一种β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用

一种
β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用
技术领域
1.本发明涉及一种β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用，属于代谢工程领域。


背景技术：

2.β-丙氨酸（3-氨基丙酸）是一种非蛋白质氨基酸，存在于所有生物中。β-丙氨酸作为泛酸的重要组成部分，是辅酶a和酰基载体蛋白合成的前体。以往的研究表明，在微生物体内，缺乏β-丙氨酸合成途径是致命的，因为不能合成辅酶a。另外，β-丙氨酸也可作为补品，被体内吸收后，可与组氨酸偶联形成二肽，在人体肌肉和脑组织中起重要作用。因此，β-丙氨酸广泛应用于药物(如帕米膦酸和胍丙酸和巴尔)、饲料和食品添加剂等领域。
3.目前β-丙氨酸的合成方法主要有化学催化法、酶法和微生物发酵法，其中化学催化法是工业生产β-丙氨酸的主要方法。然而，以丙烯酰胺、丁二酰亚胺或β-氨基丙腈为原料的化学催化法，由于环境和社会的压力，是不可持续的。因此，利用酶法和微生物发酵法生产β-丙氨酸，引起了学者的兴趣。目前，许多生物的adc被表征，然后被用于酶法生产β-丙氨酸。虽然酶法合成β-丙氨酸取得了很大进展，并初步满足了工业应用的需要，但微生物发酵法仍是一种很有前途的工业生产方法。β-丙氨酸是以草酰乙酸和富马酸为前体合成的天门冬氨酸衍生物。在大肠杆菌中，草酰乙酸和富马酸可以通过三羧酸循环的还原/氧化分支来合成。因此通过tca循环的还原途径合成β-丙氨酸在理论产量和能量消耗方面更有优势。


技术实现要素：

4.本发明的目的提供一种β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用，满足β-丙氨酸工业应用的需要。
5.为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：一种β-丙氨酸生产菌，由如下方法构建获得：（1）以e. coli w3110为出发菌，将其基因组中pand基因的启动子替换为trc启动子，得到重组菌株e. coli w3110/trc-pand，记为ala1；（2）将源自bacillus subtilis的外源基因pand整合入质粒ptrc99a中，得到质粒ptrc99a-pand；将质粒ptrc99a-pand导入ala1中，增强pand基因的表达，得到重组菌株ala1/ptrc99a-pand，记为ala2；（3）将ala2基因组中的ppc基因的启动子替换为trc启动子，得到重组菌株ala2/trc-ppc，记为ala3；（4）将ala3基因组中的pyka基因敲除，得到重组菌株ala3/
△
pyka，记为ala4；（5）将ala4基因组中的aspa基因敲除，得到重组菌株ala4/
△
aspa，记为ala5，即为所述β-丙氨酸生产菌。
6.大肠杆菌中β-丙氨酸生物合成途径及本发明涉及的基因工程改造示意图参见图1。首先，在出发菌e. coli w3110的基础上，用trc启动子替换基因pand的原始启动子，促进天冬氨酸转化为β-丙氨酸；再将bacillus subtilis来源的pand整合到质粒ptrc99a质粒
中，并导入工程菌中，进一步促进天冬氨酸转化为β-丙氨酸；然后，通过启动子替换，强化基因ppc的表达，增强天冬氨酸合成的前体草酰乙酸的供应；再通过敲除基因pyka，降低碳通量流入tca循环；最后，通过敲除基因aspa阻断天冬氨酸降解为富马酸；最终得到β-丙氨酸生产菌株。
7.本发明还涉及构建所述β-丙氨酸生产菌的方法，所述方法如下：（1）运用crispr-cas9基因编辑技术，将出发菌e. coli w3110基因组中的pand基因的启动子替换成trc启动子，得到重组菌株w3110/trc-pand，记为ala1；（2）将源自bacillus subtilis的外源基因pand整合入质粒ptrc99a中，得到质粒ptrc99a-pand；将质粒ptrc99a-pand导入步骤ala1中，增强pand基因的表达，得到重组菌株ala1/ptrc99a-pand，记为ala2；（3）运用crispr-cas9基因编辑技术，将ala2基因组中的ppc基因的启动子替换为trc启动子，得到重组菌株ala2/trc-ppc，记为ala3；（4）运用crispr-cas9基因编辑技术，将ala3基因组中的pyka基因敲除，得到重组菌株ala3/
△
pyka，记为ala4；（5）运用crispr-cas9基因编辑技术，将ala4基因组中的aspa基因敲除，得到重组菌株ala4/
△
aspa，记为ala5，即为所述β-丙氨酸生产。。
8.具体的，步骤（1）trc启动子核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.seq id no.1序列如下：ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagacc具体的，步骤（2）外源基因pand核苷酸序列如seq id no.2所示（编码氨基酸序列如seq id no.3所示）。
10.seq id no.2序列如下：atgtatcgaacaatgatgagcggcaagcttcacagggcaactgttacggaagcaaatctgaattatgtgggaagcattacaattgatgaagatctcattgatgcggtgggaatgcttcctaatgaaaaagtgcaaattgtgaataataataatggagcacgtctggaaacgtatattattcctggtaaacgcggaagcggcgtcatctgcttaaacggtgcagccgcacgccttgtacaggaaggagataaggtcattattatttcctacaaaatgatgtctgatcaagaagcggcaagccacgagccgaaagtggctgttttgaatgatcaaaacaaaattgaacaaatgctggggaacgaaccagcccgtacaattttgtagseq id no.3序列如下：myrtmmsgklhratvteanlnyvgsitidedlidavgmlpnekvqivnnnngarletyiipgkrgsgviclngaaarlvqegdkviiisykmmsdqeaashepkvavlndqnkieqmlgnepartil本发明还涉及所述β-丙氨酸生产菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中的应用。
11.具体的，所述应用为：将所述β-丙氨酸生产菌接种至发酵培养基中，于28~32 ℃、400~800 rpm条件下进行发酵培养48~100h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到β-丙氨酸；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖10~30g/l、硫酸铵10~20g/l、酵母浸粉1~5g/l、kh2po
4 1~5g/l、mgso
4 0.1~2.0g/l、微量金属盐溶液0.5~5ml/l，ph 6.5~7.0，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10 g/l cucl2、10 g/l feso4·
7h2o、1 g/l znso4·
7h2o、0.20 g/l cuso4、0.02 g/l nicl2·
7h2o，溶剂为去离子水。。
12.优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20 g/l，硫酸铵16 g/l，酵母粉2 g/l，
kh2po
4 2 g/l，mgso
4 0.5 g/l，盐溶液 2 ml/l，溶剂为去离子水。
13.通常，所述基因工程菌株发酵前，先接种至lb培养基中，于温度37℃、转速200 rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5~15%接种量接种到发酵培养基中培养。
14.本发明有益效果主要体现在：本发明通过启动子替换过表达基因pand，并引入b. subtilis来源的pand导入到工程菌中，强化天冬氨酸转化为β-丙氨酸。同时通过启动子替换，强化基因ppc的表达，增强天冬氨酸合成的前体草酰乙酸的供应。再通过敲除基因pyka，降低碳通量流入tca循环；最后，通过敲除基因aspa阻断天冬氨酸降解为富马酸；最终得到β-丙氨酸生产菌株，其在发酵过程中，β-丙氨酸产量可达29.35g/l，为后续高产β-丙氨酸工程菌的构建奠定了基础。
附图说明
15.图1为大肠杆菌中β-丙氨酸生物合成途径及本发明涉及的基因工程改造示意图；图2为质粒ptrc99a-pand图谱。
16.（五）具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：以下实施例中，所述卡那霉素（kana）的使用终浓度为50ng/μl。所述盐酸壮观霉素（sd）的使用终浓度为50ng/μl。实施例中所用大肠杆菌感受态细胞为商用购买的大肠杆菌dh5α，重组反应所用的一步法定向克隆无缝克隆试剂盒购于诺唯赞公司，但不局限于此公司。
17.实施例1：ala1菌株的构建构建β-丙氨酸生产菌株采用的基因编辑方法参照文献（zhang, b., et al., metabolic engineering of escherichia coli for d-pantothenic acid production. food chem, 2019. 294: p. 267-275.），该编辑方法使用的工具质粒为ptarget和pcas，具体进行方法如下：ala1菌株的构建是以e. coli w3110为出发菌株（1）ptarget-grna质粒突变设计定点突变引物，将质粒ptarget上20bp同源序列突变成靶基因pand启动子中pam位点前的20bp序列。以ptarget质粒为模板，pt-tpand-f和pt-tpandr为引物，pcr扩增ptarget突变质粒，扩增体系如下：
pcr扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，然后向pcr产物中加入0.5μl的dpni，37℃消化1h，取消化产物10μl加入到100μl的dh5α感受态细胞中进行转化实验，然后将培养液涂布于lb固体培养基（sd抗性），37℃培养过夜。挑取单菌落接种于10ml的lb液体培养基（sd抗性）中，培养18h以上，取菌液送测序并提取突变质粒ptarget-pand-g备用。
18.（2）pcr扩增donor dna和线性化ptarget-pand-g质粒片段以大肠杆菌基因组为模板，分别以tpand-p1、tpand-p2和tpand-p3、tpand-p4为引物pcr扩增出靶基因上下游各约500bp序列作为同源臂（donor dna）。以pt+d cf com、pt+d cr com为引物，ptarget-pand-g为模板，pcr扩增ptarget-pand-g线性化质粒片段。扩增体系如下：pcr扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，然后向线性化ptarget-pand-g质粒片段中加入1μl的dpni，37℃消化1h。然后使用dna清洁试剂盒对dpni消化产物和pcr扩增产物donor dna进行clean up，并检测清洁后产物的dna浓度，-20℃保存备用。
19.（3）一步克隆连接线性化ptarget-pand-g质粒片段和donor dna
取（2）中清洁后的产物，根据线性化ptarget-pand-g质粒片段和donor dna的浓度，利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应。取一步克隆产物10μl加入到100μl的dh5α感受态细胞中进行转化实验，然后将培养液涂布于lb固体培养基（sd抗性）上，37℃培养过夜。待长出单菌落，挑取单菌落接种到10ml的lb液体培养基（sd抗性）中，送测序并提取质粒ptarget-pand-pdg备用。
20.（4）ptarget-pand-pdg的电击转化制备含pcas质粒的w3110菌株的电转感受态。取一只电转感受态，冰浴放置，在超净台中加入2μl ptarget-pand-pdg，用移液器轻柔混匀，冰浴1min；用移液器将混匀液转移至预冷的2mm电击杯中（电击杯需提前在超净台风干），冰浴45s。用纸巾擦干电击杯外侧水雾，置于电转仪中，使用eco 2档电击。在超净台中向电击杯凹槽加入1ml预冷lb培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2ml无菌ep管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μl涂布于lb固体培养基（sd+kana抗性）上，30℃培养过夜。
21.（5）阳性克隆筛选和验证在各靶标基因上游同源臂外侧100bp处设计正向验证引物tpand-vf，替换的trc启动子上设计反向验证引物trc-vr，并以此为正反引物，挑取克隆子作为模板，进行菌落pcr，同时以原基因组为模板作阴性对照。菌落pcr有条带的视为阳性。
22.（6）ptarget-pdg与pcas消除与测序验证将阳性克隆接种于10 ml lb试管（kana抗性），并加入10μl iptg母液，30℃，180 rpm培养12h。取过夜培养菌液划线于lb固体培养基（kana抗性）上，30℃培养过夜。取过夜划线平板，将单菌落编号，并挑取编号的部分单菌落，划线于lb固体培养基（sd抗性）上所对应的区域，37℃培养过夜。在lb固体培养基（sd抗性）所对应的区域不能生长的单菌落为ptarget-pand-pdg成功消除的克隆。
23.将ptarget-pand-pdg成功消除的克隆接种于10 ml lb试管（无抗性），37℃，180rpm培养12h。取过夜培养菌液，划线于lb固体培养基（无抗性）上，37℃培养过夜。取过夜培养菌液，将单菌落编号，并挑取编号的部分单菌落，划线于lb固体培养基（kana抗性）上所对应的区域，30℃培养过夜。在lb固体培养基（kana抗性）所对应的区域不能生长的单菌落为pcas成功消除的克隆。
24.（7）阳性克隆测序验证挑取ptarget-pdg与pcas均成功消除的克隆作为菌落pcr模板，以验证引物进行菌落pcr，菌落pcr产物送测序，验证阳性克隆，得到ala1。
25.实施例2：ptrc99a-pand质粒的构建以ptrc99a质粒（实验室保藏）为模板，ptrc99a-f、ptrc99a-r为引物，pcr扩增线性化质粒片段，同时以pand-f、pand-r为引物，b. subtilis基因组为模板，扩增pand片段（seq id no.2，编码氨基酸序列如seq id no.3所示）。利用dpni消化扩增的线性化质粒片段，然后使用clean up试剂盒对消化后的线性化ptrc99a载体片段和pand片段进行清洁，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，涂布在含有卡那霉素的lb平板上。阳性克隆送测序公司测序，确定连接成功的质粒ptrc99a-pand。将构建的质粒ptrc99a-pand转化入ala1得到菌株ala2。
26.实施例3：trc启动子替换基因ppc的原始启动子构建菌株ala3
（1）ptarget-grna质粒突变以ptarget为模板，tppc-pt f和tppc-pt r为引物，pcr扩增ptarget突变质粒。pcr产物经消化处理后，转化进入dh5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒ptarget-ppc-g。
27.（2）构建质粒ptarget-ppc-pdg以tppc-p1、tppc-p2和tppc-p3、tppc-p4为引物pcr扩增靶基因上下游donor dna。同时以p t+d cf com、p t+d cr com为引物，ptarget-ppc-g为模板，pcr扩增线性化ptarget-ppc-g质粒片段。dpni消化处理pcr扩增的ptarget-ppc-g线性化质粒片段后，使用dna清洁试剂盒对消化后的线性化ptarget-ppc-g质粒片段和donor dna进行clean up，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，经测序验证后得到质粒ptarget-ppc-pdg。
28.（3）ptarget-ppc-pdg的电击转化制备含pcas质粒的ala2菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μl ptarget-ppc-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1ml预冷lb培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2ml无菌ep管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μl涂布于lb固体培养基（sd+kana抗性）上，30℃培养过夜。
29.后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1（4-7），得到菌株ala3。
30.实施例4：敲除基因pyka构建菌株ala4（1）ptarget-grna质粒突变以ptarget为模板，δpyka-pt f和δpyka-pt r为引物，pcr扩增ptarget突变质粒。pcr产物经消化处理后，转化进入dh5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒ptarget-pyka-g。
31.（2）构建质粒ptarget-pyka-pdg以δpyka-p1、δpyka-p2和δpyka-p3、δpyka-p4为引物pcr扩增靶基因上下游donor dna。同时以pt+d cf com、pt+d cr com为引物，ptarget-pyka-pdg为模板，pcr扩增线性化ptarget-pyka-g质粒片段。dpni消化处理pcr扩增的ptarget-pyka-g线性化质粒片段后，使用dna清洁试剂盒对消化后的线性化ptarget-pyka-g质粒片段和donor dna进行clean up，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，经测序验证后得到质粒ptarget-pyka-pdg。
32.（3）ptarget-pyka-pdg的电击转化制备含pcas质粒的ala3菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μl ptarget-pyka-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1ml预冷lb培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2ml无菌ep管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μl涂布于lb固体培养基（sd+kana抗性）上，30℃培养过夜。
33.后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1（4-7），得到菌株ala4。
34.实施例5：敲除基因aspa构建菌株ala5（1）ptarget-grna质粒突变以ptarget为模板，δaspa-pt f和δaspa-pt r为引物，pcr扩增ptarget突变质
粒。pcr产物经消化处理后，转化进入dh5α感受态细胞，经测序验证，得到突变质粒ptarget-aspa-g。
35.（2）构建质粒ptarget-aspa-pdg以δaspa-p1、δaspa-p2和δaspa-p3、δaspa-p4为引物pcr扩增靶基因上下游donor dna。同时以p t+d cf com、p t+d cr com为引物，ptarget-aspa-pdg为模板，pcr扩增线性化ptarget-aspa-g质粒片段。dpni消化处理pcr扩增的ptarget-aspa-g线性化质粒片段后，使用dna清洁试剂盒对消化后的线性化ptarget-aspa-g质粒片段和donor dna进行clean up，再利用一步法定向克隆无缝克隆试剂盒进行重组反应，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞后，经测序验证后得到质粒ptarget-aspa-pdg。
36.（3）ptarget-aspa-pdg的电击转化制备含pcas质粒的ala4菌株的电转感受态。取一只电转感受态，在超净台中加入2μl ptarget-aspa-pdg，冰浴1min后转移至预冷的2mm电击杯中，冰浴45s。置于电转仪中进行电击。电击后立即向杯凹槽中加入1ml预冷lb培养基，倾斜电击杯，从电击杯口吸取全部菌液，转移至2ml无菌ep管中。30℃，180rpm复苏2.5h以上；取200μl涂布于lb固体培养基（sd+kana抗性）上，30℃培养过夜。
37.后续基因编辑、验证及质粒消除同实施例1（4-7），得到菌株ala5。
38.表1：菌株基因型表2：引物序列表
实施例6：工程菌株的摇瓶发酵和发酵罐发酵菌种活化：取-80℃保藏菌种划线接种于活化培养基（固体lb培养基）中，37℃培养过夜；种子培养：用接种环挑取活化种子接种于装有10ml种子培养基（lb培养基）的试管中，37℃，200rpm培养过夜；摇瓶发酵：按5％接种量接种种子液到装有20ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，37℃，200rpm/min振荡培养，发酵周期48h；发酵罐发酵：取种子培养基接种于3瓶含100ml lb培养基的500ml锥形瓶中，37℃，200rpm/min振荡培养12h。按10%的接种量将摇瓶种子液接入含2l发酵培养基的5l发酵罐
中，发酵温度控制在30℃，转速500rpm/min，通过40%氨水控制发酵ph为6.8。发酵过程采用ph-stat模式控制补料，每4h取样检测生物量、残糖和β-丙氨酸的量。
39.摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖20g/l，硫酸铵16g/l，酵母粉2g/l，kh2po
4 1g/l，mgso
4 0.2g/l，caco
3 15g/l，微量金属盐溶液 1ml/l，溶剂为水。发酵罐发酵发酵培养基组成为：葡萄糖20 g/l，硫酸铵16 g/l，酵母粉2 g/l，kh2po
4 2 g/l，mgso
4 0.5 g/l，盐溶液 2 ml/l，溶剂为水。（微量金属盐溶液组成：10 g/l cucl2、10 g/l feso4·
7h2o、1 g/l znso4·
7h2o、0.2 g/l cuso4、0.02 g/l nicl2·
7h2o，溶剂为水）补料培养基组成如下：葡萄糖500g/l、硫酸铵10g/l、酵母浸粉2g/l、kh2po
4 14g/l、mgso
4 8g/l、微量金属盐溶液1ml/l，溶剂为水。
40.发酵结束后，使用氨基酸分析仪检测β-丙氨酸的含量。
41.表3：基因工程菌5l发酵罐补料发酵产β-丙氨酸注：nd：not detected结果显示，通过基因工程操作后，基因工程菌ala5通过摇瓶发酵β-丙氨酸产量达3.23g/l，通过5l发酵罐补料发酵，β-丙氨酸产量达到29.35g/l。