两性霉素B亲水性多肽衍生物及其应用

两性霉素b亲水性多肽衍生物及其应用
技术领域
1.本发明涉及医药领域，具体涉及一类两性霉素b亲水性多肽衍生物的及其应用。


背景技术：

2.近年来，系统性真菌感染引起越来越多的健康问题，导致全世界每年160万人死亡，其中30-40％是念珠菌感染，20-30％是散播性隐球菌感染。这些感染在免疫功能紊乱的病人中十分常见，尤其是经历抗癌化疗、器官移植、长期使用激素或感染艾滋病的人。现存的抗真菌药物种类很少，并有许多不足，包括抗真菌效果弱、抗真菌谱窄、较强的毒副作用和药物-药物相互作用等，这些缺点严重限制了抗真菌药物的使用。
3.两性霉素b(amb)是从结节链霉菌(streptomyces nodosus)中分离提取得到的一种多烯大环内酯类抗真菌药物。自1955年至今，amb一直被广泛用于系统性真菌感染的治疗，被认为是抗真菌药物的“金标准”。然而，amb具有诸多缺点，包括不溶于水、结构不稳定和容易形成聚集体。更为严重的是amb有很强的毒副作用，尤其是肾毒性，极大限制了其使用剂量，因此系统性真菌感染的死亡率仍然接近50％。
4.因此，本领域急需提供更多易于成药、毒副作用小的抗真菌化合物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种两性霉素b亲水性多肽衍生物及其应用。本发明将亲水性多肽与amb共价接枝，获得amb衍生物，克服amb溶解性差和较大毒副作用等缺点，实现更高的水溶性和更好的抗真菌选择性。
6.本发明第一方面，提供了一种式ⅰ化合物、或其药学上可接受的盐：
[0007][0008]
其中，r1和r2选自下组：
[0009]
1)r1和r2都包含亲水性多肽；或
[0010]
2)r1包含亲水性多肽，r2为h；或
[0011]
3)r2包含亲水性多肽，r1为-oh、c1-4烷氧基、c2-4烯基氧基、c1-4炔基氧基或苯氧基；
[0012]
当r1包含亲水性多肽时，所述亲水性多肽的n端与相连的c＝o通过形成酰胺键直
接相连，或所述亲水性多肽通过连接基团与式i的其他部分相连；
[0013]
当r2包含亲水性多肽时，所述亲水性多肽的c端与相连的-nh-通过形成酰胺键直接相连，或所述亲水性多肽通过连接基团与式i的其他部分相连；
[0014]
所述亲水性多肽各自独立地为由1-20个独立地选自下组的氨基酸形成的肽链：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；且所述亲水性多肽中，丝氨酸占氨基酸总数的40-100％。
[0015]
在另一优选例中，所述连接基团独立地选自下组：-c
1-c5烷基的酰胺基团、半胱氨酸-马来酰亚胺基-c
1-c5烷基、叠氮-炔基-c
1-c5烷基、醛基-氨基-c
1-c5烷基。
[0016]
在另一优选例中，所述亲水性多肽中，丝氨酸占氨基酸总数的50-100％、80-100％，如60％、70％、80％、90％或100％。
[0017]
在另一优选例中，所述亲水性多肽中每个氨基酸独立地为l构型或d构型。
[0018]
在另一优选例中，所述亲水性多肽具有与羧基反应的-nh2端基。
[0019]
在另一优选例中，所述化合物具有式ia结构：
[0020][0021]
其中，n为1-20的正整数。
[0022]
在另一优选例中，所述化合物具有式ib结构：
[0023][0024]
其中，n为1-20的正整数。
[0025]
在另一优选例中，所述亲水性多肽包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个(即n)氨基酸，优选，2-12个，较佳地，3-8个，更佳地，3-6。
[0026]
本发明第二方面，提供了一种药物组合物，包括：
[0027]
(a)活性成分，所述活性成分为如权利要求1所述的式i化合物，或其药学上可接受的盐；
[0028]
(b)药学上可接受的载体。
[0029]
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：液体制剂(如溶液、乳液、悬浮液)、固体制剂(如冻干制剂)。
[0030]
在另一优选例中，所述剂型选自下组：注射剂、粉针剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆、口服液、膏剂、酊剂、贴剂，较佳地，所述剂型为注射剂。
[0031]
本发明第三方面，提供了如本发明第一方面所述的式i化合物、或其药学上可接受的盐，或如本发明第二方面所述的药物组合物的用途，用于制备抗真菌的药物。
[0032]
在另一优选例中，所述真菌选自下组：新型隐球菌(c.neoformans)、皮炎芽生菌、组织胞浆菌、球孢子菌属、孢子丝菌属、念珠菌属(如白色念珠菌(c.albicans))，或其组合。
[0033]
在另一优选例中，所述药物用于预防和/或治疗系统性真菌感染。
[0034]
在另一优选例中，所述真菌为耐两性霉素b的真菌。在另一优选例中，所述药物的剂型选自下组：液体制剂(如溶液、乳液、悬浮液)、固体制剂(如冻干制剂)。
[0035]
在另一优选例中，所述剂型选自下组：注射剂、粉针剂、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆、口服液、酊剂、膏剂、贴剂，较佳地，所述剂型为注射剂。
[0036]
本发明第三方面，提供了一种杀菌的方法，包括步骤：将有效量的如权利要求1的所述化合物，或其药学上可接受的盐，或包含其的药物组合物与真菌接触，从而杀死所述真菌。
[0037]
在另一优选例中，所述真菌选自下组：新型隐球菌(c.neoformans)、皮炎芽生菌、组织胞浆菌、球孢子菌属、孢子丝菌属、念珠菌属(如白色念珠菌(c.albicans))，或其组合。
[0038]
在另一优选例中，所述真菌为环境或产品中存在的真菌。
[0039]
在另一优选例中，所述方法为体外非治疗性的。
[0040]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0041]
图1为实施例1的amb-mal的核磁共振氢谱。
[0042]
图2amb(a)和缀合物(b)的溶血率。
[0043]
图3amb(a)和缀合物(b)的细胞毒性。
具体实施方式
[0044]
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种两性霉素b亲水性多肽衍生物的及其应用。具体地，本发明提供了式i化合物及其药学上可接受的盐，与两性霉素b相比，本发明的化合物具有更高的水溶性和更低的毒性，从而更容易成药，且更安全。在此基础上完成了本发明。
[0045]
术语
[0046]
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
[0047]
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0048]
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换
言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
[0049]
如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40℃，较佳地，25
±
5℃。
[0050]
两性霉素b
[0051]
两性霉素b(amphotericin b，amb)，为多烯类抗真菌药物。对其敏感的真菌有新型隐球菌、皮炎芽生菌、组织胞浆菌、球孢子菌属、孢子丝菌属、念珠菌属等。
[0052][0053]
活性成分
[0054]
本发明提供了一种式i化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。式i化合物为两性霉素b的衍生物。
[0055][0056]
r1和r2如上定义。
[0057]
在另一优选例中，当r1或r2包含亲水性多肽时，可通过连接基团将所述亲水性肽链与-nh或-co-相连，本发明对连接基团没有任何要求，可采用本领域常用的将肽链稳定连接到-nh或-co-的基团，例如(但并不限于)连接基团可以为-c
1-c5烷基的酰胺基团、半胱氨酸-马来酰亚胺基-c
1-c5烷基、叠氮-炔基-c
1-c5烷基、醛基-氨基-c
1-c5烷基。其中，c
1-c5烷基可以具有1、2、3、4或5个碳原子，如对于-半胱氨酸-马来酰亚胺基-c
1-c5烷基-co-可包括马来酰亚胺基乙酰基、马来酰亚胺基丙酰基、马来酰亚胺基丁酰基或马来酰亚胺基已酰基与半胱氨酸的硫原子连接形成的连接基团。其中，半胱氨酸氨酸可通过肽键连接亲水肽链，酰基与-nh连接)。
[0058]
本发明中，所述亲水性多肽可以由1-20个选自下组的氨基酸以任意序列形成：包括无电荷的亲水性氨基酸(甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)或带电荷的氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸)。
[0059]
优选地，所述亲水性多肽主要由丝氨酸形成(ser)，如丝氨酸占多肽氨基酸总数的40-100％；也就是说，除了丝氨酸外，所述亲水性多肽还可以包括其他上述亲水性氨基酸。
[0060]
本发明中，亲水性多肽中每个氨基酸独立地为l构型或d构型。
[0061]
本发明中的化合物含有的碱性片段，包括但不限于胺或咪唑环，可能会和有机或无机酸形成盐。可以成盐的典型的酸包括醋酸盐(如用醋酸或三卤代醋酸，如三氟乙酸)、己二酸盐、藻朊酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二甘醇酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、羟基乙磺酸盐(如，2-羟基乙磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐(如，2-萘磺酸盐)、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯丙酸盐(如3-苯丙酸盐)、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐，水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(如与硫酸形成的)、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐如对甲苯磺酸盐、十二烷酸盐等等。
[0062]
本发明的某些化合物可能含有的酸性片段，包括但不限于羧酸，可能会和各种有机或无机碱形成盐。典型的碱形成的盐包括铵盐、碱金属盐如钠、锂、钾盐，碱土金属盐如钙、镁盐和有机碱形成的盐(如有机胺)，如苄星、二环已基胺、海巴胺(与n,n-二(去氢枞基)乙二胺形成的盐)、n-甲基-d-葡糖胺、n-甲基-d-葡糖酰胺、叔丁基胺，以及和氨基酸如精氨酸、赖氨酸等等形成的盐。碱性含氮基团可以与卤化物季铵盐，如小分子烷基卤化物(如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物及碘化物)，二烷基硫酸盐(如，硫酸二甲酯、二乙酯，二丁酯和二戊酯)，长链卤化物(如癸基、十二烷基、十四烷基和十四烷基的氯化物、溴化物及碘化物)，芳烷基卤化物(如苄基和苯基溴化物)等等。
[0063]
制备方法
[0064]
本发明中，对所述式i化合物的制备方法没有特别要求，可以采用本领域常用的方法制备。
[0065]
一种具体的式i化合物的制备方法，包括步骤：
[0066]
(1)合成所述亲水性多肽；和
[0067]
(2)将两性霉素与所述亲水性多肽进行缩肽反应，将所述亲水多肽与两性霉素通过酰胺肽键连接，从而制得式i化合物。
[0068]
另一种具体的式i化合物的制备方法，包括步骤：
[0069]
(1)合成末端具有一半胱氨酸的亲水性多肽；和
[0070]
(2)将两性霉素与3-马来酰亚胺基-c
1-c5烷基-n-琥珀酰亚胺酯反应，从而在两性霉素的糖氨基引入3-马来酰亚胺-c
1-c5烷基-co-；
[0071]
(3)将末端具有半胱氨酸的亲水性多肽的s原子连接至步骤(2)产物的马来酰亚胺基团，从而获得式i化合物。
[0072]
药物组合物及应用
[0073]
本发明的药物组合物包含上述化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0074]
实验证明，本发明的化合物具有显著的抗真菌效果，可用于预防/治疗真菌感染相关疾病，尤其是治疗系统性真菌感染。
[0075]
特别地，本发明的化合物可用于治疗对两性霉素b不敏感的真菌或对两性霉素b产生耐药性的真菌的感染及相关疾病。
[0076]
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。如所述药物组合物中包含0.01-99wt％的本发明的活性成分，优选地，1-90wt％.
[0077]
如本文所用，术语“治疗有效剂量”是指药物的任何如下所述的量，当单独使用或与另一种治疗剂组合使用该量的药物时，可促进疾病消退，疾病消退表现为疾病症状的严重度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加、或者防止由患病导致的障碍或失能。
[0078]
本发明药物的“治疗有效剂量”也包括“预防有效剂量”，“预防有效剂量”是药物的任何如下所述的量，当将该量的药物单独施用或者与另一种治疗剂组合施用于具有发生疾病的风险或者遭受疾病复发的受试者时，可抑制疾病的发生或复发。
[0079]
通常，药物组合物含有1-2000mg本发明活性成分/剂，更佳地，含有10-500mg本发明活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
[0080]“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0081]
本发明活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
[0082]
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
[0083]
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0084]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。本发明的化合物具有优异的水溶性，因此非常适合用于制备注射剂。
[0085]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味
剂、矫味剂和香料。
[0086]
除了活性活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0087]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0088]
用于局部给药的本发明活性成分的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
[0089]
本发明活性成分可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药。在另一优选例中，所述药物组合物还包含一种或多种抗菌剂，优选地，所述抗菌剂选自下组：β-内酰胺类(如青霉素g、苯氧青霉素、苯唑西林、氨苄西林、氧哌嗪青霉素、美西林和替莫西林)；头孢霉素类(头孢噻吩、头孢拉定、头孢美唑、头孢西丁、头孢替坦、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢米诺、头孢匹罗、头孢唑南、头孢吡普)、单环β-内酰胺类抗菌素(如氨曲南)、氨基糖甙类(如阿米卡星、异帕米星、依替米星)、四环素类(如米诺环素、多西环素、四环素、土霉素)、氯霉素类(如氯霉素)；大环内脂类；林可霉素和克林霉素；多肽类(如万古霉素和去甲万古霉素)；氟喹诺酮类(如奈啶酸、吡啶酸、依诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星)。
[0090]
在某些实施方式中，本发明的活性成分在相同或分开的制剂中与作为联合治疗方案的部分的其它试剂同时使用，或与所述其它试剂依次使用。
[0091]
本发明的活性成分的组合物的治疗有效剂量的一般范围将是：约1-2000mg/天、约10-约1000mg/天、约10-约500mg/天、约10-约250mg/天、约10-约100mg/天，或约10-约50mg/天。治疗有效剂量将以一个或多个剂量给予。然而，应理解，对于任何特定患者的本发明化合物的特定剂量将取决于多种因素，例如，待治疗的患者的年龄、性别、体重、一般健康状况、饮食、个体响应，给予时间、待治疗的疾病的严重性、施用的具体化合物的活性、剂型、应用模式和伴用药物。给定情况的治疗有效量能用常规实验测定，并在临床医生或医师能力和判断范围内。在任何情况中，所述化合物或组合物将基于患者的个体情况以多个剂量给予并以允许递送治疗有效量的方式给予。
[0092]
本发明的主要优点包括：
[0093]
1.本发明的式i化合物，具有由天然氨基酸组成的亲水性多肽，与两性霉素b相比，具有更高的水溶性和更低的毒性，从而更容易成药，且更安全。
[0094]
2.本发明提供了一种新的抗真菌药物，从而为抗真菌提供了新的解决方案。
[0095]
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0096]
实施例1
[0097]
氨基取代的两性霉素b多肽衍生物的合成
[0098]
第一步：马来酰亚胺修饰的amb衍生物的合成
[0099][0100]
将amb(200mg，0.216mmol)置于10ml烘干的棕色瓶中，在氩气氛围下加入超干dmf(4ml)，随后在冰浴下依次加入3-马来酰亚胺基丙酸-n-琥珀酰亚胺酯(69mg,0.259mmol)和et3n(36μl,0.259mmol)。室温避光反应过夜后，将反应后的溶液转移到含有200ml-20℃乙醚的锥形瓶中，大量黄色固体析出。将溶液过滤后用乙醚彻底清洗滤饼，真空干燥，得到黄色固体产物amb-mal 209mg，收率90％。经hplc确认amb已经消耗完毕，产物纯度》95％，核磁共振氢谱如图1所示。
[0101]
第二步：亲水性多肽的合成
[0102]
通过半胱氨酸引入巯基，方便与amb-mal进行micheal加成反应，合成以下亲水性多肽：
dlsdlsl
c，
dlsdlsdlsl
c，
dlsdlsdlsdlsl
c，
dlsdlsdlsdlsdlsl
c，
lslslsl
c，dsdsdsdc：
[0103][0104]
通用的合成步骤如下：
[0105][0106]
通过mbha树脂(氨基密度为0.516mmol/g)合成侧链带保护基团的丝氨酸多肽，上图中多肽的通用的合成步骤如下：
[0107]
1)将树脂球(350mg；0.18mmol；1equiv)浸没在ch2cl2(2ml)中溶胀过夜，随后用含20％哌啶的dmf溶液脱保护，反应2h，将脱保护液经砂芯抽去，用dmf(2ml)和ch2cl2(2ml)交替清洗3次；
[0108]
2)氨基酸的活化：将fmoc保护的氨基酸(2equiv；fmoc-o-叔丁基-dl-丝氨酸，fmoc-o-叔丁基-l-丝氨酸或fmoc-o-叔丁基-d-丝氨酸)溶于2ml dmf中，加入6-氯-1-羟基苯并三氮唑(hobt-cl；2equiv)、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu；2equiv)和二异丙基乙胺(diea；4equiv)，反应2min；
[0109]
3)氨基酸接枝到树脂球：将步骤2得到的活化后的溶液加入到树脂中，室温下震荡反应2h，将反应液经砂芯抽去，用dmf(2ml)和ch2cl2(2ml)交替清洗3次；
[0110]
4)取出少量树脂球，经kaiser检测呈阴性，证明接枝完全；
[0111]
5)脱氨基fmoc保护：同步骤1的脱保护步骤；
[0112]
6)后续的丝氨酸多肽序列的接枝重复步骤2-5；
[0113]
7)丝氨酸接枝完毕后，最后接枝半胱氨酸，使用的氨基酸原料为n-叔丁氧羰基-s-三苯甲基-l-半胱氨酸或n-叔丁氧羰基-s-三苯甲基-d-半胱氨酸，接枝步骤同2-4；
[0114]
8)完成特定序列的多肽接枝后，多肽经三氟乙酸(tfa)/三异丙基硅烷(tis)/h2o＝95/2.5/2.5的切割液作用2h后从树脂上分离下来；
[0115]
9)将树脂过滤除去，用1ml tfa清洗树脂；
[0116]
10)用n2将滤液基本吹干，加入meoh(0.5ml)助溶，再加入-20℃的甲基叔丁基醚(15ml)将多肽的粗产物沉淀出来；
[0117]
11)经离心，弃上清，干燥后，得到目标多肽，不必进一步提纯。
[0118]
第三步：氨基取代的两性霉素b多肽衍生物的合成
[0119][0120]
将化合物amb-mal(15mg,4.65μmol)置于2ml玻璃瓶中，加入dmso(0.2ml)溶解，随后加入第二步中获得的多肽(1.2equiv)。避光反应2h，通过hplc检测发现amb-mal消耗完毕，新的化合物出现。向反应液中加入0.8ml超纯水，经0.22μm尼龙膜过滤后，通过反向hplc制备提纯(色谱柱为00g-4252-p2-ax luna 5u c18(2)制备柱；流动相梯度为h2o:mecn＝70:30
→
5:95，30min，水和乙腈中都含有10mm醋酸铵)。将提纯后的溶液浓缩，除去乙腈后，经冻干除去水和醋酸铵，将产物重新溶解在含有0.1％tfa的水中，再次冻干获得tfa盐形式的黄色絮状amb-丝氨酸多肽缀合物。amb-mal与
dlsdlsl
c，
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c，
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c，
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c，
lslslsl
c和dsdsdsdc的缀合产物分别命名为amb-ser2、amb-ser3、amb-ser4、amb-ser5、amb-l-ser3和amb-d-ser3，结构式如下：
[0121][0122]
实施例2
[0123]
氨基取代的两性霉素b多肽衍生物的抗真菌活性测试
[0124]
对实施例1中的各衍生物进行抗真菌活性测试，抗真菌活性采用的菌株包括4株白色念珠菌(c.albicans；菌株名分别是k1，gu5，sc5314和r03)，和2株新型隐球菌(c.neoformans；菌株名分别是h99和jec21)。采用真菌最低抑制浓度(mic)和最低杀菌浓度(mfc)来评价化合物的抗真菌活性。用酵母浸出粉胨葡萄糖(ypd)培养基培养真菌15h，将培养好的菌液离心，弃掉培养液后用rpmi培养基将菌稀释至2.5
×
103cfu/ml。在96孔板中配置0.39～50μg/ml二倍梯度浓度的amb和缀合物的rpmi溶液，每孔50μl，然后在每个孔中加入50μl上述菌液。只加菌液没加任何抗菌剂的孔作为阳性对照，不加菌液只加rpmi培养基的孔作为空白对照。将孔板轻轻摇晃10s后放入30℃的霉菌培养箱中培养24h，肉眼观察真菌的生长状态。对于amb和缀合物，没有长菌的最低浓度为mic。这时用排枪从每个孔中取出3μl混匀的原液，保持孔板各孔阵列顺序不变，滴加到ypd琼脂板上。将琼脂板放入30℃的霉菌培养箱中孵育24h，这时观察到无真菌生长的最低化合物浓度为对应的mfc，也就是能够实现》99.9％杀菌率的最低浓度。每个样本有两个重复，实验重复两次。
[0125]
mic和mfc的结果分别如表1和表2所示，amb对各类菌株的mic值在0.8-1.6μg/ml。实施例1中的amb-ser2和amb-ser3对4株白色念珠菌的mic均为3.1μg/ml，amb-ser4和amb-ser5对4株白色念珠菌的mic均为6.3μg/ml。对于mfc，amb衍生物对白色念珠菌的mfc整体上比mic大一倍，而对新型隐球菌的mfc则与mic相当。整体上4个衍生物，尤其是amb-ser2和
amb-ser3的抗真菌活性依然能够维持非常高的水平。
[0126]
表1 amb和衍生物的mic。
[0127][0128]
表2amb和衍生物的mfc。
[0129][0130][0131]
实施例3
[0132]
氨基取代的两性霉素b多肽衍生物的溶血率测试
[0133]
对实施例1中的各衍生物进行溶血率测试，采用人的血红细胞(rbcs)进行化合物的溶血率测试。5ml的人全血通过离心和tbs缓冲液(含10mm tris和150mm nacl；ph 7.2)清洗，重复3次获得rbcs。将rbcs用tbs稀释至相对全血中rbcs量的2.5％。在96孔板中配置1.6～800μg/ml二倍梯度浓度的amb和缀合物的tbs溶液，每个样本有三个重复，每孔100μl，并在每个孔中加入100μl上述rbcs溶液。没加任何化合物的孔作为空白对照，加triton x-100(3.2mg/ml in tbs)的孔作为阳性对照。将孔板轻轻摇晃10s后放入37℃的培养箱中，孵育3h后将孔板经3700rpm/min离心5min来沉淀未溶解的rbcs。用排枪将每个孔的上部80μl溶液对应转移到一个新的96孔板中，用酶标仪读取405nm的吸光度。溶血率通过公式计算得到：溶血率＝[(a样本-a空白对照)/(a阳性对照
–
a空白对照)]
×
100％；a指405nm吸收下的od值。hc50代表样本溶血率为50％时的浓度。
[0134]
溶血率结果如图2所示，amb的浓度在1.6μg/ml时就有接近40％的溶血，在≥3.1μg/ml就达到100％的溶血，其hc50为2μg/ml，显示出很高的溶血毒性。当亲水性多肽对amb氨基进行修饰后，衍生物的溶血毒性显著降低。amb-ser2的hc50为75μg/ml，溶血毒性仅为amb的1/37.5。而amb-ser3、amb-ser4和amb-ser5在800μg/ml的高浓度下，仍能保持低于15％的溶血率，显示出非常低的溶血毒性，仅为amb的1/400以内。
[0135]
实施例4
[0136]
氨基取代的两性霉素b多肽衍生物的细胞毒性测试
[0137]
对实施例1中的各衍生物进行细胞毒性测试，用四甲基偶氮唑蓝(mtt)法测试化合物对成纤维细胞的毒性。将成纤维细胞用dmem培养基稀释到1.0
×
105个/ml，加入到tc处理(tissue culturetreated)的96孔板中，每孔100μl，孵育24h。在一个新的96孔板中配置1.6～800μg/ml二倍梯度浓度的amb和缀合物的dmem溶液，每个样本有三个重复，每孔100μl。将细胞液用样本溶液替换，随后放入5％的co2培养箱中，37℃孵育24h。只有细胞和培养液，没加任何化合物的孔作为阳性对照。将培养液用排枪吸出，向每孔中加入100μl的mtt溶液(1mg/ml的pbs溶液)，37℃孵育4h。弃掉上清液，每孔加入100μl的dmso，孵育15min使mtt的还原产物蓝紫色结晶甲臜彻底溶解，用酶标仪读取570nm的吸收。只加dmso的孔作为空白对照，细胞存活率＝[(a样本-a空白对照)/(a阳性对照
–
a空白对照)]
×
100％；a指570nm吸收下的od值。ic50代表样本细胞存活率为50％时的浓度。
[0138]
结果显示amb具有很高的毒性，在浓度≥6.3μg/ml时就几乎没有存活的细胞，ic50为2.5μg/ml，如图3所示。通过amb的氨基修饰亲水性多肽后，衍生物的细胞毒性显著降低，amb-ser2的ic50为200μg/ml，而amb-ser3、amb-ser4和amb-ser5在200μg/ml时依然没有明显的细胞毒性。
[0139]
实施例5
[0140]
羧基取代的两性霉素b多肽衍生物的合成
[0141]
第一步：亲水性多肽的合成
[0142]
合成以下两种亲水性多肽：dsds和dsdsds。
[0143][0144]
多肽合成示意图如下所示，方法同实施例1。
[0145][0146]
第二步：羧基取代的两性霉素b多肽衍生物的合成
[0147]
以dsdsds为原料为例，amb羧基与该多肽缩合形成的衍生物as3的合成如下所示：
[0148][0149]
将amb(186mg，0.2mmol)置于在10ml干燥圆底烧瓶中，加入超干dmso(1.5ml)溶解。随后依次加入多肽dsdsds(168.7mg,0.61mmol)、三乙胺(57μl,0.41mmol)和溶有六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷(pybop，128.3mg，0.25mmol)的超干dmso溶液(0.5ml)。将烧瓶转移到40℃油浴中避光反应4h，通过hplc检测到amb消耗完毕。用8ml含2％tfa的超纯水对反应液进行稀释，随后将稀释液加入透析袋中(纤维素酯膜，截留分子量500-1000)，用
超纯水进行透析。透析完毕后，粗产物经c18柱(spherical c18，粒径40-63μm，硅胶孔径)进行分离提纯(流动相梯度为h2o:mecn＝90:10
→
60:40)。产物溶液经浓缩除去乙腈，冻干获得tfa盐形式的黄色絮状amb衍生物as3 73mg，收率31％。
[0150]
实施例6
[0151]
羧基取代的两性霉素b多肽衍生物的抗真菌活性测试
[0152]
对实施例5中的各衍生物进行抗真菌活性测试，羧基取代的两性霉素b多肽衍生物的抗真菌活性测试方法同实施例2，mic和mfc结果如表3：
[0153]
表3 amb和衍生物的mic和mfc。
[0154][0155]
结果显示，羧基取代的两性霉素b多肽衍生物as2，as3和as4的抗真菌活性与amb相当，显示出较高抗真菌活性。
[0156]
实施例7
[0157]
羧基取代的两性霉素b多肽衍生物的毒性测试及水溶性测试
[0158]
对实施例5中的衍生物as3进行毒性和水溶性测试。细胞毒性测试方法同实施例3，溶血率测试方法同实施例4；通过加水溶解，离心测试上清液的溶解度得到水溶性结果，如表4所示：
[0159]
表4 amb和衍生物as3的细胞毒性和溶血率。
[0160][0161]
结果表明，羧基取代的amb多肽衍生物as3的ic50大于800μg/ml，hc50为150μg/ml，远高于amb，具有非常低的细胞毒性和溶血率。水溶性测试显示amb几乎不溶于水，溶解度仅
为1μg/ml，而as3在16000μg/ml时依然具有很好的溶解度。
[0162]
综上可以看出，本发明的两性霉素b多肽衍生物在保持优异的抗菌活性的同时，与两性霉素b相比，具有更高的水溶性和更低的毒性，从而更容易成药，且安全性显著提高，从而提供了一种新的抗真菌药物，为抗真菌提供了新的解决方案。
[0163]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。