1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法。
技术背景
2.烟粉虱传双生病毒是一类植物单链环状dna病毒，是双生病毒科(geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(begomovirus)成员。烟粉虱传双生病毒在我国危害重、分布广、造成经济损失巨大。上世纪二三十年代在广州就有番茄黄顶病发生，前期零星发生，为害不大，但是在五十年代后六十年代初发生普遍，减产严重，经室内传毒试验证实，该病可嫁接传播、可经粉虱传播、但不能汁液机械摩擦、也不经种子和花粉传播，当时推测病原病毒可能是以色列番茄黄顶病毒的一个株系，这是烟粉虱传双生病毒在我国有发生的最早报道。上世纪 90年代，在广西的番茄、烟草、番木瓜和南瓜等多种农作物发现烟粉虱传双生病毒病。目前，除西藏、青海、内蒙古外，其他省(自治区) 市均有该病毒危害的报道，造成的经济损失巨大。
3.广东是我国烟粉虱传双生病毒病的重发区。广东气候温暖，烟粉虱周年繁殖，作物周年生长，烟粉虱传双生病毒病发生十分严重。上世纪二三十年代在广州番茄上就有烟粉虱传病毒病的发生，当时零星发生，为害不大，但是在五十年代后六十年代初发生普遍，减产严重。本世纪初，我省蔬菜番茄上烟粉虱传双生病毒病发病非常严重，该病害已导致多地无法继续种植，已严重影响到我省蔬菜产业健康发展。
技术实现要素：
4.鉴于现有技术的缺陷，本发明旨在于提供一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法。制定一套标准化的、规范化的烟粉虱传双生病毒病诊断方法，为科学指导我省烟粉虱传双生病毒病绿色防控提供依据，从而有效控制我省烟粉虱传双生病毒病的发生和流行。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法，所述方法包括病样采集、核酸dna抽提、病毒pcr扩增、病毒全基因组序列的获得与病毒种类确定，其中具体包括：
7.采用随机取样法对每地采集表现明显症状的病样5份，进行实验室检测诊断；
8.采用植物总核酸dna提取试剂盒，完成核酸dna提取；
9.利用烟粉虱传双生病毒基因组a组分的通用简并引物 av494/copr，对采集的疑似病样进行pcr检测，目的片段大小为 570bp，若能扩增出目的条带，确定病样中感染了烟粉虱传双生病毒；
10.选取病毒pcr检测为阳性代表性病样总dna，利用滚环扩增试剂盒进行滚环扩增；进一步用限制性内切酶对所获得滚环扩增产物进行酶切、将酶切所获得目的片段进行连接、克隆、测序；
11.对所获病毒基因组序列，利用dnastar软件seqman进行拼接，然后利用blast程序在国际基因数据库中进行序列相似性搜索，进一步用sdt1.2的muscle进行序列同源性比较
分析，依据双生病毒国际分类标准来确定病毒种类。
12.利用本发明的诊断方法，可对烟粉虱传双生病毒病进行快速、准确的诊断，进而科学有效控制烟粉虱传双生病毒病的发生，保障农产品质量安全，同时减少农民生产成本，也促进我省多种作物健康可持续发展。
具体实施例
13.以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
14.实施例
15.本发明为一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法，所述方法包括病样采集、核酸dna抽提、病毒pcr扩增、病毒全基因组序列的获得与病毒种类确定，其中具体包括：
16.采用随机取样法对每地采集表现明显症状的病样5份，进行实验室检测诊断；
17.采用植物总核酸dna提取试剂盒，完成核酸dna提取；
18.利用烟粉虱传双生病毒基因组a组分的通用简并引物 av494/copr，对采集的疑似病样进行pcr检测，目的片段大小为 570bp，若能扩增出目的条带，确定病样中感染了烟粉虱传双生病毒；
19.选取病毒pcr检测为阳性代表性病样总dna，利用滚环扩增试剂盒进行滚环扩增；进一步用限制性内切酶对所获得滚环扩增产物进行酶切、将酶切所获得目的片段进行连接、克隆、测序；
20.对所获病毒基因组序列，利用dnastar软件seqman进行拼接，然后利用blast程序在国际基因数据库中进行序列相似性搜索，进一步用sdt1.2的muscle进行序列同源性比较分析，依据双生病毒国际分类标准来确定病毒种类。
21.需要指出的是，本发明还提供一种烟粉虱传双生病毒病田间诊断的方法，利用该方法，可以进行初步判断，具体的说，烟粉虱传双生病毒病是由烟粉虱传播的多种双生病毒侵染引起的一种植物病害，寄主植物受到该类病毒侵染后会表现黄化曲叶、黄脉、黄花叶、叶脉肿大、曲叶、矮缩等明显症状。通过肉眼直接观察作物植株田间表现进行田间初步诊断。若作物植株表现有黄化曲叶、黄脉、黄花叶、叶脉肿大、曲叶、矮缩等症状，且田间有一定数量的烟粉虱存在或曾有烟粉虱发生，初步判定该作物感染了烟粉虱传双生病毒病。随后，即可进行采样并利用本发明的方法进行诊断。
22.对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变，而所有的这些改变，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
技术特征：
1.一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法，其特征在于，所述方法包括病样采集、核酸dna抽提、病毒pcr扩增、病毒全基因组序列的获得与病毒种类确定，其中具体包括：采用随机取样法对每地采集表现明显症状的病样5份，进行实验室检测诊断；采用植物总核酸dna提取试剂盒，完成核酸dna提取；利用烟粉虱传双生病毒基因组a组分的通用简并引物av494/copr，对采集的疑似病样进行pcr检测，目的片段大小为570bp，若能扩增出目的条带，确定病样中感染了烟粉虱传双生病毒；选取病毒pcr检测为阳性代表性病样总dna，利用滚环扩增试剂盒进行滚环扩增；进一步用限制性内切酶对所获得滚环扩增产物进行酶切、将酶切所获得目的片段进行连接、克隆、测序；对所获病毒基因组序列，利用dnastar软件seqman进行拼接，然后利用blast程序在国际基因数据库中进行序列相似性搜索，进一步用sdt1.2的muscle进行序列同源性比较分析，依据双生病毒国际分类标准来确定病毒种类。
技术总结
本发明一种烟粉虱传双生病毒病的诊断方法，所述方法包括病样采集、核酸DNA抽提、病毒PCR扩增、病毒全基因组序列的获得与病毒种类确定。利用本发明的诊断方法，可对烟粉虱传双生病毒病进行快速、准确的诊断，进而科学有效控制烟粉虱传双生病毒病的发生，保障农产品质量安全，同时减少农民生产成本，也促进我省多种作物健康可持续发展。种作物健康可持续发展。
技术研发人员：汤亚飞 何自福 佘小漫 李正刚 于琳 蓝国兵
受保护的技术使用者：广东省农业科学院植物保护研究所
技术研发日：2021.06.21
技术公布日：2021/10/15