基于乳铁蛋白的仿生抗菌功能多肽及制备方法和应用

本申请为申请日为2020年12月24日、申请号为2020115527592、发明名称为“基于乳铁蛋白的仿生抗菌功能多肽及制备方法和应用”的专利的分案申请。

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于乳铁蛋白的仿生抗菌功能多肽及制备方法和应用。

背景技术：

龋病是一种发生在牙体硬组织上的慢性感染性疾病，是人类最常见的口腔疾病。龋病会导致牙体硬组织的脱矿，不加干预的龋病会进展到牙髓病、根尖周病甚至牙缺失。由于龋病发病率高，流行区广，严重影响口腔及全身健康，世界卫生组织已将其列为人类重点防治的三大非传染性疾病之一，仅次于心血管疾病和肿瘤。

龋病的致病因素包括菌斑生物膜、饮食、宿主易感性和时间四大因素，其中菌斑生物膜是龋病最重要的始动因素。常见的致龋菌主要包括变异链球菌、嗜酸乳杆菌和黏性放线菌，这些细菌可以粘附在牙面上形成牙菌斑生物，当人体摄入高糖饮食时，其可以代谢糖产酸，从而导致牙体硬组织的脱矿，进一步导致龋病的形成。因此，对致龋菌的感染控制是防治龋病的重要原则。

经典的防龋制剂可以在一定程度上抑制致龋菌的作用，从而抑制龋病的发生和进展，然而这些制剂在长期的临床实践中却表现出了一定的局限性。氟化物被公认为目前最有效的防龋制剂，其通过促进再矿化和抑制致龋菌代谢的作用从而抑制龋病的进展。然而随着多种氟化物制剂的推广使用，耐氟菌株、氟牙症和氟骨症的出现使其在防龋方面的局限性日益凸显。此外，氯己定和四环素等抗菌药物可以明显抑制致龋微生物的活性，但是长期使用也会表现出菌群失调、耐药菌出现和牙体染色等弊端。针对上述问题，应积极寻求其他的抗菌作用明确且副作用低的防龋药物和方法。

抗菌肽是广泛存在于自然界动、植物体内的一类具有抗菌活性的多肽类物质，一般由12～50个氨基酸残基组成，大多数为阳离子抗菌肽，目前已发现的天然抗菌肽已超过两千种。与传统的抗菌制剂相比，其具有分子量低、抗菌谱广、抗菌机制独特、毒副作用和耐药性低等优点，有望克服上述传统抗菌制剂的弊端，有望成为新一代的抗菌药物。但天然的抗菌肽也有序列和结构较复杂、提纯生产成本高、体内代谢可能被干扰等不足，从而在临床应用中受到了一定的限制。

因此，提供一种抗菌功能多肽，其制备方法简单，分子量小，结构简单稳定，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

乳铁蛋白是体内一种多功能的内源性免疫蛋白，其通过铁螯合作用扣留体液中的游离铁离子，从而发挥抗菌、抗炎和抗肿瘤等多种生物学功能的作用。乳铁蛋白是唾液和获得性膜的重要组成部分，在抑制致龋菌粘附、菌斑形成以及龋病的发生进展具有重要作用。它可以铁形成螯合物夺取细菌生长必需的铁离子以抑制细菌，亦可直接杀灭致龋菌。此外，致龋菌活跃可刺激机体乳铁蛋白分泌增多，乳铁蛋白含量的增加又可与其他蛋白协同抑制细菌的致龋作用，符合机体的生理应激机制。

本发明的目的之一在于，提供基于乳铁蛋白的仿生抗菌功能多肽，分子量小，结构稳定，具有比母肽更为优良的抗菌活性。

本发明的目的之二在于，提供该仿生抗菌功能多肽的制备方法。

本发明的目的之三在于，提供含该仿生抗菌功能多肽的药物组合物。

本发明的目的之四在于，提供该仿生抗菌功能多肽的应用。

本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的基于乳铁蛋白的仿生抗菌功能多肽其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽包含如seqidno.1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述多肽包含如seqidno.2所示的氨基酸序列。

作为优选，所述多肽为c-端经过酰胺化修饰，或为其药学上或接受的盐、酯。

本发明的技术方案中，所述药学上可接受的盐是盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐或有机胺盐。

本发明所述的抗菌功能多肽的制备方法，包括以下步骤：根据所制备的多肽序列，将第一个氨基酰胺化，用fmoc保护其氨基，然后连接到固相载体wang树脂上，然后脱掉氨基保护基；然后将氨基被fmoc保护的第二个氨基酸在缩合剂的活化作用下与已连接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键；重复上述肽键形成反应，使肽链从c端向n端生长，直至最后一个氨基酸接入，切割后得到目标多肽。

本发明所述的一类药物组合物，含有上述的多肽，以及药学上可接受的载体和/或辅料。所述“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。

本发明的技术方案中，所述制剂包括液体制剂、固体制剂或半固体制剂。

作为优选，所述液体制剂包括溶液剂或注射剂，所述固体制剂包括片剂或胶囊剂，所述半固体制剂包括软膏剂或凝胶剂。

本发明所述的多肽在制备具有包括但不仅限于杀菌功能药物中的应用。

作为优选，所述菌包括但不仅限于致龋菌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的基于乳铁蛋白的仿生功能多肽分子量小，结构简单稳定，仿生效果好，具有良好的抗菌效果及安全性，可以在较低浓度、短时间杀灭口腔常见致龋菌，溶血性低，细胞毒性在可控范围内。

本发明的基于乳铁蛋白的仿生功能多肽制备方法简单，生产成本低，易于推广和实现工业化，可以有效降低细菌耐药性的发生，在代替抗生素成为主流抗菌药物方向上有巨大潜力。

附图说明

图1-1为lf-1对变异链球菌的杀菌动力学曲线图；

图1-2为lf-1对黏性放线菌的杀菌动力学曲线图；

图1-3为lf-2对变异链球菌的杀菌动力学曲线图；

图1-4为lf-2对黏性放线菌的杀菌动力学曲线图；

图2-1为lf-1对变异链球菌的生物膜抑制效果图；

图2-2为lf-2对变异链球菌的生物膜抑制效果图；

图3-1为lf-1和lf-2对变异链球菌杀菌作用的透射电镜图；

图3-2为lf-1和lf-2对嗜酸乳杆菌杀菌作用的透射电镜图；

图3-3为lf-1和lf-2对黏性放线菌杀菌作用的透射电镜图；

图4-1为lf-1的圆二色谱图；

图4-2为lf-2的圆二色谱图；

图4-3为lf-1和lf-2的为lf-1的圆二色谱分析图；

图5-1为lf-1对人牙龈成纤维细胞增殖的影响图；

图5-2为lf-2对人牙龈成纤维细胞增殖的影响图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更为清晰，以下结合具体实例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例提供了基于乳铁蛋白仿生抗菌功能多肽lf-1，氨基酸序列如下所示：

seqidno.1：wkllrkawkllrka。

其制备步骤如下：

1、选用fmoc-his(trt)-wangresin作为树脂(载体)；

2、用dcm(二氯甲烷)将树脂充分溶胀；

3、用适当浓度的dblk(六氢吡啶+dmf)，将fmoc-保护基团脱出；

4、用dmf清洗数遍，洗去dblk；

5、称取适合的缩合剂和活化剂(hbtu，nmm)以及c端第二个fmoc-保护氨基酸(fomc-leu-oh)进行偶联；

6、茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全；

7、用dmf清洗几遍，洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂；

8、依seqidno.1氨基酸序列进行偶联，方法参照上述步骤3～7；

9、将所有的氨基酸连接结束后采用步骤3～4的方法脱去最后的fmoc-保护基团；

10、用tfa切割液裂解，去除树脂和氨基酸保护基团，得到粗品；

11、送质谱确认产品正确(seqidno.1分子量1810.23符合理论值)；

12、粗品送纯化分离，提高纯度。

实施例2

本实施例提供了基于乳铁蛋白仿生抗菌功能多肽lf-2，氨基酸序列如下所示：

seqidno.2：gkliwkllrkawkllrka。

其制备步骤与实施例1相比，区别在于步骤8为：依seqidno.2氨基酸序列进行偶联，其余条件均相同。

其中，送质谱确认产品正确(seqidno.2分子量2221.88符合理论值)。

实施例3

本实施例公开了本发明的基于乳铁蛋白仿生抗菌功能多肽lf-1和lf-2的最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)测定。

最小抑菌浓度mic(minimalinhibitoryconcentration)是指在体外试验中，抗菌药物能抑制培养基中细菌生长的最低浓度。最小杀菌浓度mbc(minimalbactericidalconcentration)指在体外试验中，抗菌药物能使活菌生长减少99％以上的最小浓度。mic与mbc是药物抗菌活性的指标，显示出药物抑杀病原微生物的能力。实验采用细菌为变异链球菌(streptococcusmutans，ua159)、血链球菌(streptococcussanguis，atcc10556)、格氏链球菌(streptococcusgordonii，dl1)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus，atcc14931)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei，atcc393)、发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum，atcc9338)、黏性放线菌(actinomycesviscosus，atcc15987)、内氏放线菌(actinomycesnaeslundii，atcc12104)。

mic、mbc测定实验步骤如下：

1、挑取单菌落于10mlbhi液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)过夜培养。

2、吸取100μl菌液于10mlbhi液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)传代培养2～3代后，取对数生长中期菌液并将其稀释至2×10⁶cfu/ml备用。

3、多肽采用2倍稀释法加入u形96孔板，每孔20μl。

4、每孔加入80μlbhi培养基、100μl菌液，使多肽最终浓度为256～0.5μmol/l。

5、以抗菌肽模板(wa-7，序列：wkllrka，如seqidno.3所示)和抗菌肽母肽(wr-17，序列：wkllskaqekfgknksr，如seqidno.4所示)作为药物对照，无菌去离子水作为阴性对照。

6、96孔板置于37℃恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)培养24h。

7、mic为孔板内澄清的最低多肽浓度。

8、吸取澄清孔内100μl菌液涂布于bhi平板，37℃恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)过夜培养48h。

9、mbc为平板上无菌落生长的最低多肽浓度。

10、上述实验至少重复3次。

结果数据如表1所示：两种多肽对口腔常见细菌都有一定的抑制作用。相较于其他口腔细菌，lf-1对变异链球菌表现出了特异性的抗菌作用，mic和mbc分别是8和16(μmol/l)。lf-2对口腔常见细菌表现出了广谱抗菌性，其对变异链球菌的mic和mbc分别是16和32(μmol/l)。

表1抗菌功能多肽对口腔常见细菌的mic和mbc(μmol/l)

实施例4

本实施例公开了本发明的基于乳铁蛋白仿生抗菌功能多肽lf-1和lf-2对口腔常见致龋菌的杀菌动力学的测试。

杀菌动力学是反映药物抗菌能力与作用时间关系的指标。实验用菌为主要的口腔致龋菌变异链球菌(streptococcusmutans，ua159)和黏性放线菌(actinomycesviscosus，atcc15987)。其测定步骤如下：

1、挑取单菌落于10mlbhi液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)过夜培养。

2、吸取100μl菌液于10mlbhi液体培养基中置于37℃恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)传代培养2～3代后，取对数生长中期菌液并将其稀释至2×10⁶cfu/ml备用。

3、多肽以无菌去离子水稀释后加入24孔板，每孔100μl。

4、每孔加入400μlbhi培养基、500μl菌液，使多肽最终浓度为至4mbc、2mbc、mbc浓度，以无菌去离子水作为阴性对照。

5、24孔板置于37℃恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)培养。

6、各时间点(0min，1min，5min，10min，20min，30min，1h，2h，4h)吸取100μl菌液并稀释后涂布于bhi平板，37℃过夜培养48h后计算菌落数；

8、实验重复3次。

实验结果如图1-1～1-4所示：时间为横坐标，纵坐标表示每毫升所含菌落数目，随着时间的增加，菌落数目的变化表明了细菌生长情况。从图中可看出，当多肽浓度位于mbc浓度时，多肽能在30～60分钟内杀灭细菌，多肽浓度越高，杀菌用时越短。特别地，同等条件下lf-2的杀菌效果要强于lf-1。高浓度的抗菌肽在短时间内强效杀灭细菌，杀菌能力强且用时短，应用前景十分可观。

实施例5

本实施例公开了本发明的基于乳铁蛋白仿生抗菌功能多肽lf-1和lf-2对变异链球菌生物膜的影响。

最小抑生物膜浓度mbic(minimalbiofilminhibitoryconcentration)是反映药物抗生物膜形成能力的指标。其中mbic90是指在体外试验中，抗菌药物能抑制培养基中90％以上的生物膜形成的最低浓度。实验用菌为变异链球菌(streptococcusmutans，ua159)。其测定步骤如下：

1、挑取单菌落于10mlbhi液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)过夜培养。

2、吸取100μl菌液于10mlbhi液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)传代培养2～3代后，取对数生长中期菌液并将其稀释至2×10⁶cfu/ml备用。

3、多肽用无菌蒸馏水进行溶解，采用2倍稀释法加入24孔板，每孔100μl。

4、每孔加入400μlbhis(含有2％蔗糖的bhi)培养基、500μl菌液，使多肽最终浓度为256～0.5μmol/l，以无菌去离子水作为阴性对照。

5、24孔板置于37℃恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)培养24h；

6、吸走培养液，检测形成的生物膜的量：用pbs洗两次，甲醇固定15min，0.1％结晶紫染色5min，33％冰乙酸脱色30min，测量595nm下的吸光度；

7、mbic90为吸光度较阴性对照组减少90％以上的最低多肽浓度。

8、实验至少重复3次。

结果如图2-1～2-2所示：横坐标表示药物浓度，纵坐标表示吸光度，吸光度反映生物膜量，吸光度越高，生物膜量越多。药物组形成的生物膜量较阴性对照组明显减少，差异有统计学意义(p<0.05)，无菌水阴性对照组对生物膜的形成无影响。药物浓度为8μmol/l的lf-1和药物浓度为16μmol/l的lf-2组形成生物膜的降低量为阴性对照组的90％以上，可见多肽的mbic90分别为8μmol/l(lf-1)和16μmol/l(lf-2)。

实施例6

本实施例公开了本发明的基于乳铁蛋白仿生抗菌功能多肽lf-1和lf-2对口腔常见致龋菌的杀菌作用的透射电镜观察。

实验用菌为主要的口腔致龋菌变异链球菌(streptococcusmutans，ua159)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus，atcc14931)以及黏性放线菌(actinomycesviscosus，atcc15987)。其实验步骤如下：

1、挑取单菌落于10mlbhi液体培养基中37℃恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)过夜培养。

2、吸取100μl菌液于10mlbhi液体培养基中置于恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)传代培养2～3代后，取对数生长中期菌液并将其稀释至2×10⁹cfu/ml备用。

3、多肽以无菌去离子水稀释后加入15ml离心管，每管1ml。

4、每管加入4mlbhi培养基、5ml菌液，使多肽最终浓度为64μmol/l，无菌去离子水作为阴性对照。

5、离心管置于37℃恒温厌氧培养罐(80％n2，10％h2，10％co2)培养24h。

6、4,500×g离心力离心5min收集细菌沉淀，实验组菌沉淀pbs缓冲液清洗2次后，将细菌沉淀使用2.5％戊二醛溶液，4℃过夜固定。

7、使用乙醇梯度脱水(35％，50％,75％处理30min,90％和100％处理30min2次)。

8、包埋样本，烘箱固化，切片。

9、3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察。

结果如图3-1～3-3所示：在透射电镜下可观察到常见致龋菌存在穿孔、破碎的死亡形态，从微观上可以看出细菌在经过多肽处理后，主要是细胞壁受损，符合多肽的α-螺旋结构杀菌原理，多肽接触细菌后由α-螺旋结构在细菌的细胞壁上打孔，导致细菌破裂最终死亡。

实施例7

本实施例公开了本发明的基于乳铁蛋白仿生抗菌功能多肽lf-1和lf-2的圆二色光谱分析。

圆二色(circulardichroism简称cd)光谱是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。本实验用于测量多肽的结构，以验证其设计原理的有效性。通过查阅文献可知，圆二色光谱分析α-螺旋结构在紫外光波长靠近192nm有一正的谱带,在222和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带。使用的实验仪器为jascoj-1500cdspectrometer(日本)，其实验步骤如下：

25℃条件下，测量容器透光长度1mm，紫外光波长范围190nm～240nm。每个样品扫描10次取平均值。样品多肽浓度为100μmol/l，分别溶于pbs(20mmol/l)溶液、sds(25mmol/l)的pbs溶液和tfe(50％v/v)的pbs溶液中。所得数据通过公式计算出摩尔椭圆率绘制图表如图-4所示。

由图4-1～4-2可知，在表面活性剂(sds)和常用化工溶剂(tfe)的参与下，多肽光谱图呈成了典型的α螺旋结构；由图4-3可知，在拟膜环境sds溶液下，两条多肽的α螺旋的比例均超过50％。上述结果说明多肽在溶液中的二级结构为α螺旋，验证了多肽的设计原理，从结构上解释并证明了多肽的杀菌能力。

实施例8

本实施例公开了本发明的基于乳铁蛋白仿生抗菌功能多肽lf-1和lf-2的溶血性实验，其步骤如下：

1、选取脱纤维无菌羊血，3000rpm离心15分钟，1倍pbs溶液(20mmol/l)洗涤，收集羊红细胞，以上操作重复3遍。

2、调配红细胞悬浮液：血细胞以20％(v/v)的比例悬浮于1倍pbs溶液中。

3、使用前将20％的红细胞悬浮液按1:20的比例稀释于1倍pbs中，形成终浓度为2mmol/l的血红蛋白溶液。

4、使用96孔板，单孔加入100μl红细胞悬浮液和100μl的多肽pbs溶液，梯度稀释使多肽最终浓度为256～1μmol/l。以1％吐温-20作为阳性对照，1倍pbs溶液作为阴性对照，以抗菌肽模板(wa-7)和抗菌肽母肽(wr-17)作为药物对照。

5、37℃下孵育1h，实验进行至少3次重复。

6、吸取溶液上清，在450nm测吸光度值判断溶血性。

结果如表2所示：所得溶液吸光度越高，反映溶血效果越强，并计算相应溶血率和hc50(导致50％红细胞溶血的多肽浓度)。所得数据绘制以下表格。lf-1在高浓度(256μmol/l)时，表现出极低的溶血率。lf-2的hc50在256-128μmol/l之间，说明在低于128μmol/l浓度多肽作用下，溶血效果可以接受。模板肽(wa-7)和母肽(wr-17)未表现出明显的溶血性。因此lf-1和lf-2具有较好的临床价值。

表2仿生抗菌功能多肽的溶血性比较

实施例9

本实施例公开了本发明的基于乳铁蛋白仿生抗菌功能多肽lf-1和lf-2对人牙龈成纤维细胞增殖的影响。

在四川大学医学伦理学会审批后，于北京北纳创联生物技术研究院购买牙龈成纤维细胞(humangingivalfibroblasts)，以下简称为hgfs。根据说明书进行细胞培养和传代，传至第4～6代用于实验。

1、hgfs接种96孔板中，每孔5000个细胞，使用含双抗、10％胎牛血清的dmem培养基，在co2培养箱中(5％co2，95％空气，100％湿度，37℃)恒温培养24～48h，培养到细胞的覆盖面积大约为50％。

2、将多肽进行梯度稀释，浓度范围在256～1μmol/l，每组浓度为3复孔，处理细胞1h。处理后弃去上清液，用预热的pbs冲洗后加入100μldmem培养基继续培养。

3、每个孔内加入10μlcck-8溶液，多肽处理过的和未处理(阴性对照)的细胞在co2培养箱中(5％co2，95％空气，100％湿度，37℃)恒温培养，孵育1～4h到溶液展现适当颜色。

4、在摇床上温柔混匀，使用酶标仪在450nm处读取数值。

每孔内液体吸光度，吸光度越高，说明细胞数目越多，细胞增殖情况越好。所得数据如图5-1～5-2所示：对于lf-1而言，高浓度(＞128μmol/l)的多肽处理对细胞增殖有较大影响，但较小浓度(≤64μmol/l)的多肽处理后，细胞存活率可以＞80％，并且32μmol/l及以下浓度的多肽基本无细胞毒性(p＞0.05)，此浓度下已经可以快速杀灭s.mutans等常见致龋菌，因此具有很强的临床应用价值。对于lf-2而言，其对细胞的增殖活性的影响呈浓度依赖性，越低的浓度对细胞的增殖活性影响较小。其对常见口腔致龋菌的mbc在16～32μmol/l，在此浓度下对细胞增殖的影响可以接受。

综上所述，本发明借助仿生思想，基于天然的乳铁蛋白及多肽的抗菌序列，设计出了具有良好抗菌能力的功能多肽，为龋病的防治提供了一种新的理想途径。本发明的仿生抗菌功能多肽表现出了良好的抗菌效果，可以在较低浓度、短时间杀灭口腔常见致龋菌。同时分子量小，结构明确稳定，溶血性低，且对体外人牙龈成纤维细胞毒性在可控范围内。因此，该多肽在龋病防治和抗菌领域有着重要的研究价值。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>四川大学

<120>基于乳铁蛋白的仿生抗菌功能多肽及制备方法和应用

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