一种化合物及其制备方法和用途

本发明涉及药物化学
技术领域：
，特别涉及一种化合物及其制备方法和用途。
背景技术：
：心血管疾病是一系列涉及循环系统的疾病。冠心病、心力衰竭、急性心肌梗死等为常见的心血管疾病并且致病机制均与心肌缺血再灌注导致的心肌细胞损伤有关。研究发现心肌缺血再灌注心肌细胞损伤的发生机制是多方面的，涉及自由基损伤、氧化应激、钙超载、能量代谢障碍及凋亡等机制。基于心肌缺血再灌注损伤的发病机制，临床上出现的治疗方式主要包括：药物的缺血预处理、药物的缺血后处理、以及机械性缺血预处理等，均可降低心肌缺血再灌注所引起的损伤。在已知的多种治疗药物中，较为有效的药物为罗格列酮、曲美他嗪等。但这些药物尚存在特异性弱、疗效低、长期服用耐受性明显等缺陷。这就妨碍了心肌缺血再灌注损伤疾病的有效治疗。因此，急需开发一种新的治疗药物。技术实现要素：（一）要解决的技术问题鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种化合物，其被证实具有抗心肌缺氧或复氧损伤的活性，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，因此可用于制备心血管疾病治疗药物，为开发新的心血管疾病提供研究方向。本发明还涉及该化合物的制备方法和用途。（二）技术方案为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：一方面，本发明提供一种化合物，其具有如下所示的结构式：。第二方面，本发明还涉及上述化合物在制备治疗心血管疾病药物中的用途。优选地，所述心血管疾病是指与心肌缺血再灌注导致的心肌细胞损伤有关的疾病。具体地，所述心血管疾病为冠心病、心力衰竭或急性心肌梗死。优选地，所述化合物可以显著升高缺氧或复氧损伤心肌细胞模型的存活率、降低缺氧或复氧损伤心肌细胞模型上清液中ldh含量、降低缺氧或复氧损伤模型心肌细胞中mda含量及mpo水平、提高缺氧或复氧损伤模型心肌细胞中sod含量。优选地，所述治疗心血管疾病药物包括由所述化合物与药物上可接受的助剂制备的口服制剂或注射制剂。优选地，所述口服制剂包括但不限于片剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、滴丸剂。第三方面，本发明还涉及上述化合物的制备方法，其包括：s1、取黄檀属植物心材，用65-75%乙醇提取，提取液过滤并减压浓缩回收乙醇后得提取物，用蒸馏水溶解，依次用二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取；s2、取二氯甲烷萃取部位进行硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯复配溶剂作为洗脱液，其中石油醚与乙酸乙酯体积比为50:1-1:5；洗脱后得到22个流分frs.1-frs.22；s3、取frs.11应用于硅胶柱，以体积比400-500:1的二氯甲烷-甲醇作为流动相，得到10个流分frs.11.a-frs.11.j；s4、取流分frs.11.h用sephadexlh-20柱色谱纯化，用体积比1:1的二氯甲烷-甲醇洗脱，得到三个流分frs.11.h.1-frs.11.h.3；s5、取流分frs.11.h.3通过半制备hplc进一步分离，用体积比25-28:72-75的甲醇-水洗脱，收集保留时间tr=34.2min的色谱峰，回收溶剂，浓缩，干燥，得到所述化合物。在本申请中，将该化合物命名为melanoxylonina。（三）有益效果本发明的化合物，为一种从黄檀属植物心材中提取分离得到黄檀内酯类化合物，其具有如下化学性质和药理活性：（1）本发明的化合物经细胞水平实验证实，对心肌缺血再灌注导致的心肌细胞损伤具有保护作用，包括：能显著升高缺氧或复氧损伤心肌细胞模型的存活率，明显降低缺氧或复氧损伤心肌细胞模型上清液中ldh含量，明显降低缺氧或复氧损伤模型心肌细胞中mda含量及mpo水平，明显提高缺氧或复氧损伤模型心肌细胞中sod活性。（2）本发明的化合物结构和理化性质稳定，成药性好，且毒性很低，是一类潜在的高效低毒的心血管疾病的候选药物，可用于制备心血管疾病的治疗药物，药物剂型可为医学上可接受的任何剂型，如片剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、滴丸剂等各种口服制剂，还可制成注射制剂等。附图说明图1为化合物melanoxylonina的结构。图2为鉴定化合物melanoxylonina的质谱图。图3为鉴定化合物melanoxylonina的hmbc谱。图4为化合物melanoxylonina对h9c2心肌细胞上清液ldh含量的影响。图5为化合物melanoxylonina对h9c2心肌细胞内mda含量的影响。图6为化合物melanoxylonina对h9c2心肌细胞内mpo水平的影响。图7为化合物melanoxylonina对h9c2心肌细胞内sod水平的影响。具体实施方式为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。实施例1本实施例为化合物melanoxylonina的制备过程：（1）取东非黑黄檀（dalbergiamelanoxylonguill.&perr.）的心材粉(50.0kg)，用70%的乙醇提3次，合并提取液过滤并减压浓缩，获得提取物(13.9kg)，溶解在蒸馏水中，依次用二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取。（2）取二氯甲烷萃取部位(8.5kg)进行硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯(50:1至1:5,v/v)作为洗脱液，得到22个流分（frs.1-frs.22）。（3）将frs.11(111.5g)应用于硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇(500:1,v/v)作为流动相，得到10个流分(frs.11.a-frs.11.j)。（4）用sephadexlh-20柱色谱纯化frs.11.h(4.0g)，二氯甲烷-甲醇(1:1,v/v)洗脱，得到三个流分(frs.11.h.1-frs.11.h.3)。（5）取frs.11.h.3(1.5g)通过半制备hplc进一步分离，用甲醇-水(26:74,v/v)洗脱，收集保留时间tr=34.2min的色谱峰，回收溶剂，浓缩，干燥，得到化合物(12.1mg)（命名为melanoxylonina）。实施例2本实施例为实施例1收集的melanoxylonina的结构鉴定。化合物（melanoxylonina）为黄色块状结晶，溶于dmso，分子量m/z299.0557([m-h]-)且分子式为c16h12o6；红外(kbr)νmax:3274.2,1663.7,1511.9,1511.0cm-1；紫外(meoh)λmax:362nm,282nm。1hnmr谱展现一个甲氧基，六个芳香质子信号包括a环上一个单峰质子和b环上形成aa'bb'系统的四个质子及一个烯烃碳的氢信号，见表1；在13cnmr谱中展现出17个碳信号，包括一个甲氧基碳及12个芳香碳信号，见表2。在hmbc谱中，化合物上的甲氧基信号δ3.79(3h,s)与碳信号为δ139.8表现出远程相关，羟基信号δ9.48(1h,s)/δ139.8(c-7),102.7(c-5)。化合物a环上的δ6.51(1h,s,h-5)/δ137.8(c-6),139.8(c-7),155.8(c-4)，则表明甲氧基在c-6或c-7位上；化合物b环上的δ7.35(2h,d,j=8.4hz,h-2',6')/δ159.2(c-4')、155.8(c-4)以及δ6.93(2h,d,j=8.5hz,h-3',5')/159.2(c-4');126.3(c-1')。此外，由此可以确定h-4'的位置上是羟基；c环上6.17(1h,s,h-3)/160.6(c-2),126.3(c-1')和114.8(c-10)。表1：化合物1的结构鉴定的1h-nmr(600hz)数据no.化合物1a36.17(1h,s)56.51(1h,s)2',6'7.35(2h,d,j=8.4hz)3',5'6.93(2h,d,j=8.4hz)4'-oh9.95(1h,s)6-oh9.48(1h,s)8-oh9.70(1h,s)7-ome3.79s注：ameasuredindmso-d6.（在dmso中分析）表2：化合物1的结构鉴定的13c-nmr(151hz)数据no.化合物1a2160.63112.64155.85102.76137.87139.88139.19147.410114.81'126.32'130.53'116.04'159.25'116.06'130.57-ome60.6注：ameasuredindmso-d6.经结构鉴定，可确定化合物melanoxylonina的结构如下式（图1）：。实施例3本实施例是对化合物melanoxylonina以及其它黄檀内酯衍生物共13种化合物对心肌细胞的毒性检测。13种化合物的结构、毒性检测方法及结果如下：使用mtt法检测melanoxylonina以及其它黄檀内酯衍生物共13种化合物对h9c2心肌细胞毒性。h9c2心肌细胞购自中国科学院细胞研究所(中国上海)。h9c2心肌细胞在37°c，5％co2的培养箱中，在含有10％胎牛血清的dmem培养基(美国invitrogen，美国)中培养。将100μlh9c2心肌细胞接种到96孔细胞培养板的每个孔中(2.5×104个细胞/孔)，培养24小时。然后加入终浓度为0.1、1、10、100和200μm的melanoxylonina以及其它黄檀内酯衍生物共13种化合物，且以每个浓度三个复孔培养48小时。孵育48h后，将20μlmtt溶液添加到每个孔中，再孵育4小时后，将100μldmso添加到每个孔中使formazan结晶完全溶解。使用spectramax190酶标仪在490nm下测量每个孔的od值。根据计算公式：细胞抑制率%=（1-加药组细胞od值/对照组细胞od值）*100%，计算不同浓度化合物对h9c2心肌细胞的相对抑制率，进而拟合量效曲线，计算化合物的ic50值。结果表明，化合物melanoxylonina的ic50值大于200µm。melanoxylonina以及其它黄檀内酯衍生物共13个化合物的ic50值均列于表3中。上述实验证明，化合物melanoxylonina在所测定的浓度范围内没有表现出毒性。表3：melanoxylonina以及其它黄檀内酯衍生物共13种化合物对h9c2心肌细胞毒性的试验结果。实施例4本实施例为化合物melanoxylonina以及实施例3毒性筛选中ic50>200µm的无毒黄檀内酯衍生物共9种化合物对心肌细胞缺氧或复氧损伤的保护作用比较。9种化合物对心肌细胞缺氧或复氧损伤的保护作用比较方法如下：1.h9c2心肌细胞h/r损伤模型的制备和分组将h9c2心肌细胞用含10％fbs的dmem培养基(美国invitrogen)，于37℃、5%co2的恒温培养箱中培养。当细胞生长达到培养瓶中80％时，使用胰蛋白酶将细胞分裂，以5.0×104ml-1(100µl/孔)的密度接种到96孔板中，在处理前孵育24小时。h9c2心肌细胞随机分组：(1)对照组在正常培养基下培养；(2)模型组（h/r）在缺氧缺糖(ogd)条件下培养20h，然后在正常培养基中保持4h(复氧)。(3)化合物组在ogd前用不同浓度melanoxylonina以及其它无毒黄檀内酯衍生物共9种化合物预处理24小时。2.检测h9c2心肌细胞存活率实验分组，其中化合物melanoxylonina以及其它无毒黄檀内酯衍生物共9种化合物的浓度设置为(0.1、1、10、20、40μm)，在酶标仪上在490nm的波长下测量每个孔的od值，计算细胞存活率，实验重复3次。使用mtt测定法评估melanoxylonina对i/r诱导的心肌细胞的存活率。按照公式计算细胞存活率，细胞存活率%=（给药组细胞od值-模型组细胞od值）/（正常组细胞od值-模型组细胞od值）*100，通过拟合量效曲线，计算出ec50值。结果如表4。melanoxylonina的ec50为14.63±1.50，表明化合物melanoxylonina能较好的减少h9c2缺氧或复氧的损伤。另外，本实验结果显示化合物12（黄檀素）ec50>200µm,表明melanoxylonina远比黄檀素活性强。表4：melanoxylonina以及其它无毒性的黄檀内酯衍生物共9种化合物对h9c2保护活性实验结果。实施例5本实施例对黄檀内酯类化合物对h9c2心肌细胞缺氧或复氧损伤保护作用的构效关系进行分析。依据实施例3的毒性实验结果和实施例4的药效实验结果，分析黄檀内酯类衍生物对h9c2心肌细胞缺氧或复氧损伤保护作用的构效关系如下：（1）a环：2号位上无羰基或3号位无双键，即a环上共轭结构减少会对心肌细胞h9c2表现出毒性。（2）b环：8号位上存在羟基时，黄檀内酯对心肌细胞h9c2缺氧或复氧损伤保护作用增强；甲氧基数目增加会使黄檀内酯对心肌细胞h9c2表现出毒性。（3）c环：甲氧基数目增加会使黄檀内酯对心肌细胞h9c2表现出毒性。邻二酚羟基可能会使黄檀内酯对心肌细胞h9c2缺氧或复氧损伤保护作用增强。实施例6本实施例为对h9c2心肌细胞缺氧或复氧损伤具有显著保护作用melanoxylonina的作用机制：1.h9c2心肌细胞h/r损伤模型的制备和分组将h9c2心肌细胞用含10％fbs的dmem培养基(美国invitrogen)，于37℃、5%co2的恒温培养箱中培养。当细胞生长达到培养瓶中80％时，使用胰蛋白酶将细胞分裂，以5.0×104ml-1(100µl/孔)的密度接种到96孔板中，在处理前孵育24小时。h9c2心肌细胞随机分为三组：(1)对照组在正常培养基下培养；(2)模型组（h/r）在缺氧缺糖(ogd)条件下培养20h，然后在正常培养基中保持4h(复氧)。(3)化合物组在ogd前用不同浓度melanoxylonina预处理24小时。2.检测h9c2心肌细胞中mda、sod、mpo水平和上清液中ldh含量：实验分为三组，其中化合物melanoxylonina的浓度设置为(0.1、1、10μm)，造模给药处理后，分别收集h9c2心肌细胞和细胞培养上清液，h9c2培养上清液用于ldh的测试。h9c2心肌细胞用pbs洗涤，使用胰蛋白酶消化脱壁，最后收集在pbs缓冲液中。超声裂解3次，将裂解物在4℃下以1000r/min离心10min，h9c2的匀浆用于测试sod，mda和mpo的活性。参照mda、sod、ldh检测试剂盒说明书测定细胞中mda含量和sod水平以及培养上清液中ldh含量。实验重复3次。3.统计学处理：采用spss21.0进行数据分析。细胞存活率、mda、sod、mpo水平、培养上清液中ldh含量的比较均采用单因素方差分析，以p<0.05为差别，有统计学意义。4.实验结果(1)h9c2心肌细胞中ldh含量变化与h/r组相比，化合物组(1、10μm)使心肌细胞上清液中ldh含量降低(p＜0.05)，化合物组具有剂量依赖性，特别是高剂量（10μm）降低心肌细胞上清液中ldh含量效果更显著，降低心肌细胞上清液中ldh含量的降幅最大为51.7％，实验结果见图4。（图中柱形图从左到右分别对应10.0μm、1.0μm、0.1μm）。需说明的是，图4-7中#表示与control组比较的相对值，*表示与h/r组比较的相对值。（2）h9c2心肌细胞中mda、mpo含量及sod水平变化与h/r组相比，化合物组(1、10μm)均使细胞中mda及mpo水平明显降低且sod含量升高(p＜0.05)，表现出具有剂量依赖性。化合物melanoxylonina降低细胞中mda含量和mpo水平及升高sod含量的效果明显，实验结果见附图5-7（图中柱形图从左到右分别对应10.0μm、1.0μm、0.1μm）。图5为h9c2心肌细胞内mda含量变化，图6为h9c2心肌细胞内mpo水平的变化，图7为h9c2心肌细胞内sod水平的变化。5.实验结论根据上述抗h9c2心肌细胞h/r损伤活性试验结果可以得出，化合物melanoxylonina具有明显的心肌缺氧或复氧损伤的保护活性，与模型组对比，化合物melanoxylonina在1、10μm时便能较好的保护心肌减少缺氧或复氧损伤，通过降低ldh、mda、mpo水平及提高sod活性水平。由此证明，化合物melanoxylonina可用于制备治疗心肌缺氧或复氧损伤相关疾病的新药物。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12