一种基于髓鞘碎片诱导M1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法和应用与流程

一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法和应用
技术领域
1.本发明属于外泌体技术领域，具体涉及一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法和应用。


背景技术：

2.外泌体是由细胞内释放到细胞外的具有脂质双分子层结构的单层膜囊泡状小体，在生理和病理环境中都起着重要的作用，是细胞间交流的重要媒介。现有技术中外泌体多是直接从血清或未经处理的细胞培养上清中提取得到的，比较少能获得大量的且带有特定炎性的外泌体。这类不带属性的外泌体，无法满足研究中的特定需求，如刺激炎症反应等。
3.本发明能够通过简单方便的操作方式制备本身促进炎症的外泌体，在局部起到能够起到放大炎症效应的效果。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法和应用。本发明方法操作简便，重复性良好，低成本，低技术门槛，能够促进骨髓巨噬细胞外泌体的大量分泌，获得数量多且高质量的m1型骨髓巨噬细胞外泌体。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于通过髓鞘碎片与骨髓巨噬细胞共培养诱导获得促炎外泌体即m1型骨髓巨噬细胞外泌体。
7.所述的一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于包括以下步骤：
8.(1)提取得到髓鞘碎片；
9.(2)诱导培养获得骨髓巨噬细胞；
10.(3)将上述步骤(1)提取得到的髓鞘碎片与上述步骤(2)得到骨髓巨噬细胞在无外泌体血清中共培养，收集培养上清液，提取获得m1型骨髓巨噬细胞外泌体；
11.(4)鉴定上述步骤(4)得到的m1型骨髓巨噬细胞外泌体的成分。
12.所述的一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于所述步骤(1)中提取的方法包括利用蔗糖梯度离心提取组织中的髓鞘并进行碎片化处理制备髓鞘碎片。
13.所述的一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于所述步骤(2)中采用条件培养基对从骨髓中提取的单核细胞进行诱导培养获得骨髓巨噬细胞。
14.所述的一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于所述步骤(3)中提取的方法具体为：对培养上清液进行梯度离心，去除细胞碎片和蛋白
质，通过peg沉淀后，超速冷冻离心提取获得m1型骨髓巨噬细胞外泌体。
15.所述的一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于所述步骤(4)中鉴定的方法包括转录组测序鉴定。
16.任一所述的高效表达方法在大量制备促炎外泌体中的应用。
17.一种m1型骨髓巨噬细胞外泌体，其特征在于采用所述高效表达方法制备得到。
18.所述的一种m1型骨髓巨噬细胞外泌体，其特征在于所述m1型骨髓巨噬细胞外泌体为促炎外泌体。
19.所述的m1型骨髓巨噬细胞外泌体在促进炎症中的应用。
20.本发明的基本内容包括：
21.(1)使用梯度离心的方法从小鼠的大脑中提取髓鞘碎片。
22.(2)从小鼠的骨髓中提取单核细胞，使用条件培养基诱导骨髓巨噬细胞的生长。
23.(3)将提取的髓鞘碎片与骨髓巨噬细胞在无外泌体的血清中共培养。
24.(4)分别收取髓鞘碎片处理的骨髓巨噬细胞前后释放的培养基。
25.(5)提取收集的培养基中的外泌体并进行鉴定。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.本发明方法操作简便，重复性良好，低成本，低技术门槛，能够促进骨髓巨噬细胞外泌体的大量分泌，获得数量多且高质量的m1型骨髓巨噬细胞外泌体。该方法制备的外泌体可被微血管内皮细胞吞噬，促进微血管内皮细胞增殖，可为脑小血管萎缩症提供潜在的治疗方案。本发明获得的特定炎性的外泌体，为特定炎性外泌体的生产提出了一种新的简便的方法。
附图说明
28.图1为外泌体透射电镜结构图。
具体实施方式
29.以下将通过附图和实施例对本发明作进一步说明。
30.实施例1：
31.通过简单，方便的操作方法制备特定促炎属性的m1型巨噬细胞外泌体，
32.1、骨髓来源巨噬细胞的分离，培养
33.1)实验前准备：所需手术器械包括小动物手术剪，手术镊，手术刀，20ml注射器，18号和25号的针头，所有器械均为无菌。
34.2)取8-10周的小鼠的股骨及胫骨，用20ml的针筒18号的针头吸取遇冷的骨髓来源的巨噬细胞培养基(dmem+5％ncs+15％l929上清+1％双抗)将骨髓细胞冲洗到50ml离心管，离心后弃掉上清。
35.3)将细胞沉淀用20ml的针筒25号的针头上下5次吹打成单细胞，后经过单细胞滤膜过滤，接种在细胞培养皿中。
36.4)三天后给细胞换液，到接种后一周细胞成长为巨噬细胞即可用于实验。
37.2、骨髓来源巨噬细胞的活化检测
38.设置对照组为无髓鞘碎片共培养的巨噬细胞，实验组为1mg/ml髓鞘碎片共培养的
巨噬细胞。实时荧光光定量qpcr和酶联免疫吸附elisa检测对照组和处理组巨噬细胞活化的相关因子il-1β，il-6,tnf-α，mcp-1等。
39.3、透射电镜和particle tracking分析外泌体结构
40.1)骨髓来源巨噬细胞的外泌体分离
41.先用梯度离心法去除对照组(无髓鞘碎片共培养的巨噬细胞)和实验组(1mg/ml髓鞘碎片共培养的巨噬细胞)培养基上清液中细胞碎片和蛋白质，然后通过peg沉淀，超速冷冻离心法提取巨噬细胞分泌到培养基上清液中的外泌体。
42.2)骨髓来源巨噬细胞的外泌体的鉴定
43.将提取的巨噬细胞对照组和处理组外泌体利用透射电镜观察外泌体结构，particle tracking分析仪分析外泌体直径，检测其浓度。
44.4、巨噬细胞外泌体的rna测序分析
45.利用rna测序技术分析外泌体的有效成分。
46.我们实验中，首先将制备好的髓鞘碎片与骨髓巨噬细胞共培养。收集培养基上清，通过超滤膜以及试剂沉淀法获取m1型骨髓巨噬细胞外泌体，并进行透射电镜进行鉴定，如图1所示。


技术特征：
1.一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于通过髓鞘碎片与骨髓巨噬细胞共培养诱导获得促炎外泌体即m1型骨髓巨噬细胞外泌体。2.如权利要求1所述的一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于包括以下步骤：(1)提取得到髓鞘碎片；(2)诱导培养获得骨髓巨噬细胞；(3)将上述步骤(1)提取得到的髓鞘碎片与上述步骤(2)得到骨髓巨噬细胞在无外泌体血清中共培养，收集培养上清液，提取获得m1型骨髓巨噬细胞外泌体；(4)鉴定上述步骤(4)得到的m1型骨髓巨噬细胞外泌体的成分。3.如权利要求2所述的一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于所述步骤(1)中提取的方法包括利用蔗糖梯度离心提取组织中的髓鞘并进行碎片化处理制备髓鞘碎片。4.如权利要求2所述的一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于所述步骤(2)中采用条件培养基对从骨髓中提取的单核细胞进行诱导培养获得骨髓巨噬细胞。5.如权利要求2所述的一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于所述步骤(3)中提取的方法具体为：对培养上清液进行梯度离心，去除细胞碎片和蛋白质，通过peg沉淀后，超速冷冻离心提取获得m1型骨髓巨噬细胞外泌体。6.如权利要求2所述的一种基于髓鞘碎片诱导m1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法，其特征在于所述步骤(4)中鉴定的方法包括转录组测序鉴定。7.如权利要求1-6任一所述的高效表达方法在大量制备促炎外泌体中的应用。8.一种m1型骨髓巨噬细胞外泌体，其特征在于采用如权利要求1-6任一所述高效表达方法制备得到。9.如权利要求8所述的一种m1型骨髓巨噬细胞外泌体，其特征在于所述m1型骨髓巨噬细胞外泌体为促炎外泌体。10.如权利要求8或9所述的m1型骨髓巨噬细胞外泌体在促进炎症中的应用。

技术总结
一种基于髓鞘碎片诱导M1型骨髓巨噬细胞外泌体的高效表达方法和应用，属于外泌体技术领域。该方法包括：(1)提取得到髓鞘碎片；(2)诱导培养获得骨髓巨噬细胞；(3)将髓鞘碎片与骨髓巨噬细胞在无外泌体血清中共培养，收集培养上清液，提取获得外泌体；(4)鉴定外泌体的成分。本发明还提供了通过该方法表达的外泌体及其应用。本发明方法操作简便，重复性良好，低成本，能够促进骨髓巨噬细胞外泌体的大量分泌，获得数量多且高质量的M1型骨髓巨噬细胞外泌体。该方法制备的外泌体可被微血管内皮细胞吞噬，促进微血管内皮细胞增殖，可为脑小血管萎缩症提供潜在的治疗方案，为特定炎性外泌体的生产提出了一种新的简便的方法。生产提出了一种新的简便的方法。生产提出了一种新的简便的方法。


技术研发人员：周添 吴天准
受保护的技术使用者：深圳先进技术研究院
技术研发日：2021.12.13
技术公布日：2022/5/17