一种基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭固定化漆酶的制备方法

1.本发明属于漆酶的固定化领域，涉及一种固定化漆酶及其制备方法，特别是具体涉及一种基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭固定化漆酶的制备方法。


背景技术：

2.漆酶(ec1.10.3.2)是一种多铜氧化还原酶，可降解酚类和非酚类复合化合物，经常作为各类芳香族化合物的催化剂。漆酶的起源可分为植物科、真菌科、细菌科和昆虫科四种。漆酶首先在植物漆树的分泌物中发现，并共存于无数高等植物的细胞壁中。然而植物漆酶虽然丰富，但对真菌漆酶的研究较为完备。在一个广泛的真菌家族中，有无数种可以产生漆酶的真菌，例如子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲。随着人类对环境保护意识的增强及对资源利用需求的增长，漆酶由于其高效性，专一性在有机合成，染料脱色，生物传感器制备，废水处理，土壤修复等方面均有着广泛的应用。然而游离漆酶在热稳定性，可重用性，对污染物的降解效率等方面仍存在明显的不足。因此，通过其与负载材料的结合包括吸附，交联，包埋，共价结合等实现固定化是如今提高漆酶稳定性，可重用性的主要策略之一。同时，适当地选择负载材料可以实现漆酶与材料同时吸附或降解污染物的双功能性，大大提高污染物的去除效率。
3.生物炭是生物质在限氧条件下制备的一类含碳固体物质，由于其拥有高孔隙率，大比表面积和对重金属及有机污染物的强吸附能力使其成为固定化的主要支撑材料之一。但传统生物炭对污染物的吸附容量较低，施用后难以从环境中回收，所以通过改性可以进一步改变其孔隙结构，增加其表面的官能团，使其对污染物有更强的吸附和固定能力。碱改性能够降低生物炭的灰分含量，增加羟基和羧基的数量。而磁改性可以在生物炭上引入磁性物质，使其更便于从环境中分离回收，降低处理成本。因此，采用改性生物炭作为固定化技术的负载材料，对于保持酶的活性，提高固定化酶的稳定性及可重复使用性有深刻的环境意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种成本低，便于从环境中回收再利用，提高酶贮藏稳定性及操作稳定性的基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭固定化漆酶的制备方法。现有的固定化酶制备方法较多，但多以单一固定化技术为主，例如包埋，吸附，交联等，上述方法不利于保持酶的活性且酶的负载量不足，旨在解决上述缺陷，本发明提供一种通过改性生物炭吸附，戊二醛交联的复合漆酶固定化技术。并且减少了酶活性的流失，增加了酶的负载量，提高了固定化产物的回收率，同时通过选用低成本负载材料，使其能够大规模生产应用。
5.本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭固定化漆酶的制备方法，包括如下步骤：
6.(1)将烘干后的小麦秸秆粉末于马弗炉中500℃加热2.5小时，热解制备生物炭；
7.上述的小麦秸秆生物炭的平均孔径为3nm-16nm；
8.上述的小麦秸秆生物炭的孔隙大小为0.001cm3/g-0.008cm3/g；
9.上述的小麦秸秆生物炭的比表面积为5.991m2/g。
10.(2)氢氧化钠改性生物炭的制备：
11.将步骤(1)获得的20g生物炭(wbc)与4mol/l的naoh溶液按质量比1比3充分混合，在室温下用磁力搅拌器搅拌两小时，随后置于烘箱中于105℃烘干。将干燥样品放置在250ml刚玉舟中，并通入80～100ml/min的氮气，在管式炉中以10℃/min加热至500℃再以5℃/min加热至800℃并保温90min，随后冷却至室温。将制备好的生物炭用1.5mol/l的盐酸浸泡两小时，接着用去离子水洗涤数次，在烘箱中烘干，用100目筛子使其均匀化制得氢氧化钠改性生物炭(sbc)，存于玻璃干燥皿内，备用。
12.上述的氢氧化钠改性生物炭的平均孔径为2nm-21nm；
13.上述的氢氧化钠改性生物炭的孔隙大小为0.01cm3/g-0.04cm3/g；
14.上述的氢氧化钠改性生物炭的比表面积为41.285m2/g。
15.(3)磁改性四氧化三铁晶体生物炭的制备：
16.将步骤(2)中获得的碱改性生物炭与0.02molfecl3·
6h2o和0.01molfecl2·
4h2o在200ml乙醇溶液中充分混合。将混合物置于250ml刚玉舟中，用锡纸遮盖于管式炉中以10℃/min加热至500℃热解并保温110min,同时以80～100ml/min左右的速度通入氮气做保护，并冷却至室温。随后用去离子水洗涤数次，制得磁性多孔生物炭sbc@fe3o4。
17.上述的磁性多孔生物炭的平均孔径为2nm-6nm；
18.上述的磁性多孔生物炭的孔隙大小为0.01cm3/g-0.06cm3/g；
19.上述的磁性多孔生物炭的比表面积为78.262m2/g。
20.(4)固定化漆酶制备：将步骤(3)中获得的1g磁改性生物炭分散在25ml戊二醛溶液中2.5小时。随后，活化的载体用去离子水和ph为5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤数次，在烘箱中于105℃烘干得到sbc@fe3o4@ga的磁改性戊二醛激活生物炭。接着通过三因素五水平正交实验法在上述载体中根据不同酶炭比，加入不同浓度梯度的漆酶溶液，用磁力搅拌器搅拌数小时，得到sbc@fe3o4@ga@lac产物，并根据漆酶的负载量的多少选取最佳固定化方法。产物用ph为5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤数次，抽滤伴以磁铁收集，于冰箱-20℃保存，备用。
21.所选步骤(1)中烘箱温度为105℃，加热时间为220min。
22.所述步骤(2)氢氧化钠溶液配置条件：取80g的naoh粉末溶于500ml蒸馏水中配置4mol/l的naoh溶液。
23.所述步骤(2)中烘箱的温度为105℃-120℃。
24.所述步骤(3)中乙醇溶液为分析纯乙醇。
25.所述步骤(4)的戊二醛溶液为体积比2.5％的戊二醛溶液。
26.所述步骤(4)的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液由0.1mol/l柠檬酸溶液与0.2mol/l磷酸氢二钠溶液混合而成。
27.所述步骤(4)中抽滤膜采用0.22μm有机尼龙滤膜。
28.所述步骤(4)中正交实验三因素分别为酶炭比(质量比)、漆酶溶液浓度(u/ml)、固
定化时间(h)。
29.其中，炭酶比的五水平变量分别为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6，漆酶溶液浓度的五水平为2、4、6、8、10，固定化时间的五水平变量为8、12、16、20、24。
30.本发明的技术进步表现如下：该方法能实现一种基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭的固定化漆酶。从而解决漆酶活性维持时间短的缺陷。
31.1.本发明采用小麦秸秆作为生物质，小麦秸秆生物炭作为原料不仅能缓解秸秆焚烧导致的污染问题，而且生物炭能作为环境的改良剂长期依存在环境中，可以和漆酶协同吸附降解污染物。
32.2.本发明采用吸附交联复合固定化技术固定漆酶，固定效果好，漆酶流失少，可重复使用，且热稳定性得到提高。
33.3.本发明采用磁改性生物炭作为负载材料，具有强磁性，可以实现环境中回收再利用，且操作简单，制备成本低，适合大规模生产，具有显著经济效益和工业价值。
附图说明
34.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中技术方案进行清楚、完整的描述。
35.图1是本发明制备的磁改性四氧化三铁晶体生物炭，磁改性戊二醛激活生物炭和固定化漆酶的sem图。其中，(a)为磁改性四氧化三铁晶体生物炭,(b)为磁改性戊二醛激活生物炭，(c)为固定化漆酶。
36.图2是本发明制备的磁改性四氧化三铁晶体生物炭，磁改性戊二醛激活生物炭和固定化漆酶的x射线衍射图。
37.图3是本发明制备的小麦秸秆生物炭、氢氧化钠改性生物炭、磁改性四氧化三铁晶体生物炭的n2吸附-脱附曲线和孔径分布图。
38.图4是本发明制备的磁改性戊二醛激活生物炭和固定化漆酶的磁滞回归曲线图。
39.图5是游离漆酶和固定化漆酶的ph稳定性对照图。
40.图6是游离漆酶和固定化漆酶的温度稳定性对照图。
41.图7是固定化漆酶的操作稳定性图。
具体实施方式
42.以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
43.本发明的实施例选取漆酶，购买于源叶生物(80498-15-3)，规格为120u/g。
44.方法使用的设备主要有马弗炉、管式炉、磁力搅拌器、真空抽滤器、紫外分光光度计、场发射扫描电子显微镜、振动样品磁强计、x射线衍射仪和全自动比表面积与孔隙度分析仪等。
45.以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但不因此而本发明的保护范围。
46.实施例1：
47.一种本发明的基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭固定化漆酶，漆酶通过吸附交联的复合技术固定在改性多孔生物炭上。
48.本实施例中的基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：
49.(1)小麦秸秆生物炭制备
50.取60g天然小麦秸秆粉末，在烘箱中105℃烘干，随后于马弗炉中500℃热解，得到小麦秸秆生物炭，置于玻璃干燥皿中保存备用。
51.(2)氢氧化钠改性生物炭的制备
52.将步骤(1)获得的20g生物炭(wbc)与4mol/l的naoh溶液按质量比1比3充分混合，在室温下用磁力搅拌器搅拌两小时，随后置于烘箱中于105℃～120℃烘干。将干燥样品放置在250ml刚玉舟中，并通入80ml/min的氮气，在管式炉中以10℃/min加热至500℃再以5℃/min加热至800℃并保温90min，随后冷却至室温。将制备好的生物炭用1.5mol/l的盐酸浸泡两小时，接着用去离子水洗涤数次，在烘箱中烘干，用100目筛子使其均匀化制得氢氧化钠改性生物炭(sbc)，存于玻璃干燥皿内，备用。
53.(3)磁改性四氧化三铁晶体生物炭的制备
54.将步骤(2)中获得的sbc与0.02molfecl3·
6h2o，0.01molfecl2·
4h2o在200ml分析纯乙醇溶液中充分混合。将混合物置于250ml刚玉舟中，用锡纸遮盖于管式炉中以10℃/min加热至500℃热解并保温110min,同时以80ml/min左右的速度通入氮气做保护，并冷却至室温。随后用去离子水洗涤数次，制得磁性多孔生物炭sbc@fe3o4，存于玻璃干燥皿内，备用。
55.(4)固定化漆酶制备
56.将步骤(3)中获得的1g磁改性生物炭分散在25ml戊二醛溶液中2.5小时。随后，活化的载体用去离子水和ph为5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤数次，在烘箱中烘干得到sbc@fe3o4@ga的磁改性戊二醛激活生物炭。接着通过三因素五水平正交实验法在上述载体中根据不同酶炭比，加入不同浓度梯度的漆酶溶液，用磁力搅拌器搅拌数小时，得到sbc@fe3o4@ga@lac产物，并根据漆酶的负载量的多少选取最佳固定化方法。产物用ph为5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗涤数次，抽滤伴以磁铁收集，于冰箱-20℃保存，备用。
57.固定化酶负载量的测定：
58.称取0.05g固定化酶，加入1ml缓冲液，离心10min(温度为4℃，离心力为8000g)，取上清液即为待测液。在石英比色皿中分别加入500微升蒸馏水和500微升考马斯亮蓝指示剂作为空白，随后在石英比色皿中分别加入500微升待测液和500微升考马斯亮蓝指示剂在620nm下测得吸光度，通过计算得到漆酶的负载量(mg/g)，计算公式如下：
59.初始漆酶的蛋白浓度ci(mg/ml)＝0.07
×
(δa+0.0007)
60.固定化后漆酶的蛋白浓度cf(mg/ml)＝0.07
×
(δa+0.0007)
61.其中，δa代表测定前后吸光度的变化。
[0062][0063]
其中，v1代表初始漆酶蛋白浓度测定过程中添加的游离漆酶溶液量(ml)，v2代表固定化后漆酶蛋白浓度测定过程中添加的待测液量(ml)。
[0064]
酶活性测定：
[0065]
取15mg左右游离漆酶或固定化漆酶于15ml离心管中，依次加入2ml最适ph的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和2ml的0.5mmol/labts溶液，立刻离心(离心力为8000g,4℃)10min,
取1ml上清液于石英狭缝比色皿中，在420nm下测得吸光度，随后充分振荡，在最适温度下水浴3min，再次离心(离心力为8000g,4℃)10min,取1ml上清液于石英狭缝比色皿中，在420nm下再次测得吸光度。用abts法公式计算得酶活性，公式如下：
[0066][0067]
其中，δa代表abts的吸光度的增加，v
t
代表反应体系的体积(l)、ε代表abts的摩尔消光系数(36000l
·
m-1
·
cm-1
)、δt代表反应时间(min)、m代表酶的质量(g)。
[0068]
实施例2：
[0069]
关于实施例1中的制备固定化漆酶的正交实验测定研究：
[0070]
根据正交实验排列，改变不同的因素共进行25组实验，其测定结果如下表1：
[0071]
表1
[0072]
[0073][0074]
其极差分析结果如下表2所示：
[0075]
表2
[0076]
水平炭酶比(g/g)酶浓度(u/ml)固定化时间(h)10.36920.38640.232020.31370.31070.230130.33230.31620.515040.36280.33380.252650.34430.37530.4926delta0.05540.07560.2849排秩321
[0077]
由极差分析的结果可知，基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭固定化漆酶的最优固定化条件是：炭酶比1:2，漆酶浓度2u/ml，固定化时间16h。而且三因素优先级顺序为固定化时间，漆酶浓度，炭酶比。
[0078]
实施例3：
[0079]
根据实施例2得出的最优固定化条件制备固定化漆酶，并对其进行性能表征与测试：
[0080]
将实施例1中的磁改性四氧化三铁晶体生物炭，磁改性戊二醛激活生物炭和固定
化漆酶进行场发射扫描电镜(sem)检测分析，结果如图1所示。其中(a)为磁改性四氧化三铁晶体生物炭,(b)为磁改性戊二醛激活生物炭，(c)为固定化漆酶。由图(a)可知，磁改性四氧化三铁晶体后的生物炭孔隙变得更均匀，由图(b)可知，磁改性戊二醛激活生物炭使多孔生物炭部分孔隙增大，由图(c)可知，本发明以磁改性戊二醛激活生物炭为载体，漆酶成功固定在载体材料上，且漆酶经固定化后所得固定化漆酶的结构无变化。
[0081]
将实施例1中的磁改性四氧化三铁晶体生物炭，磁改性戊二醛激活生物炭和固定化漆酶进行x射线衍射(xrd)分析，其中(a)为磁改性四氧化三铁晶体生物炭，(b)为磁改性戊二醛激活生物炭，(c)为固定化漆酶。由图2可知，图案中在30.1
°
和35.6
°
出现了两种衍射峰，根据pdf(89-0691)可以指定为fe3o4晶体，表明磁改性生物炭上负载的是fe3o4晶体。
[0082]
将实施例1中的小麦秸秆生物炭、氢氧化钠改性生物炭、磁改性四氧化三铁晶体生物炭的进行全自动比表面积与孔隙度分析(bet)。由图3可知，从小麦秸秆生物炭到氢氧化钠改性生物炭到磁改性四氧化三铁晶体生物炭吸附等温线从i型向ii型过渡，ii型吸附等温线多为非孔性或者大孔吸附剂上典型的多分子层物理吸附过程，结合孔径分布图表明，氢氧化钠改性生物炭与磁改性四氧化三铁晶体生物炭介孔与大孔比例增多。
[0083]
将实施例1中的磁改性戊二醛激活生物炭和固定化漆酶进行振动样品磁强分析(vsm)。由图4可知，作为负载材料的磁改性戊二醛激活生物炭饱和磁场强度约为7.3emu/g，而固定化漆酶能将其提升至约17emu/g，提高了1.33倍，属于强磁性。表明漆酶在此磁性材料上的负载不但没有削弱磁性，反而增强了磁性，更有利于固定化漆酶在环境中的吸附作用和回收功能。
[0084]
实施例4：
[0085]
根据实施例2得出的最优固定化条件制备固定化漆酶，并对其进行稳定性测试，包括ph稳定性，温度稳定性和操作稳定性，其步骤与结果如下：
[0086]
(1)ph稳定性
[0087]
在游离漆酶和固定化漆酶活性测定过程中，通过改变柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的ph来测定不同ph环境梯度下的酶活，从而得到漆酶活性的最适ph，其中ph梯度设置为2.5，3，4，5，6，7。具体方法如下：取15mg左右游离漆酶或固定化漆酶于15ml离心管中，依次加入2ml不同ph梯度的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和2ml的0.5mmol/labts溶液，立刻离心(离心力为8000g,4℃)10min,取1ml上清液于石英狭缝比色皿中，在420nm下测得吸光度，随后充分振荡，在室温下反应3min，再次离心(离心力为8000g,4℃)10min,取1ml上清液于石英狭缝比色皿中，在420nm下再次测得吸光度。用abts法公式计算得酶活性，将不同ph梯度下的酶活与最高酶活的比例作为相对酶活，以百分数记。
[0088]
由图5可知，基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭的固定化漆酶最适ph范围更宽为2.5～4，分别选取ph为5和3作为测定游离漆酶与固定化漆酶活性时的最适ph。
[0089]
(2)温度稳定性
[0090]
在游离漆酶和固定化漆酶活性测定过程中，通过改变水浴反应温度来测定不同温度环境梯度下的酶活，从而得到漆酶活性的最适温度，其中温度梯度设置为20，30，40，50，60，70℃。具体方法如下：取15mg左右游离漆酶或固定化漆酶于15ml离心管中，依次加入2ml步骤(2)测得的最适ph的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和2ml的0.5mmol/labts溶液，立刻离心
(离心力为8000g,4℃)10min,取1ml上清液于石英狭缝比色皿中，在420nm下测得吸光度，随后充分振荡，在不同水浴温度梯度下反应3min，再次离心(离心力为8000g,4℃)10min,取1ml上清液于石英狭缝比色皿中，在420nm下再次测得吸光度。用abts法公式计算得酶活性，将不同温度梯度下的酶活与最高酶活的比例作为相对酶活，以百分数记。
[0091]
由图6可知，分别选取温度为50℃和60℃作为测定游离漆酶与固定化漆酶活性时的最适温度。
[0092]
(3)操作稳定性
[0093]
将测定酶活性后的固定化漆酶用磁铁吸附在离心管外侧，再倒出所加缓冲液与abts底物溶液，随后用去离子水洗涤三次，根据步骤(2)中得出的固定化漆酶最适温度继续按照步骤(2)中测活性的方法测定循环回收后的固定化漆酶活性，以此循环往复十次，将每次测定的酶活性与第一次酶活性的比例作为相对酶活，以百分数记。
[0094]
由图7可知，前三次操作后酶活性几乎没有减少，直至第四次酶活性仍能保持90％左右。第五次后酶活性骤减至约60％，第六次至第十次稳定保持在约30％左右。表明此基于氢氧化钠和四氧化三铁晶体复合改性生物炭的固定化漆酶能稳定使用四到五次左右。