1.本发明属于医用生物材料领域，具体涉及一种具有三螺旋结构胶原及其制备方法。
背景技术：
2.胶原是细胞外基质的主要组成成分，是动物体内含量最多分布最广的蛋白质。胶原的首要特征是具有三螺旋结构。
3.生物工程技术应用之前，主要从动物组织中提取胶原，常从小牛皮、牛跟腱、猪皮中采用酸溶解法、酶法、或酸
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酶法提取胶原，得到的是具有三螺旋结构的胶原。
4.人类对于胶原的最古老的应用之一，即为明胶工业。传统上采用加热方法，破坏胶原的三螺旋结构，得到单链蛋白质链或肽链，即明胶。但明胶由于没有三螺旋结构，不属于胶原，不具备胶原具有的促进细胞分化、迁移等生物活性。
5.而采用动物源性材料提取得到的胶原，具有一定的缺点，比如动物源性病毒感染、胶原三螺旋部分被破坏，存在重金属残留、核酸杂质残留、微生物污染等。科学家为克服这一问题，采用生物工程技术构造工程菌，将人类胶原基因转入大肠杆菌或酵母菌种，采用发酵方法生产胶原。
6.但在实际产业化过程中，实际得到的并不是具有三螺旋结构的胶原，而是组成胶原的单肽链。根据胶原的特征，上述发酵的得到的所谓“胶原”，实质上是一种明胶，即单链结构。这种明胶与采用动物源材料提取得到的胶原或明胶相比，只含有一种单肽链，具有唯一确定的分子量，相当于一种纯净物。
7.因此，采用生物工程技术得到的胶原蛋白(实质为具有单一分子量的纯净的明胶)，由于没有三螺旋结构，并不具有胶原的生物活性，应用上受到限制。
技术实现要素：
8.本发明的目的是为了克服上述一种或多种不足，针对江山聚源公司发酵生产的胶原蛋白 (如上所述，实质为单链明胶)的结构特点，提出一种促进单肽链自组织为三螺旋结构的混合溶液，并提出了一种降温升温程序，将胶原蛋白溶液与上述溶液混合，通过降温升温程序，使得单肽链自组织成为三螺旋结构。
9.为实现上述目的，本发明所采用的具体技术方案如下：
10.首先本发明提供了促进三螺旋结构形成的混合溶液，包括以下原料：蔗糖、磷酸二氢钾、氯化钙、二甲基亚砜、丙三醇、纯化水。
11.进一步地所述原料具体为：蔗糖10g、磷酸二氢钾1g、氯化钙1g，二甲基亚砜2ml、丙三醇30ml，100ml纯化水。
12.基于上述促进三螺旋结构形成的混合溶液，本发明还形成了一种三螺旋结构胶原溶液，包括胶原蛋白溶液和上述的促进三螺旋结构形成的混合溶液；所述胶原蛋白溶液和促进三螺旋结构形成的混合溶液的体积比为10:1。
13.基于上述促进三螺旋结构形成的混合溶液本发明提供了一种三螺旋胶原的制备方法，具体操作如下：
14.称取发酵法生产的胶原蛋白和促进三螺旋结构形成的混合溶液；
15.将胶原蛋白加纯化水溶解得到胶原蛋白溶液，再加入促进三螺旋结构形成的混合溶液，胶原蛋白溶液与促进三螺旋结构形成的混合溶液体积比为10:1；
16.采用降温程序和升温程序，制得具有三螺旋结构的胶原的溶液；
17.通过通用洗涤和干燥工艺，制得具有三螺旋结构的胶原。
18.其进一步的优选技术方案是：所述发酵法生产的胶原蛋白，是采用工程酵母菌发酵法生产的重组人源胶原蛋白。
19.其进一步的优选技术方案是：胶原蛋白溶液浓度为15
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20％。
20.其进一步的优选技术方案是：所述的程序降温和升温程序为：将混合溶液体系由常温急速降温至
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20℃，保持1小时，采用线性升温程序缓慢升温至10℃，升温时间为2小时，在 10℃保持1小时。
21.其进一步的优选技术方案是：将混合溶液体系由常温急速降温至
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20℃，应在5分钟之内完成。
22.相比现有技术，本发明的技术方案具有如下优点：
23.1、促进三螺旋结构形成的混合溶液能够将普通的单链明胶，转化为具有三螺旋结构的胶原蛋白，从而克服传统发酵法得到的明胶不具备特殊的三螺旋结构的问题。
24.2、本发明中的三螺旋结构胶原制备方法采用发酵得到的具有唯一分子量的纯净单肽链，通过特定溶液环境和降温升温程序，使单肽链自组织为三螺旋结构，符合传统胶原的结构特征。解决了利用生物工程技术发酵胶原的最后一个技术困难，即使得普通单链明胶成为具有三螺旋结构的胶原蛋白。
25.3、采用本发明的制备方法，该方法得到的胶原，较传统提取方法得到的胶原，克服了动物源性病毒、核酸污染、重金属污染、微生物污染等困难，也克服了传统发酵得到的产物不具有三螺旋结构的问题，能够作为一种纯净安全的生物医药材料。
附图说明
26.图1为由本发明一种三螺旋结构胶原和胶原蛋白(实质为明胶)的圆二色谱图。
具体实施方式
27.为使本发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
28.实施例1
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1：
29.本发明实施例提供了一种促进三螺旋结构形成的混合溶液，称取蔗糖10g、磷酸二氢钾 1g、氯化钙1g，量取二甲基亚砜2ml、丙三醇30ml，加入到100ml纯化水中，混合均匀。
30.实施例2
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1三螺旋胶原的制备，包括以下步骤：
31.(1)制备胶原蛋白溶液：称取江山聚源公司生产的发酵胶原蛋白20g，加纯化水100ml，搅拌使溶解，得到胶原蛋白溶液；
32.(2)混合：取实施例1
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1的溶液与上述胶原蛋白溶液混合，与混合溶液体积比为10:1，混合均匀；
33.(3)降温升温程序：将上述混合溶液由常温急速降温至
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20℃，保持1小时，采用线性升温程序缓慢升温至10℃，升温时间为2小时，在10℃保持1小时；
34.(4)洗涤和干燥：用纯化水适量洗涤，除去蔗糖、磷酸二氢钾和氯化钙，再采用喷雾干燥方法，制得三螺旋胶原蛋白。
35.实施例2
‑
2：
36.本发明实施例提供了一种三螺旋结构胶原及其制备方法，包括以下步骤：
37.(1)胶原蛋白溶解：称取江山聚源公司生产的发酵胶原蛋白17.5g，加纯化水100ml，搅拌使溶解，得到胶原蛋白溶液；
38.(2)混合：取实施例1
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1的溶液与上述胶原蛋白溶液混合，与混合溶液体积比为10:1，混合均匀；
39.(3)降温升温程序：将上述混合溶液由常温急速降温至
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20℃，保持1小时，采用线性升温程序缓慢升温至10℃，升温时间为2小时，在10℃保持1小时；
40.(4)洗涤和干燥：用纯化水适量洗涤，除去蔗糖、磷酸二氢钾和氯化钙，再采用喷雾干燥方法，制得三螺旋胶原蛋白。
41.实施例2
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3：
42.本发明实施例提供了一种三螺旋结构胶原及其制备方法，包括以下步骤：
43.(1)胶原蛋白溶解：称取江山聚源公司生产的发酵胶原蛋白15g，加纯化水100ml，搅拌使溶解，得到胶原蛋白溶液；
44.(2)混合：取实施例1
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1的溶液与上述胶原蛋白溶液混合，与混合溶液体积比为10:1，混合均匀；
45.(3)降温升温程序：将上述混合溶液由常温急速降温至
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20℃，保持1小时，采用线性升温程序缓慢升温至10℃，升温时间为2小时，在10℃保持1小时；
46.(4)洗涤和干燥：用纯化水适量洗涤，除去蔗糖、磷酸二氢钾和氯化钙，再采用喷雾干燥方法，制得三螺旋胶原蛋白。
47.将实施例1得到的三螺旋胶原蛋白用圆二色谱仪检测，其色谱图如图1所示(图中上图为本发明制备的三螺旋结构胶原色谱图，下图为普通胶原蛋白(实质为明胶)色谱图)，根据图1中上图显示，在197nm有倒峰，为三螺旋胶原的特征；下图为胶原蛋白(即明胶)典型圆二色谱图，显示，在197nm没有吸收峰。
48.由色谱图对比可知，通过本发明方法制得的胶原拥有了三螺旋结构的胶原，使得本身无活性的单链明胶，形成具有三螺旋结构的胶原，解决了利用生物工程技术发酵胶原的最后一个技术困难。该方法得到的胶原，较传统提取方法得到的胶原，克服了动物源性病毒、核酸污染、重金属污染、微生物污染等困难，也克服了传统发酵得到的产物不具有三螺旋结构的问题，能够作为一种纯净安全的生物医药材料。
49.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对
本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。