶点拮抗化合物的盐。可选的，所述盐为所述化合物的醋酸盐或所述化合物的三氟乙酸盐。本发明还提供了本发明所述的化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)采用固相合成法按照多肽序列从羧基端开始依次接入保护型氨基酸或片段，得到侧链全保护氨基酸多肽-wang树脂；(2)用酸解试剂对侧链全保护氨基酸多肽-wang树脂进行酸解得到线性多肽粗品；(3)对线性多肽粗品进行环化形成二硫键，然后采用高压制备液相进行纯化，得到多肽序列。本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物的活性成分包括本发明所述的化合物或者本发明所述的化合物的盐。可选的，所述药物组合物的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、悬浮剂或乳剂。本发明还提供了本发明所述的化合物或者本发明所述的化合物的盐在制备预防和治疗外周动脉血栓、动静脉旁路血栓形成的药物中的应用。本发明还提供了本发明所述的化合物或者本发明所述的化合物的盐在制备预防和治疗进展性缺血性脑卒中形成的药物中的应用；在制备用于治疗急性冠脉综合征、经皮冠状动脉介入治疗或pci放置冠脉内支架治疗中血栓形成的药物中的应用；在制备预防和治疗急性肺栓塞的药物中的应用；在制备预防和治疗器官组织移植中血栓形成的药物中的应用。本发明所提供的抗凝血酶和拮抗血小板gpⅱb/ⅲa受体的多靶点拮抗化合物具有直接、可逆、特异抗凝血酶功能，还具有抑制gpⅱb/ⅲa受体的作用，可以在较小的剂量下达到抗凝抗栓效果。同时降低出血风险、避免联合用药带来的剂量匹配、出血、作用协调等问题。附图说明图1为多肽1的质谱检测结果；图2为多肽2的质谱检测结果；图3为多肽3的质谱检测结果；图4为多肽4的质谱检测结果；图5为多肽2对fecl3刺激大鼠下腔静脉血栓形成的影响；图6为多肽2对fecl3刺激大鼠颈总动脉血栓形成的影响；图7为多肽2对大鼠aptt的影响；图8为多肽2对大鼠pt的影响；图9为动脉血栓模型试验流程图；图10为多肽2静脉单次给药对fecl3诱导的家兔股动脉血栓形成血栓干重的影响；图11为多肽2静脉单次给药15min对家兔股动静脉旁路血栓形成血栓干重的影响；图12为多肽2静脉单次给药对家兔血小板聚集功能的影响(血小板聚集抑制率)；图13为多肽2静脉单次给药对家兔aptt的影响；图14为多肽2静脉单次给药对家兔pt的影响；图15为多肽2静脉单次给药对家兔act的影响；图16为多肽2对凝血酶(1500u/kg)诱导的小鼠肺栓塞模型肺系数的影响。具体实施方式本发明公开了一种有抗凝血和抗血小板活性的多靶点化合物及制法和用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在本发明中，凝血酶表示一种由凝血酶前体(血浆中的必要成分)形成的蛋白质水解酶，能通过催化纤维蛋白原变成纤维蛋白而促使血液凝固。血小板gpⅱb/ⅲa受体为血小板表面的粘附性糖蛋白，为整合素家族中的一种。每个未激活的血小板表面大约有50000到80000个gpⅱb/ⅲa受体分子，是血小板表面数量最多的整合素。氨基酸指含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，本发明中氨基酸用本领域常规的缩写表示。酸性氨基酸指等电点小于7的氨基酸，包括天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)。n-甲基氨基酸指氨基酸上的氨基被甲基取代所获得的氨基酸。苯环取代后获得的衍生物指氨基酸上的苯环被直链或支链烷烃、卤素、烷氧基、酰胺基、酰氧基等取代所获得的氨基酸的衍生物。c1-c6的烷基指具有1-6个碳原子的烷基，c2-c10的酰基指具有2-10个碳原子的酰基。本发明的一种实施方式提供了一种抗凝血酶和拮抗血小板gpⅱb/ⅲa受体的多靶点拮抗化合物，所述化合物具有如式(1)所示的结构：a-l-b-l’-c式(1)，其中，其中a和b为与凝血酶结合位点，c为与血小板gpⅱb/ⅲa受体结合位点，l为第一连接基团，l’为第二连接基团。其中，所述第一连接基团l将a和b连接起来从而形成a-l-b结构，第二连接集团l’将a-l-b结构与c结构连接起来从而形成式(1)所示的结构。在本发明的一种实施方式中，a-l-b结构可以直接与c结构连接起来形成多靶点拮抗化合物。在本发明的一种实施方式中，l’可以为如式(2)所示的结构：((gly)n1-(ser)n2)n3式(2)在式(2)中n1为1、2、3或4；n2为0或1；n3为0、1、2或3。在一种优选的实施方式中，l’的结构为gly-gly-gly-gly-ser或gly-gly-gly-ser。在本发明的一种实施方式中，l’可以为如式(3)所示的结构：(glu-ala-ala-ala-lys)n1式(3)其中n1为0、1、2或3。在一种优选的实施方式中，l’的结构为glu-ala-ala-ala-lys。在本发明的一种实施方式中，l’可以为如式(4)所示的结构：(arg-val-leu-ala-glu-ala)n1式(4)其中n1为0、1、2或3。在一种优选的实施方式中，l’的结构为arg-val-leu-ala-glu-ala。在本发明的一种实施方式中，a的结构如式(5)所示：a1-a2-a3-a4式(5)其中a1为d-phe；a2为pro或pip；a3为arg、lys、orn或har；a4为pro、d-pro或ser。其中，pip指4-氨基哌啶-4-羧基，orn指鸟氨酸，har指高精氨酸。在一种优选的实施方式中，a的结构为d-phe-pro-arg-pro。在本发明的一种实施方式中，b的结构如式(6)所示：b1-b2-b3-b4-b5式(6)b1为任意两个酸性氨基酸组成的二肽；b2为val、leu、ile、nle或phe；b3为hyp，ser，pro或一种n-甲基氨基酸；b4为任意两个酸性氨基酸组成的二肽；b5为选自tyr、trp、phe、leu、nle、ile、val、cha和pro中的一种的氨基酸，或者b5为含有tyr、trp、phe、leu、nle、ile、val、cha和pro中的至少一种氨基酸的二肽。其中，nle表示正亮氨酸，hyp表示羟脯氨酸。在本发明的一种优选的实施方式中，b的结构为glu-glu-ile-pro-glu-glu-tyr-leu。可选的，c的结构如式(7)所示：cys-har-c1-asp-trp-pro-c2式(7)，其中c1为gly或ser，c2为cys或cys的-oh被-nh2取代后获得的结构，式(7)中的两个巯基之间形成二硫键，其中，har表示高精氨酸。可选的，l的结构如式(8)所示：l1-l2-l3-l4-gly-asp-l5式(8)其中l1为gly、ala、val或gly-gly；l2为gly或cys；l3为gly、gly-gly、gly-gly-gly或右旋氨基酸；l4为asn或gln；l5选自phe、tyr、phe的苯环被取代后获得的衍生物和tyr的苯环被取代后获得的衍生物中的一种。其中，l1优选为gly-gly，l2优选为gly，l3优选为gly，l4优选为asn，l5优选为phe。在优选的情况下，a-l-b选自seqidno.1至seqidno.3所示序列中的一种。在seqidno.1至seqidno.3所示的序列中，n端的苯丙氨酸均为d-型苯丙氨酸。seqidno.1:d-pheproargproglyglyglyglyasnglyasptyrgluaspilepro-gluglutyrleuseqidno.2:d-pheproargserglyglyglyglyasnglyaspphegluaspileprogluglutyrleuseqidno.3:d-pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluilepro-gluglutyrleu在本发明的一种实施方式中，所述化合物具有如式(9)所示的结构：x-a-l-b-l’-c-y式(9)其中，x选自氢、一个或两个c1-c6的烷基、一个或两个c2-c10的酰基、苄氧羰基或叔丁氧羰基中的一种；可选的，所述c1-c6的烷基可以为甲基或乙基。y选自oh、c1-c6的烷氧基、氨基、一个或两个c1-c4的烷基取代的氨基中的一种；在本发明的一种实施方式中，y为oh或nh2。在一种特别优选的实施方式中，当所述化合物具有seqidno.5所示的结构，且c末端的y为nh2时，与血小板gpⅱb/ⅲa受体结合时间较长，有较好的抑制血小板功能。其中，所述烷基可以为直链结构或支链结构，所述酰基可以为直链结构或支链结构，其中当x为两个c1-c6的烷基时，所述的两个c1-c6的烷基的种类可以相同或不同。其中当x为两个c2-c10的酰基时，所述的两个c2-c10的酰基的种类可以相同或不同。当y为两个c1-c4的烷基取代的氨基时，所述c1-c4的烷基取代的氨基的种类可以相同或不同。可选的，所述化合物包括seqidno.4至seqidno.7所示的多肽结构中的一种多肽序列。在seqidno.4至seqidno.7中，n末端的phe为d-构型苯丙氨酸。seqidno.4:d-pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluileprogluglutyrleuglyglyglyglysercysharglyasptrpprocysseqidno.5:d-pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluileprogluglutyrleuglualaalaalalyscysharglyasptrpprocysseqidno.6:d-pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluileprogluglutyrleucysharglyasptrpprocysseqidno.7:d-pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluileprogluglutyrleuargvalleualaglualacysharglyasptrpprocys在本发明的一种优选的实施方式中，所述化合物选自seqidno.4至seqidno.7所示的多肽结构中的一种。本发明的一个方面提供了所述抗凝血酶和拮抗血小板gpⅱb/ⅲa受体的多靶点拮抗化合物的盐。在本发明中，所述的盐为药物可接受的盐形式。“药物可接受的盐”指适合于与人或动物的组织接触，无过多的毒性、刺激、变态反应等。药物可接受的盐是本领域熟知的。这种盐可以在本发明的化合物肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将游离的碱或酸与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。代表性酸加成盐包括但不限于醋酸、三氟乙酸、二己酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、草酸盐、丙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐。优选的，所述盐为所述化合物的醋酸盐、三氟乙酸盐或盐酸盐，特别优选的，所述盐为醋酸盐或三氟乙酸盐。本发明的一个方面提供了所述抗凝血酶和拮抗血小板gpⅱb/ⅲa受体多靶点拮抗化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)采用固相合成法按照多肽序列从羧基端开始依次接入相对应的保护型氨基酸或片段，得到侧链全保护氨基酸多肽-wang树脂；(2)用酸解试剂对侧链全保护氨基酸多肽-wang树脂进行酸解得到线性多肽粗品；(3)对线性多肽粗品进行环化形成二硫键，然后采用高压制备液相进行纯化，得到多肽序列。本发明的一个方面还提供了一种药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括本发明所述的抗凝血酶和拮抗血小板gpⅱb/ⅲa受体的多靶点拮抗化合物或者所述化合物的盐。可选的，所述药物组合物还包括药物可接受的载体。所述药物组合物的形式可以为注射液或微乳液。可以根据药物组合物的形式选择使用本领域常用的药物可接受的载体物质。在所述药物组合物中，活性成分的含量不低于85％。所述载体物质的种类包括但不限于生理盐水。本发明所述的药物组合物可以用于治疗和/或预防血栓性疾病，主要作用为抗凝、抗血栓和抗血小板聚集。将以所述抗凝血酶和拮抗血小板gpⅱb/ⅲa受体的多靶点拮抗化合物和/或所述化合物的盐为活性成分的药物施用于受试者。本发明的一个方面还提供了本发明所述的化合物或者本发明所述的化合物的盐在制备预防和治疗外周动脉血栓、动静脉旁路血栓形成的药物中的应用。本发明的一个方面还提供了本发明所述的化合物或者本发明所述的化合物的盐在制备预防和治疗进展性缺血性脑卒中形成的药物中的应用。本发明的一个方面还提供了本发明所述的化合物或者本发明所述的化合物的盐在制备预防和治疗急性肺栓塞的药物中的应用。本发明还提供了本发明所述的化合物或者本发明所述的化合物的盐在制备预防和治疗器官组织移植中血栓形成的药物中的应用；在制备用于治疗急性冠脉综合征、经皮冠状动脉介入治疗或pci放置冠脉内支架治疗中血栓形成的药物中的应用；在在制备预防和治疗急性肺栓塞的药物中的应用；在制备预防和治疗器官组织移植中血栓形成的药物中的应用。本发明所述的应用包括制备含有本发明所述的化合物的药物，所述药物的剂型包括但不限于冻干粉针、注射液、微乳、微球、胶束等剂型。所述抗血栓形成的药物包括用于治疗或预防外周动脉闭塞性疾病(通过抗凝、抗血栓、抗血小板聚集发挥作用)、进展性缺血性脑卒中、急性冠脉综合症等疾病的药物。此外所述抗血栓形成药物也可以包括预防血液透析患者在vaf和vag手术中动静脉瘘血栓的形成。下面通过实施例对本发明的具体实施方式进行进一步说明，以下实施例中所涉及的仪器和试剂均可以通过购买市售产品的方式获得。以下实施例中部分实验材料见表1，仪器设备见表2。表1表2名称生产厂家型号电子天平赛多利斯科学仪器(北京)有限公司bsa124s-cw离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司sc-3610精密微量加样器日本nichipet产品5μl,100μl,200μl,1000μl血小板聚集凝血因子分析仪北京中勤世帝科学仪器有限公司lg-paber-i出血时间测定器江苏康健医疗用品有限公司5mm宽1mm深温度测定仪自制本发明提供的有抗凝血和抗血小板活性的多靶点化合物及制法和用途中所用原料或辅料均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1实施例1用于说明根据本发明的一种实施方式的化合物及其制备过程。1、片段ⅰfmoc-gly-gly-gly-gly-oh的制备：称取替代度为0.7mmol/g的fmoc-gly-2-cl-trt-树脂(23.5g，16.5mmol)采用2.5l25％pip/dmf溶液去fmoc保护25分钟，过滤后树脂分别用dmf，dcm交替洗涤3次，每次不少于1分钟。加入fmoc-gly-oh(14.8g，50mmol)，30℃下搅拌反应4小时，以茚三酮法检测反应终点，反应完成后，过滤后树脂分别用dmf、dcm交替洗涤3次。重复上述步骤2次，连接另外2个gly，最终得到fmoc-gly-gly-gly-gly-2-cl-trt-树脂。将得到的树脂溶于5l的30％六氟异丙醇/dcm溶液，搅拌反应2小时，过滤收集滤液，30℃真空干燥10小时，得到fmoc-gly-gly-gly-gly-oh7.2g，收率为96％，纯度95.6％，msm/z:469(m+1)。2、片段ⅱfmoc-cys(trt)-har-gly-asp(otbu)-trp-pro-cys(trt)-wang树脂的制备称取fmoc-cys(trt)-wang树脂10g(荷载量1.0mmol/g,10mmol)置于固相反应器中，加入25％的pip/dmf溶液150ml脱保护，25℃下搅拌30分钟，反应完毕后，将树脂分别用dmf，dcm交替洗涤3次。将fmoc-pro-oh(10.1g，30mmol)，hobt(4.05g，30mmol)溶于150mldmf中，加入反应器中，在0-5℃下向反应液中缓慢加入dic(3.78g，30mmol)，再加入脱保护后的氨基酸树脂，30℃下搅拌反应3小时，以茚三酮法检测反应终点，反应完成后，过滤后树脂分别用dmf、dcm交替洗涤3次。重复上述步骤，按照肽序列依次偶联fmoc-trp-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-har-oh和fmoc-cys(trt)-oh得到fmoc-cys(trt)-har-gly-asp(otbu)-trp-pro-cys(trt)-wang树脂，检测替代度为0.6mmol/g。3、线性多肽1树脂的合成：线性多肽1树脂为：fmoc-d-phe-pro-arg(pbf)-pro-gly-gly-gly-gly-asn(trt)-gly-asp(otbu)-phe-glu(otbu)-glu(otbu)-ile-pro-glu(otbu)-glu(otbu)-tyr(otbu)-leu-gly-gly-gly-gly-ser(trt)-cys(trt)-har-gly-asp(otbu)-trp-pro-cys(trt)-wang取fmoc-cys(trt)-har-gly-asp(otbu)-trp-pro-cys(trt)-wang树脂20g(替代度0.6mmol/g，12mmol)，加入25％的pip/dmf溶液300ml脱保护，25℃下搅拌30分钟，反应完毕后，将树脂分别用dmf，dcm交替洗涤3次。将fmoc-ser(trt)-oh(20.5g，36mmol)，hobt(4.86g，36mmol)溶于150mldmf中，加入反应器中，在0-5℃下向反应液中缓慢加入dic(4.53g，36mmol)，再加入脱保护后的氨基酸树脂，30℃下搅拌反应3小时，以茚三酮法检测反应终点，反应完成后，过滤后树脂分别用dmf、dcm交替洗涤3次。采用上述方法依次接入fmoc-gly-gly-gly-gly-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-tyr(otbu)-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-asn(trt)-oh，fmoc-gly-gly-gly-gly-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-d-phe-oh得到侧链全保护氨基酸多肽1-wang树脂。4、线性多肽1粗品的制备：将步骤3制备的侧链全保护氨基酸多肽1-wang树脂20g加入到酸解剂(三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝190ml：5ml：5ml)中，在25℃下反应2小时，过滤树脂，用少量三氟乙酸洗涤树脂，合并滤液。在剧烈搅拌下将滤液缓慢加入1.1l预冷却的乙醚内，出现白色沉淀，静置1小时后，抽滤，并用冰乙醚洗涤滤饼5次，真空干燥得到粗品6g。5、多肽1的二硫键的形成与纯化：多肽1结构式如下所示(seqidno.4所示的多肽序列)：d-pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluileprogluglutyrleuglyglyglyglysercysharglyasptrpprocys。将10g步骤4制备的线性多肽1溶于200ml纯净水中，搅拌下缓慢滴加5％i2溶液，hplc检测反应，反应完全后采用高效制备液相纯化目标产物，冻干得到最终产品多肽1，质量为1g。多肽1的质谱检测结果如图1所示。实施例2按照与实施例1相同的方法制备多肽化合物2，区别仅在于l’片段为glualaalaalalys获得多肽2，产品质量为1.2g。多肽2的质谱检测结果如图2所示。多肽2结构式如下所示(seqidno.5所示的多肽序列)：d-pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluileprogluglutyrleuglualaalaalalyscysharglyasptrpprocys实施例3按照与实施例1相同的方法制备多肽化合物3，区别仅在于去掉glyglyglyglyser片段(即l’片段)获得多肽3，产品质量为1.5g。多肽3的质谱检测结果如图3所示。多肽3结构式如下所示(seqidno.6所示的多肽序列)：d-pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluileprogluglutyrleucysharglyasptrpprocys实施例4按照与实施例1相同的方法制备多肽化合物4，区别仅在于l’片段为argvalleualagluala获得多肽4，产品质量为0.86g。多肽4的质谱检测结果如图4所示。多肽4结构式如下所示(seqidno.7所示的多肽序列)：d-pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluileprogluglutyrleuargvalleualaglualacysharglyasptrpprocys测试例1-4测试例1-4用于说明实施例1-4中制备的多肽1-4抗人凝血、抗人血小板聚集的作用。抽健康志愿者静脉血30ml，将血液迅速注入含有3ml3.8％枸橼酸钠的塑料管中，轻轻上下颠倒混匀。将抽取的血液810rpm离心8min得到富血小板血浆(plateletrichplasma,prp)，取出prp，再将血样3510rpm离心8min得到贫血小板血浆(plateletpoorplasma，ppp)。1、凝血酶原时间(pt)、凝血酶时间(tt)、活化部分凝血酶时间(aptt)测定：按照试剂盒操作要求进行试剂重建及保存，每个ppp各取受检10份于测试杯中，分别加入生理盐水、多肽1、多肽2、多肽3、多肽4各10μl，再分别加入pt、tt、aptt试剂，立即开始测试。多肽1-4对人体外凝血功能的影响见表3(n代表例数)。表3多肽1-4对人体外凝血功能的影响表3的结果显示：多肽1-4四个化合物都可以影响人体外凝血功能，不同程度延长pt、aptt和tt，终浓度为1×10-6mol/l的各个化合物中，多肽2延长pt、aptt的倍数最大。2、血小板聚集测定：血小板聚集仪开机预热30min，ppp校正，测试杯中加入270μlprp，分别加入10μl多肽1、多肽2、多肽3、多肽4(1.0×10-7mol/l)和/或20μl的生理盐水，总体积300μl。温浴5min后，再加入诱导剂adp5μl、肾上腺素5μl，开始测试。5min后测试完毕，记录5min内最大聚集率，并打印数据及图。根据测试结果根据计算公式1计算不同浓度的多肽1-4对人血小板聚集的抑制率，多肽1-4对adp诱导人体外血小板聚集功能的影响列于表4。计算公式如下：表4多肽1-4对adp诱导人体外血小板聚集功能的影响受试品浓度(mol/l)血小板聚集率(％)血小板聚集抑制率(％)生理盐水—73.39—多肽1(n＝8)3×10-639.1047.07多肽2(n＝7)3×10-626.1266.70多肽3(n＝3)3×10-657.8526.35多肽4(n＝3)3×10-661.2818.88多肽1(n＝8)1×10-54.9092.04多肽2(n＝7)1×10-50100多肽3(n＝3)1×10-535.4047.07多肽4(n＝3)1×10-554.8027.97表4的结果显示：多肽1、多肽2、多肽3、多肽4四个化合物都可以影响adp诱导的人体外血小板聚集，终浓度为3×10-6mol/l的依替巴肽可完全抑制adp诱导的人体外血小板聚集，抑制率为100％，而终浓度为3×10-6mol/l、1×10-5mol/l的多肽1、多肽2、多肽3、多肽4四个化合物中，多肽2抑制adp诱导的人体外血小板聚集作用最强。测试例5本测试例用于说明实施例2中制备的多肽2抗大鼠血栓形成的效果。1.实验动物：健康、成年sd大鼠160只，雄性，体质量250g～300g，购自北京维通利华公司。动物生产许可证号：scxk(京)2012-0001。2.受试药品：多肽2，肽含量为97.21％。依诺肝素钠注射液aventisintercontinental，赛诺菲(北京)制药有限公司，分装批准文号：国药准字j20090094。批号：2sn76，0.4ml:4000axaiu×2支。注射用比伐卢定，西安新通药物研究有限公司，分子量2180.2，纯度96.55％，含量69.44％。3.实验方法3.1试剂的配制及材料的制备方法3.1.1试剂的配制3.1.1.1受试品多肽2溶液配制：精确称取多肽2200mg，生理盐水制成10mg/ml的母液，每天实验前根据动物体重，取相应的母液配制成需要的剂量。3.1.1.220％乌拉坦：精密称取乌拉坦20g加蒸馏水定容至100ml。3.1.1.33.8％枸橼酸钠：精密称取二水枸橼酸钠4.33g加生理盐水定容至100ml配制成3.8％的溶液备用。3.1.2材料的制备3.1.2.1铝箔纸：用直尺测量剪成2.5cm×2.5cm，编号并称重。3.1.2.235％三氯化铁溶液：取三氯化铁35g，溶于100ml蒸馏水中。3.2.分组及给药大鼠160只。随机分组，每组5-10只。1)模型对照组：静脉注射同体积生理盐水；2)多肽2的6个剂量组，以1.5mg/kg+3.75mg/kg/h为起始，向下降为1mg/kg+2.5mg/kg/h，0.5mg/kg+1.25mg/kg/h，0.25mg/kg+0.75mg/kg/h，0.125mg/kg+0.375mg/kg/h，0.041mg/kg+0.125mg/kg/h，3)阳性对照依诺肝素5个剂量组，以30u/kg+45u/kg/h为起始，向上加为60u/kg+60u/kg/h，30u/kg+120u/kg/h，90u/kg+120u/kg/h，60u/kg+240u/kg/h，4)阳性对照比伐卢定5个剂量组，以0.5mg/kg+2mg/kg/h为起始，向下降为0.35mg/kg+1.3mg/kg/h，0.17mg/kg+0.65mg/kg/h，0.08mg/kg+0.325mg/kg/h，实验前12小时动物禁食不禁水。(如表5所示)。按大鼠公斤体重计量，将首剂量药物溶于2ml生理盐水中一次性推注，维持剂量溶于9ml生理盐水中，置于双道微量注射泵上，以0.1ml/min滴速90min内滴完。假手术组给同样体积生理盐水。4.实验操作4.1大鼠手术准备大鼠于实验前一晚禁食，自由饮水。静脉注射20％乌拉坦溶液5ml/kg麻醉，仰卧位固定，分离两侧颈总动脉、颈外静脉和下腔静脉。颈外静脉插管用于给药；一侧颈总动脉插管用于取血测定凝血功能pt，aptt；一侧颈总动脉用于建立动脉血栓模型；下腔静脉用于静脉血栓模型。4.2凝血功能测定分别于给药前，给药60min，停药前取血测定活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintim，aptt)，凝血酶原时间(prothrombintime，pt)。血样3510rpm离心8min得到贫血小板血浆(plateletpoorplasma,ppp)。按照试剂盒操作要求进行试剂重建及保存，每个血样于测试杯中，再分别加入pt、aptt试剂，立即开始测试，测试结束记录结果。4.3动脉血栓模型负荷量给药、维持给药30min后，将直径3mm，浸泡35％fecl3滤纸敷于颈总动脉下，其下置小片塑料薄膜(2.5×2.0cm)，用于保护周围组织。在动脉远心端用温度探头检测温度，考察自刺激开始至温度下降2.5度所需要的时间为血管阻塞时间。4.4静脉脉血栓模型负荷量给药、维持给药30min后，将直径3mm、吸有35％fecl3溶液的小片滤纸敷于下腔静脉下，其下置小片塑料薄膜(2.5×2.0cm)，用于保护周围组织。15min后去掉滤纸条。再观察45min后用温生理盐水冲洗血管及局部组织，将被包裹的血管剪下，将血管壁粘附的血栓剥离到锡箔纸上称湿重，室温过夜称干重。持续给药至实验结束。5.检测指标5.1凝血功能测定：分别于给药前0min，给药60min，停药时采血用血小板凝血因子分析仪测定凝血功能(pt，aptt)，act。5.2阻塞时间从放置fecl3开始到动脉表明温度下降2.5℃的时间为血管阻塞时间，反映血栓形成情况。5.3血栓重量实验结束后，剪下形成血栓的血管段，称其湿重，室温下过夜测得血栓干重。计算血栓形成抑制率。表5多肽2和对照药剂量分组编号组别剂量(mg/kg+mg/kg/h)n1模型——102依诺肝素一组30+45u63依诺肝素二组60+60u54依诺肝素三组30+120u55依诺肝素四组90+120u66依诺肝素五组60+240u107比伐卢定一组0.08+0.32568比伐卢定二组0.17+0.6569比伐卢定三组0.35+1.3810比伐卢定四组0.5+2511多肽2一组0.041+0.1251012多肽2二组0.125+0.3751013多肽2三组0.25+0.75914多肽2四组0.5+1.251015多肽2五组1+2.5916多肽2六组1.5+3.7510表6不同剂量多肽2和对照药静脉维持给药对fecl3诱导的大鼠血栓形成的影响表7不同剂量多肽2和对照药静脉维持给药对大鼠凝血功能的影响结果由表6和表7的结果可知，多肽2可剂量依赖性地抑制fecl3诱导的大鼠下腔静脉血栓形成，抑制fecl3诱导的大鼠颈总动脉血栓形成，延长大鼠aptt和pt。图5为多肽2对fecl3刺激大鼠下腔静脉血栓形成的影响，与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。图6为多肽2对fecl3刺激大鼠颈总动脉血栓形成的影响。动脉阻塞时间变化倍数。与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01。图7多肽2对大鼠aptt的影响。图8多肽2对大鼠pt的影响。测试例6本测试例用于说明实施例2中制备的多肽2静脉维持给药对家兔血栓抑制的药效学实验。1.实验动物和材料1.1实验动物：健康成年家兔10只，雄性，体重2～2.5kg，由西安市迪乐普生物资源开发有限公司提供，动物生产许可证号：scxk(陕)2006-001。受试药品：多肽2，肽含量为97.21％。阳性对照品：依诺肝素钠注射液aventisintercontinental，赛诺菲(北京)制药有限公司，分装批准文号：国药准字j20090094。批号：2sn76，0.4ml:4000axaiu×2支。1.2实验材料，见表8。表8名称生产厂家规格批号戊巴比妥钠美国sigma公司25g/瓶090205枸橼酸钠天津市百世化工有限公司—200804180.9％nacl注射液西安京西双鹤药业有限公司250ml/瓶11806471肝素钠注射液天津生物化学制药有限公司2ml12500iμ20120202磷酸二腺苷sigma1g/瓶购于2009.12.10盐酸肾上腺注射液上海禾丰制药有限公司1mg/ml20090701pt测定试剂盒陕西方舟生物科技有限公司10×2ml20140703tt测定试剂盒陕西方舟生物科技有限公司10×2ml20140702appt测定试剂盒陕西方舟生物科技有限公司10×2ml201407021.3受试品多肽2溶液配制：取多肽2，电子天平精密称取200mg，生理盐水制成10mg/ml的母液。充分混匀，每5ml分装，-20℃保存。试验时按家兔的体重计算取适量稀释使用。3％戊巴比妥钠：精密称取戊巴比妥钠3g加蒸馏水定容至100ml。3.8％枸橼酸钠：精密称取二水枸橼酸钠4.33g加生理盐水定容至100ml配制成3.8％的溶液备用。肾上腺素：取1.319ml原液定容至100ml的生理盐水中配制成60μm的溶液，4℃冰箱保存，用前分装。adp：精密称取adp14.3mg溶于5ml的生理盐水中得到6000μmol/l的adp溶液，4℃保存，实验前加生理盐水将其稀释成600μmol/l备用。1.4材料的制备铝箔纸：用直尺测量剪成2.5cm×2.5cm，编号并称重；非吸收性外科缝线：用直尺量取8cm长，称重。50％三氯化铁溶液：取三氯化铁50g，溶于100ml蒸馏水中。2.分组及给药：家兔10只。随机分为3组，每组2-3只。1)假手术组(ns)：静脉注射同体积生理盐水，手术方法同上；2)多肽2给药组8.0mg/kg+20.0mg/kg/h；3)阳性对照依诺肝素组50u/kg+150u/kg/h。按家兔公斤体重计量，将首剂量药物溶于2ml生理盐水中一次性推注，维持剂量溶于90ml生理盐水中，置于双道微量注射泵上，以1ml/min滴速90min内滴完。假手术组给同样体积生理盐水。3.实验操作3.1家兔手术准备：家兔送到实验室适应1天后，首先进行筛选。耳中动脉采血进行血常规及aptt测定，选择血象正常，aptt在16s～28s之间的家兔进行实验。试验家兔于实验前一晚禁食，自由饮水。静脉注射3％戊巴比妥钠溶液1ml/kg麻醉，仰卧位固定，分离一侧颈总动脉、颈外静脉，一侧股动脉、股静脉及一侧前肢静脉。前肢静脉插管用于给药；左侧股静脉插管用于取血，以备测定血小板聚集率；股动脉用于动脉血栓模型；颈总动脉、颈外静脉用于动静脉旁路血栓模型。3.2动脉血栓(at)模型：给药的同时将吸有50％fecl3溶液的小片滤纸(1cm×1.5cm)敷于右侧股动脉上，其下置小片塑料薄膜(2.5×2.0cm)，用于保护周围组织。10min后去掉滤纸条，用温生理盐水冲洗血管及局部组织，将被包裹的血管剪下，将血管壁粘附的血栓剥离到锡箔纸上称湿重，室温过夜称干重。3.3实验流程：将家兔前肢和两侧股动脉分离后，稳定10min，开始给药。给药的同时用50％fecl3滤纸包裹股动脉建立at模型，包裹15min后去除。连续观察给药后120min，试验全部结束。4.检测指标4.1血小板聚集率：给药前0min，给药30min，60min，90min，停药60min，120min，180min从股静脉取血2.7ml，迅速注入含有0.3ml3.8％枸橼酸钠的离心管中，充分混匀。810rpm(100g)离心8min，取prp，3500rpm(1863g)离心8min，取ppp做血小板聚集。分别于给药前(0min)，给药后5min，15min采血测定血小板聚集率，计算血小板聚集抑制率。计算公式如下：4.2凝血功能测定：分别于给药前0min，给药30min，60min,90min,停药60min,120min,180min采血用血小板凝血因子分析仪测定凝血功能(pt,tt,aptt)。血样3510rpm离心8min得到贫血小板血浆(plateletpoorplasma,ppp)。按照试剂盒操作要求进行试剂重建及保存，每个血样于测试杯中，再分别加入pt、tt、aptt试剂，立即开始测试，测试结束记录结果。4.3act的测定：给药前0min，给药5min，15min取全血，加白陶土，37℃水浴锅内，记录全血凝固时间。4.4血栓重量：实验结束后，剪下形成血栓的血管段，称其湿重，室温下过夜测得血栓干重。计算血栓形成抑制率。公式如下：5.试验结果：5.1多肽2静脉维持给药对fecl3诱导的家兔股动脉血栓形成的影响结果表明，多肽28.0mg/kg+20.0mg/kg/h给药，对fecl3诱导的家兔股动脉血栓形成的影响，依诺肝素50u/kg+150u/kg/h给药血栓抑制率低于多肽2，与生理盐水组相比，无统计学差异(p>0.05)。结果见表9。表9多肽2静脉维持给药对家兔股动脉血栓形成的影响5.2多肽2静脉维持给药对家兔血小板聚集功能的影响结果表明，多肽2静脉维持给药可以抑制家兔血小板聚集。停药后随着时间的延长，对血小板聚集的抑制作用逐渐减弱。依诺肝素50u/kg+150u/kg/h给药血小板聚集抑制率低于多肽2。结果见表10。表10多肽2静脉单次给药对家兔血小板聚集功能的影响(血小板聚集抑制率，％，)组别剂量(mg/kg+mg/kg/h)n给药30min给药60min给药90min空白组-212.1±17.112.1±17.113.1±18.6依诺肝素50u+150u126.70.0035.27多肽28.0+20.0261.0±14.172.1±9.655.8±7.7组别剂量(mg/kg+mg/kg/h)n停药60min停药120min停药180min空白组-222.1±31.213.9±19.7-依诺肝素50u+150u10.0041.9-多肽28.0+20.0214.1±1.57.5±1.847.5±2.55.3多肽2静脉维持给药对家兔凝血功能的影响结果见表11-14，表11为多肽2静脉维持给药对家兔凝血功能aptt的影响(s，)；表12为多肽2静脉维持给药对家兔凝血功能pt的影响(s，)；表13为多肽2静脉维持给药对家兔凝血功能tt的影响(s，)；表14为多肽2静脉维持给药对家兔act的影响(s，)。表11-14中，剂量单位为(mg/kg+mg/kg/h)。结果表明，多肽2静脉维持给药可以抑制家兔血小板聚集。停药后随着时间的延长，对血小板聚集的抑制作用逐渐减弱。表11表12表13表14以上结果说明多肽2推注(iv)+滴注(vd)8.0mg/kg+20.0mg/kg90min可以抑制家兔血小板聚集，影响家兔凝血功能，延长aptt、pt、tt和act。抑制股动脉血栓形成。多肽2与依诺肝素抑制股动脉血栓和抑制血小板聚集作用相当时，依诺肝素对aptt延长作用大于多肽2，说明依诺肝素出血风险大于多肽2。测试例7本测试例用于说明静脉单次给药家兔体体内抗血栓形成暨抗凝抗血小板聚集实验。实验动物：健康成年家兔48只，雄性，体重2-2.5kg，由西安市迪乐普生物资源开发有限公司提供，动物合格证号：scxk(陕)2006-001。受试药品：多肽2，肽含量为97.21％。阳性药：依诺肝素与比伐卢定。【实验方法】1.分组及给药：家兔48只。随机分为6组，每组8只。1)假手术组(ns)：静脉注射同体积生理盐水；2)阳性对照比伐卢定组(6mg/kg)；3)阳性对照依诺肝素组(200u/kg)；4)多肽2小剂量组(3.0mg/kg)；5)多肽2中剂量组(6.0mg/kg)；6)多肽2大剂量组(12.0mg/kg)。多肽2采取静脉单次给药方式。按家兔公斤体重计量，将药物溶于2ml生理盐水中一次性推注。假手术组给同样体积生理盐水。2.实验操作2.1家兔手术准备：家兔送到实验室适应1天后，首先进行筛选。耳中动脉采血进行血常规及aptt测定，选择血象正常，aptt在16s～28s之间的家兔进行实验。试验家兔于实验前一晚禁食，自由饮水。静脉注射3％戊巴比妥钠溶液1ml/kg麻醉，仰卧位固定，分离一侧颈总动脉、颈外静脉，一侧股动脉、股静脉及一侧前肢静脉。前肢静脉插管用于给药；左侧股静脉插管用于取血，以备测定血小板聚集率；股动脉用于动脉血栓模型；颈总动脉、颈外静脉用于动静脉旁路血栓模型。2.2动静脉旁路血栓(avst)模型：动静脉分流器由两个套管组成，外管长约8cm，内径7.9mm，内管长约2.5cm，内径4.8mm，在聚乙烯管内放入长约8cm的丝线，充满50μ/ml的肝素钠溶液，将一头插入左侧股动脉，另一头插入右侧股静脉。给药30s放开血流，血液从左侧动脉流至聚乙烯管内，返回右侧静脉；15min后中断血流，迅速取出丝线放于铝箔纸(大小为2.5cm×2.5cm)上，称湿重，室温过夜，称干重。2.3动脉血栓(at)模型：给药的同时将吸有50％fecl3溶液的小片滤纸(1cm×1.5cm)敷于右侧股动脉上，其下置小片塑料薄膜(2.5×2.0cm)，用于保护周围组织。10min后去掉滤纸条，用温生理盐水冲洗血管及局部组织，将被包裹的血管剪下，将血管壁粘附的血栓剥离到锡箔纸上称湿重，室温过夜称干重。2.4实验流程：实验流程如图9，将犬前肢和两侧股动脉分离后，稳定10min，开始给药。给药的同时用50％fecl3滤纸包裹股动脉建立at模型，包裹10min后去除；建立avst模型，40min后取出。连续观察给药后120min，试验全部结束。3.检测指标3.1血小板聚集率：从股静脉取血2.7ml，迅速注入含有0.3ml3.8％枸橼酸钠的离心管中，充分混匀。810rpm(100g)离心8min，取prp，3500rpm(1863g)离心8min，取ppp做血小板聚集。分别于给药前(0min)，给药后5min，15min采血测定血小板聚集率，计算血小板聚集抑制率。计算公式如下：3.2凝血功能测定：分别于给药前0min，给药5min，15min采血用血小板凝血因子分析仪测定凝血功能(pt、tt、aptt)。血样3510rpm离心8min得到贫血小板血浆(plateletpoorplasma,ppp)。按照试剂盒操作要求进行试剂重建及保存，每个血样于测试杯中，再分别加入pt、tt、aptt试剂，立即开始测试，测试结束记录结果。3.3act的测定：给药前0min，给药5min，15min取全血，加白陶土，37℃水浴锅内，记录全血凝固时间。3.4血栓重量：实验结束后，剪下形成血栓的血管段，称其湿重，室温下过夜测得血栓干重。计算血栓形成抑制率。4实验结果4.1多肽2静脉单次给药对fecl3诱导的家兔股动脉血栓形成的影响，结果见图10和表15。。不同浓度的多肽2静脉单次给药，可减轻fecl3诱导的家兔股动脉血栓干重，抑制fecl3诱导的家兔股动脉血栓形成。与生理盐水组相比，多肽2小剂量3.0mg/kg组统计学有显著差异(p<0.05),多肽2中剂量6.0mg/kg、大剂量12.0mg/kg组统计学有极显著差异(p<0.01)，多肽2中剂量组抗动脉血栓效果优于比伐卢定组。表15多肽2静脉单次给药对fecl3诱导的家兔股动脉血栓形成的影响组别剂量(mg/kg)n血栓干重(mg)血栓抑制率(％)生理盐水组—82.9±1.9—比伐卢定6.081.5±0.9*48.20依诺肝素200u71.5±0.4*48.26多肽2小剂量3.061.4±0.5*52.99多肽2中剂量6.081.2±0.7**56.90多肽2大剂量12.081.1±0.9**60.82与生理盐水组相比，*p<0.05，**p<0.01。4.2多肽2静脉单次给药对家兔股动静脉旁路血栓形成的影响如图11和表16结果所示，不同浓度的多肽2静脉单次给药，可以减轻家兔股动静脉旁路血栓干重，抑制家兔股动静脉旁路血栓形成。与生理盐水组相比，多肽2中剂量6.0mg/kg、大剂量12.0mg/kg组统计学有极显著差异(p<0.01)，多肽2中剂量组抗动静脉旁路血栓效果明显优于比伐卢定和依诺肝素组。表16多肽2静脉单次给药15min对家兔股动静脉旁路血栓形成的影响组别剂量(mg/kg)n血栓干重(mg)血栓抑制率(％)生理盐水组-823.6±7.0—比伐卢定6.0820.8±6.311.86依诺肝素200u717.3±6.526.88多肽2小剂量3.0620.2±4.314.48多肽2中剂量6.0813.5±5.3**42.80多肽2大剂量12.0810.6±6.8**55.24与生理盐水组相比，*p<0.05，**p<0.01。4.3多肽2静脉单次给药对家兔血小板聚集功能的影响结果如图12和表17所示，多肽2各剂量组静脉单次给药可抑制家兔血小板聚集。停药后随着时间的延长，对血小板聚集的抑制作用逐渐减弱。多肽2各剂量组静脉单次给药5min，可不同程度地抑制家兔血小板聚集。与生理盐水组相比，多肽2中剂量6.0mg/kg、大剂量12.0mg/kg组统计学有显著差异(p<0.05)，多肽2中剂量组抗血小板作用明显优于比伐卢定和依诺肝素组。给药15min，对家兔血小板聚集的抑制作用逐渐减弱。与生理盐水组相比，多肽2大剂量12.0mg/kg有显著差异(p<0.05)。表17多肽2静脉单次给药对家兔血小板聚集功能的影响(血小板聚集抑制率，％，)组别剂量(mg/kg)n给药5min给药15min生理盐水-80.6±5.83.2±6.0比伐卢定6.085.2±5.84.6±6.0依诺肝素20079.5±6.216.1±6.5多肽2小剂量3.0617.2±6.76.3±7.0多肽2中剂量6.0847.5±5.8*#￥&15.4±6.0多肽2大剂量12.0772.5±6.2*#￥&@46.0±6.5*#￥&@与生理盐水组相比，*p<0.05；与比伐卢定组相比，#p<0.05；与依诺肝素组相比，￥p<0.05；与多肽2小剂量组相比，&p<0.05；与多肽2中剂量组相比，@p<0.054.4多肽2静脉单次给药对家兔凝血功能的影响结果表明，多肽2给药后，可以延长家兔aptt、pt、tt和act。停药后随着时间的延长，对上述凝血指标的的延长作用逐渐减弱。4.4.1对家兔aptt的影响结果如图13和表18和19结果所示。多肽2各剂量组可不同程度地延长家兔aptt，随着时间的延长，15min对aptt的延长作用逐渐减弱。给药5min，与生理盐水组相比，多肽2中剂量6.0mg/kg、大剂量12.0mg/kg组统计学有显著差异(p<0.05)；给药15min时，与生理盐水组相比，多肽2中剂量6.0mg/kg、大剂量12.0mg/kg组统计学有显著差异(p<0.05)。表18多肽2静脉单次给药对家兔aptt的影响(s，x±se)与生理盐水组相比，*p<0.05；与比伐卢定组相比，#p<0.05；与伊诺肝素组相比，￥p<0.05；与多肽2小剂量组相比，&p<0.05。表19多肽2静脉单次给药对家兔aptt的影响(延长倍数，)4.4.2对家兔pt的影响结果如图14、表20和表21所示。多肽2各剂量组可不同程度地延长家兔pt，随着时间的延长，15min对pt的延长作用逐渐减弱。给药5min，与生理盐水组相比，多肽2中剂量6.0mg/kg、大剂量12.0mg/kg组统计学有显著差异(p<0.05)；给药15min时，与生理盐水组相比，多肽2中剂量6.0mg/kg、大剂量12.0mg/kg组统计学有显著差异(p<0.05)。表20多肽2静脉单次给药对家兔pt的影响(s，x±se)组别剂量(mg/kg)n给药前给药后5min给药15min生理盐水-86.2±0.26.0±1.15.8±0.7比伐卢定6.086.4±0.218.8±1.1*10.2±0.7*依诺肝素20075.8±0.26.7±1.1#6.7±0.8#多肽2小剂量3.066.0±0.38.9±1.2#7.0±0.8多肽2中剂量6.086.3±0.212.9±1.1*#￥8.9±0.7*多肽2大剂量12.086.5±0.219.2±1.1*￥&12.5±0.7*￥&@表21多肽2静脉单次给药对家兔pt的影响(延长倍数，)4.4.3对家兔tt的影响结果如表22所示，多肽2各剂量组给药5min、15min，可以延长家兔tt超过检测限180s。表22多肽2静脉单次给药对家兔tt的影响(s，)组别剂量(mg/kg)n给药前给药5min给药15min生理盐水-821.2±0.820.3±0.819.1±0.7比伐卢定6.0822.4±5.2>180s>180s依诺肝素200720.7±4.2>180s>180s多肽2小剂量3.0621.0±2.6>180s>180s多肽2中剂量6.0822.3±1.9>180s>180s多肽2大剂量12.0821.8±6.4>180s>180s4.4.4多肽2对家兔act的影响结果如图15、表23和表24所示，多肽2各剂量组可不同程度地延长家兔act，随着时间的延长，15min对act的延长作用逐渐减弱。给药5min，与生理盐水组相比，多肽2大剂量12.0mg/kg组统计学有显著差异(p<0.05)。给药15min时，与生理盐水组相比，多肽2小剂量3.0mg/kg、中剂量6.0mg/kg、大剂量12.0mg/kg组统计学有显著差异(p<0.05)。表23多肽2静脉单次给药对家兔act的影响(s，)组别剂量(mg/kg)n给药前给药5min给药15min生理盐水-8240.0±24.0226.9±35.3208.1±24.1比伐卢定6.08305.6±24.0443.8±35.3*375.0±24.1*依诺肝素2007285.0±25.6915.0±37.7*#610.7±25.7*#多肽2小剂量3.06357.5±27.7352.5±40.7￥337.5±27.8*￥多肽2中剂量6.08232.5±24.0356.3±35.3￥324.4±24.1*￥多肽2大剂量12.08315.0±24.0505.6±35.3*￥&@418.1±24.1*￥与生理盐水组相比，*p<0.05；与比伐卢定组相比，#p<0.05；与依诺肝素组相比，￥p<0.05；与多肽2小剂量组相比，&p<0.05；与多肽2中剂量组相比，@p<0.05。表24多肽2静脉单次给药对家兔act的影响(延长倍数，)多肽2静脉单次给药，可抑制fecl3诱导的家兔股动脉血栓形成并剂量依赖性地抑制家兔股动静脉旁路血栓形成，其中剂量及大剂量组抗血栓效果优于比伐卢定组；多肽2可剂量依赖性抑制家兔血小板聚集，影响家兔凝血功能，延长aptt、pt、tt和act。测试例8本测试例用于说明多肽2对进展性缺血脑卒中的保护作用。1、实验动物：健康、成年sd大鼠60只，雄性，体质量250g～300g，购自西安交通大学医学院动物中心。动物生产许可证号：scxk(陕)2012-003。2、受试药品：多肽2，肽含量为97.21％；对照药：依诺肝素注射液，赛诺菲(北京)制药有限公司生产，批号：4sh69。3、实验方法：3.1溶液的配置：多肽2：用前配成2mg/ml的母液。3.2分组及给药：采用颈静脉插管给药的方式于造模15min开始给药，首剂加维持60min，给药组多肽2剂量为0.25mg/kg+0.75mg/kg/h，模型组给生理盐水。3.3、实验操作：线栓法(颈总动脉插入法)：颈部取正中切口切开皮肤，分离出颈总、颈外、颈内动脉，在近心端结扎颈总动脉，远心端结扎颈外动脉。用小型血管夹暂时性夹闭颈内动脉远心端，在颈总、颈外、颈内动脉分叉处预留结扎线，用眼科剪在颈总动脉近颈内动脉处剪一小口，使mcao栓线有一定程度的弯曲，沿颈总动脉插入颈内动脉，插线时栓线向操作者方向弯曲，向前缓慢推进约18mm(自动脉分叉处计)，有阻力感时停止进线，在分叉处结扎预留线以固定栓线，造模15min后劲静脉首剂加维持给要60min，给药结束后颈部伤口常规缝合。4、检测指标4.1神经行为学评分：于术后4h、8h、24h对两组大鼠进行神经行为学评分，以longa五级四分法为标准：0分:无神经缺损症；1分:提尾时对侧前肢内收，不能全伸直；2分:向对侧旋转；3分:行走时向对侧倾倒；4分:不能行走或昏迷。1-4分为有效模型。4.2ttc染色观察梗死病变及梗死体积术后24h后处死动物，取脑，进行ttc染色用绘图软件计算梗死体积。4.3脑指数、脑含水量：各组取大鼠在手术造模后24h将大鼠断头迅速剥离出全脑称湿重,计算脑指数，脑指数＝脑湿重/体重*100％。5、试验结果表25和表26试验结果显示，多肽2剂量0.5+1.25和1.0+2.5(mg/kg+mg/kg/h))使术后24小时脑梗死体积从(23.41±10.08)％分别降至(11.12±6.56)％和(8.01±6.66)％，神经行为学损伤也有改善，说明对实验性脑梗塞有保护作用。表25多肽2对神经行为学的影响(x±s)与模型组比，*p＜0.05，**p＜0.01表26多肽2对脑梗死体积和脑指数的影响(x±s)与模型组比，*p＜0.05，**p＜0.01测试例9本测试例用于说明多肽2对凝血酶诱导的小鼠肺栓塞的保护作用。1、实验动物：昆明种小鼠，雄性，6～8周龄，20～25g，由西安交通大学实验动物中心提供，动物生产许可证号scxk(陕)2012-003。2、实验试剂2.1凝血酶sigma公司，批号t4648，来源于牛血清，规格1000u/瓶。2.2依诺肝素注射液0.4ml:4000axalu，赛诺菲(北京)制药有限公司，分装批准文号：国药准字j20090094。2.3多肽2委托吉尔生化(上海)有限公司，批号p131029-ml360794，肽含量为97.21％。3、实验仪器bc-2800vet型迈瑞全自动血球分析仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。4、实验方法小鼠随机分为7组，每组10只。第一组生理盐水组，第二组模型对照组；第三组阳性对照依诺肝素0.5mg/kg，第四组阳性对照组比伐卢定8mg/kg，；第五组多肽2小剂量组2.5mg/kg，第六组多肽2中剂量组5.0mg/kg，第七组多肽2大剂量组10.0mg/kg。除生理盐水组、模型对照组尾静脉注射200ul生理盐水外，其余各组分别按剂量给药。2min后生理盐水组尾静脉注射100ul生理盐水，其余各组尾静脉注射100ul凝血酶1500u/kg(80-90％致死剂量)。给药后观察小鼠反应，15min内死亡情况。15min内未死亡小鼠进行处理。(1)记录死亡率：记录15min内急性肺栓塞小鼠的死亡情况，记录存活时间，计算死亡率；(2)测定肺系数：死亡后立即解剖切除肺组织之外支气管和脂肪组织，用蒸馏水洗净肺组织，在用滤纸吸干肺表面的水分后称肺质量。取出肺脏称重，计算肺系数。肺系数＝肺质量/体质量×100％；(3)血小板数目测定：15min内未死亡小鼠，眼球取血，edta抗凝后，测量血小板数目，立即解剖取出肺脏称重测定肺系数。5、实验结果：lps模型组小鼠死亡12/13只，死亡率为85％，与生理盐水组相比两组率的差别有非常显著意义(p<0.01)。依诺肝素0.5mg/kg组、比伐卢定8mg/kg和多肽2大剂量10.0mg/kg组死亡1/10只，死亡率为10％，分别与模型组相比，两组死亡率的差别有非常显著意义(p<0.01)。多肽2中剂量5.0mg/kg组死亡3/10只，死亡率为30％，分别与模型组相比，两组死亡率的差别有非常显著意义(p<0.01)；多肽2两个组与依诺肝素0.5mg/kg、比伐卢定8mg/kg分别相比，两组死亡率的差别无显著意义(p>0.05)。多肽2小剂量2.5mg/kg组死亡6/10只，死亡率为60％，与模型组相比，两组死亡率的差别无显著意义(p>0.05)；与依诺肝素250u/kg、比伐卢定8mg/kg相比，两组死亡率的差别有显著意义(p<0.01)；与多肽2中剂量5.0mg/kg、多肽2大剂量10.0mg/kg相比，两组死亡率的差别有显著意义(p<0.05)。模型组小鼠肺系数显著增大，与生理盐水组相比统计学差异有非常显著意义(p<0.01)；比伐卢定8mg/kg组小鼠肺系数减小，与模型组相比统计学差异有显著意义(p<0.05)；多肽2大剂量10.0mg/kg组小鼠肺系数减小，与模型组相比统计学差异有非常显著意义(p<0.01)。结果见表27，图16，多肽2对凝血酶诱导的小鼠肺栓塞有保护作用。表27多肽2对凝血酶诱导的小鼠肺栓塞的影响作用与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01；与多肽2小剂量组相比，#p<0.05，##p<0.01上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。工业实用性本发明所提供的凝血酶和血小板gpⅱb/ⅲa受体多靶点拮抗化合物具有直接、可逆、特异抗凝血酶功能，还具有抑制gpⅱb/ⅲa受体的作用，可以在较小的剂量下达到抗凝抗栓效果。同时降低出血风险、避免联合用药带来的剂量匹配、出血、作用协调等问题。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>陕西麦科奥特科技有限公司<120>有抗凝血和抗血小板活性的多靶点化合物及制法和用途<130>mp21010263f<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1pheproargproglyglyglyglyasnglyasptyrgluaspilepro151015gluglutyrleu20<210>2<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2pheproargserglyglyglyglyasnglyaspphegluaspilepro151015gluglutyrleu20<210>3<211>20<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluilepro151015gluglutyrleu20<210>4<211>32<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(27)<223>xaa（27）=高精氨酸<400>4pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluilepro151015gluglutyrleuglyglyglyglysercysxaaglyasptrpprocys202530<210>5<211>32<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(27)<223>xaa（27）=高精氨酸<400>5pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluilepro151015gluglutyrleuglualaalaalalyscysxaaglyasptrpprocys202530<210>6<211>27<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(22)<223>xaa（22）=高精氨酸<400>6pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluilepro151015gluglutyrleucysxaaglyasptrpprocys2025<210>7<211>33<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<222>(28)<223>xaa（28）=高精氨酸<400>7pheproargproglyglyglyglyasnglyasppheglugluilepro151015gluglutyrleuargvalleualaglualacysxaaglyasptrppro202530cys当前第1页12