一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.胶原蛋白是人体最丰富的蛋白质之一，胶原蛋白水解物具有显著生物活性，如抗氧化特性、抗高血压活性、降脂活性以及修复受损皮肤的性质。由于胶原蛋白在皮肤中具有双重作用：提供弹性蛋白和胶原蛋白形成的构建模块，充当配体或结合成纤维细胞受体刺激合成分泌透明质酸；因此广泛应用于护肤品之中。胶原蛋白是右旋三螺旋结构，由重复氨基酸三联体序列组成：甘氨酸
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x
‑
y，其中x通常是脯氨酸，y通常是羟脯氨酸。在多肽链的每第三个位置存在小氨基酸甘氨酸允许沿着胶原分子中心轴紧密堆积三螺旋。非螺旋状，球状区域存在于胶原蛋白分子的任何一端，在用适当的蛋白酶切割之前防止原纤维形成。导致其作为支架材料受欢迎的特性包括其相对低的毒性，基质金属蛋白酶的自然降解，易于交联和功能化以及物种之间存在的氨基酸序列的同源性。
3.动物提取胶原蛋白在生物材料领域普遍应用于药物输送和组织工程。从皮肤伤口愈合，到骨支架，到胶原蛋白水凝胶，由于它们的注射性质和原位自组装，也被用于了包括心肌、椎间椎间盘、真皮替代物和再生软骨，但在临床应用中还有许多问题存在。主要障碍是所用胶原的来源，来源于动物或人体的胶原蛋白主要缺点是可能传播疾病，过敏反应，病原体污染。此外，还存在批次之间的差异以及文化原因增加了对动物来源胶原的使用限制。因此，在制备人源胶原蛋白的技术领域，亟需开发一种纯度高、安全性高、亲水性强、生物相容性好的人源胶原蛋白。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用。
5.本发明的技术方案是：一种重组人源胶原蛋白，该重组人源胶原蛋白的编码基因rhiiic8，rhiiic8的核苷酸序列为seq id no.1；rhiiic8的氨基酸序列为seq id no.2。
6.一种含有编码基因rhiiic8的表达载体。
7.一种含有编码基因rhiiic8的基因工程菌。
8.一种重组人源胶原蛋白的制备方法，方法包括如下步骤：
9.(1)获得重组载体：选取人类三型胶原保守区域肽段：
10.gerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgpt，将该序列重复8次进行人工全基因合成rhiiic8，将其构建到pet22b的表达载体中获得重组载体；
11.(2)构建重组基因工程菌：提取质粒、将其转化到bl21
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de3
‑
plyss感受态细胞中，挑取单克隆并对其扩大培养，获得重组基因工程菌；
12.(3)制备重组人源胶原蛋白：经过诱导表达目的蛋白，然后对表达产物进行分离纯化，得到高纯度的可溶于水的重组人源胶原蛋白。
13.进一步的技术方案，步骤(3)中分离纯化的具体步骤如下：
14.(3.1)将步骤(2)中的工程菌接种至lb培养基中，37℃培养过夜，按照体积比1:100转接lb培养基，在摇瓶中37℃培养至od600为0.6，加入终浓度为0.1mm的iptg，25℃培养6
‑
8小时，离心力为5000xg离心5分钟，收集菌体沉淀；
15.(3.2)用pbs缓冲液洗涤菌体沉淀后重悬菌体沉淀，选择性加入终浓度1
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5mg/ml溶菌酶的triton x
‑
100溶液帮助裂解细胞，在冰浴下超声破菌，12000rpm离心20min，收集上清液；所述溶菌酶的triton x
‑
100溶液加入量以重悬所用pbs缓冲液体积为10ml/40ml；
16.(3.3)用pbs缓冲液清洗镍离子亲和柱，然后将亲和柱和上清液分别在室温或冰上轻摇30min，上柱，用含有15mm咪唑的pbs溶液洗涤杂蛋白，优选洗脱1柱体积，洗涤至柱上仅剩下了纯rhiiic8蛋白，在柱上加入prescission protease蛋白酶，即ppase，于室温或冰上轻摇2小时，将rhiiic8蛋白从柱上释放出来，用pbs溶液洗脱，优选1/2柱体积，收集洗脱液，所得产物透析过夜，冻干，获得纯化的重组人源胶原蛋白；
17.其中，所述蛋白酶加入量以柱子体积计为1μl/5ml。
18.进一步的技术方案，步骤(3.1)中lb培养基液体的组成为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l，溶剂为去离子水，ph值为7.5，在lb培养基液体中添加15g/l琼脂混匀后得到lb培养基平板。
19.进一步的技术方案，步骤(3.2)中的超声破菌条件为：280w、2s超声，5s间歇，保护温度25℃，破菌时长为15min。
20.进一步的技术方案，步骤(3.3)中冻干的具体步骤为：每5mg蛋白依次加入体积浓度为10％，5％，3％，2％，1％的甘露醇水溶液0.5ml，每个浓度在
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40℃预冻10min，最后
‑
35℃冻干。
21.一种用于组织工程、美容护肤的生物材料，生物材料包含权利要求1所述编码基因的重组人源胶原蛋白或权利要求4
‑
8任一所述制备方法制备得到的重组人源胶原蛋白。
22.本发明的有益效果：
23.1、本发明所选择序列完全来自于人的iii型胶原蛋白保守区域，并对序列进行了不影响氨基酸序列前提下的密码子优化；采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，20小时即可完成一轮发酵，将其应用于生产具有成本低、周期短的优点，bl21
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de3
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plyss表达菌种能够降低细菌的内源蛋白表达并进一步提高了目的蛋白的纯度和产量，表达蛋白量可占菌体总蛋白的25％左右，可达到每毫菌液沉淀含有0.25毫克目的蛋白；
24.2、通过序列分析和实验筛选，其氨基酸组成与天然胶原蛋白氨基酸序列相应部分100％相同，应用于人体不会产生免疫排斥和过敏反应，具有非常好的亲水性和稳定性，可以在人体中行使天然蛋白的功能；
25.3、本发明产品经过活性检测，本发明方法制备的重组人源胶原蛋白室温保存30天活性没有明显下降，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。
附图说明
26.图1为本发明中pet22b
‑
rhiiic8载体构建的质粒图谱，
27.图2为本发明三型胶原肽段筛选结果，
28.图3为本发明rhiiic8与人源胶原蛋白氨基酸比对结果，
29.图4为本发明rhiiic8蛋白纯化后的电泳图，
30.图5为本发明rhiiic8蛋白与人源胶原蛋白相对照的生物活性检测结果。
具体实施方式
31.下面通过非限制性实施例，进一步阐述本发明，理解本发明。
32.本发明所述室温是指25
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30℃。
33.实施例1：rhiiic8基因表达载体的构建及表达
34.由于胶原蛋白的功能与稳定性的特点取决于它的三螺旋结构，根据之前对于其结构稳定性的研究，发现胶原肽链形成三螺旋的过程中氨基酸序列起到决定性的作用。序列中的羟基化化脯氨酸可以与甘氨酸反应形成稳定的氢键，并且由于胶原蛋白的肽链中含有大量的带电氨基酸，正负电氨基酸的特殊排列促使其形成在不同的肽链之间形成稳定的结构。
35.因此，本发明通过将以上两个因素作为筛选潜在肽链的条件，如图2所示，最终在符合这两个特征的候选序列rhiiic1
‑
rhiiic10中得到活性最好的rhiiic8肽段。rhiiic1
‑
rhiiic10的序列如下所示：
36.rhiiic1.gppgppgaigpsgpagkdgesgrpgrpger
37.rhiiic2.gkdgesgrpgrpgerglpgppgikgpagip
38.rhiiic3.gergrpglpgaagargndgargsdgqpgpp
39.rhiiic4.gesgkpganglsgergppgpqglpglagta
40.rhiiic5.gsdgkpgppgsqgesgrpgppgpsgprgqp
41.rhiiic6.gpkgdagapgapggkgdagapgergppgla
42.rhiiic7.gergapgekgeggppgvagppggsgpagpp
43.rhiiic8.gerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgpt
44.rhiiic9.gppgpvgpagksgdrgesgpagpagapgpa
45.rhiiic10.gppgkdgtsghpgpigppgprgnrgergse
46.重组人源胶原蛋白的制备方法的具体制备步骤如下：
47.(1)类人源胶原蛋白rhiiic8基因的获取
48.选取人类三型胶原保守区域肽段，将该段序列重复8次并进行了密码子的优化，委托上海派森诺生物科技有限公司进行全基因合成，基因两端加入xba i和sal i酶切位点，核苷酸序列为seq id no.1所示，记为基因rhiiic8：
49.atgggagaacgaggcggccctggaggacctggccctcagggtcctcctggtaagaatggtgaaaccggacctcagggacctccaggacctactggtgagcgaggtggtccaggtggccctggcccacaaggcccacccggaaagaacggtgagactggtccacaaggtcctccaggtccaaccggcgaacgaggaggacctggaggacctggtcctcagggtccgcctgggaagaatggtgaaacaggaccgcagggacctcctggacctacgggtgagcgaggtggtccaggcggtcctggccctcaaggacctccaggcaagaacggtgagactggccctcaaggaccaccaggtccaactggcgaacgaggcggccctggaggacctggcccacagggtccgcctggaaagaatggtgaaactggacctcagggtcctccaggacctactggtgaacgaggtggacctggtggacctggcccacaaggtccaccaggcaagaacggtgagacaggccctcagggacctccaggtcctactggagagcgaggaggcccaggaggccctggccctcagggacctcctggtaagaatggtgaaaccggaccacaagggccaccaggacctactggcgagcgaggtggtcctggcggtcctggccctcagggtccac
caggaaagaacggtgagacgggtcctcagggacctccagggccaaca。
50.基因rhiiic8编码蛋白氨基酸序列为seq id no.2所示。
51.mgerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgptgerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgptgerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgptgerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgptgerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgptgerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgptgerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgptgerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgpt。
52.(2)重组表达载体pet22b
‑
rhiiic8的构建
53.将序列为gerggpggpgpqgppgkngetgpqgppgpt的基因单克隆接种至5ml lb培养基中，37℃扩大培养过夜后，提取带有目的基因的质粒，利用xba i和sal i进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的基因，并与相应酶切处理过的pet22b表达载体(含有his标签)37℃共孵育2h，如图1，加入t4 dna连接酶，25℃连接4小时，转化大肠杆菌dh5α，用含0.1mg/ml氨苄青霉素的lb平板筛选挑出白斑克隆，利用pcr的方法鉴定阳性克隆正确，挑取阳性克隆进行测序，确定重组质粒含有正确的基因序列阅读框架，成功构建重组表达载体pet22b
‑
rhiiic8；将正确的克隆接种至5ml lb培养基中，37℃扩大培养过夜，利用康为质粒提取试剂盒提取质粒，获得质粒pet22b
‑
rhiiic8。
54.(3)重组人源胶原蛋白的诱导和表达
55.将步骤(2)中质粒pet22b
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rhiiic8转化大肠杆菌bl21
‑
de3
‑
plyss(购自唯地生物ec1003s)，用含0.1mg/ml氨苄青霉素的lb平板筛选出单克隆，在5ml lb培养基中37℃培养过夜，按照体积比1:100转接至lb培养基，在摇瓶中37℃培养至od600为0.6，加入终浓度为0.1mm的iptg，25℃培养6
‑
8小时，5000
×
g离心5分钟，收集菌体沉淀，保存于
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20℃或者立即进入下步纯化。
56.(4)重组人源胶原蛋白rhiiic8的纯化
57.取5g步骤(3)的菌体沉淀用pbs缓冲液洗涤，用40ml pbs缓冲液重悬菌体沉淀，加入10ml含终浓度5mg/ml溶菌酶的triton x
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100溶液帮助裂解细菌，超声破菌(280w、2s超声，5s间歇，全长45min，保护温度25℃)，12000rpm离心20min，收集上清液，该上清液中即含有大量的重组人源胶原蛋白rhiiic8。用pbs缓冲液清洗镍离子亲和柱(ni
‑
nta预装重力柱，5ml(生工c600793))，然后将亲和柱和上清液分别在室温或冰上轻摇30min，上柱，用5ml含有15mm咪唑的pbs溶液洗涤杂蛋白，柱上就剩下了纯的重组人源胶原蛋白rhiiic8，在柱上加入1μl具有his标签的prescission protease(简称ppase)蛋白酶，于室温或冰上轻摇2小时，即可将rhiiic8蛋白从柱上释放出来，用2.5ml pbs溶液洗脱，收集洗脱液并透析过夜(透析袋，rc膜，14kd，扁平宽度44mm(生工f600112))，冻干(按每5mg蛋白依次加入不同体积浓度(10％，5％，3％，2％，1％)的甘露醇水溶液0.5ml，每个浓度在
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40℃预冻10min，最后
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35℃冻干)，获得纯化的重组人源胶原蛋白rhiiic8。取一部分纯化样品进行page胶电泳，来检测蛋白质大小及纯度，检测结果如图4所示，蛋白质大小接近23kda，在接近28kda marker下方有一条单一的清晰的目地蛋白条带。
58.实施例2、重组人源胶原蛋白rhiiic8活性检测
59.利用bca法蛋白浓度测定试剂盒(碧云天p0006)测定蛋白质浓度。
60.bca方法的原理：在碱性条件下蛋白质分子中肽键结构与cu2+络合并将cu2+还原成cu1+。bca特异地与cu1+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562nm处有最大的光吸收值并
于蛋白质浓度成正比。该测定法实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。
61.测定蛋白质浓度的具体步骤如下：
62.(1)bca工作液：bca试剂a与bca试剂b按体积比50:1配制bca工作液，充分混匀。
63.(2)样品检测
64.将实施例1中步骤(4)制备的纯化重组人源胶原蛋白rhiiic8用pbs制备成0.5mg/ml的样品，取20μl样品到96孔板的样品孔中，各孔加入200μl bca工作液，37℃放置30分钟；
65.测定a562，根据蛋白浓度＝(a562值
‑
0.16)/0.712计算出样品中蛋白浓度为10mg/ml。
66.(3)细胞的贴壁率
67.3t3细胞的培养：鼠纤维原细胞3t3(购自继和生物jh
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m2003)接种至含10％fbs的dmem培养基，37℃培养5～6h或过夜后，观察细胞贴壁情况。每两天换一次培养液，培养至细胞长到70～80％，即为3t3细胞。
68.将实施例1中步骤(4)制备的纯化重组人源胶原蛋白rhiiic8和人源胶原蛋白标准品(购自生工a001654)分别用pbs配制成0.5mg/ml蛋白溶液。
69.向96孔板中加入100μl0.5mg/ml的重组人源胶原蛋白rhiiic8溶液和人源胶原蛋白标准品溶液分别作为待测细胞和对照细胞，以pbs为空白对照，室温静置60min。每孔中加入上述105个3t3细胞，37℃孵育60min。每孔用pbs清洗4次。用细胞粘附检测试剂盒(贝博bb
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48120)检测od450nm的吸光度。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁程度。
70.细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。以人胶原蛋白标准品的贴壁率为1，可以测算出rhiiic8样品的相对细胞黏附活性，其中，细胞粘附率的计算公式如下：
71.细胞粘附率％＝((待测细胞od
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空白od)/(对照细胞od
‑
空白od))x100计算结果如图5所示，相比于人源胶原蛋白40％的细胞粘附效率，rhiiic8的细胞粘附效率可以达到90％；
72.综上所述，本发明设计并制备得到的人源胶原蛋白的蛋白的活性高，可以广泛应用于生物医药和化妆品行业。