一类高通量蛋白质组定量试剂的固相合成方法与流程

文档序号:30300660发布日期:2022-06-04 23:17阅读:41来源:国知局
1.本发明属于化学合成
技术领域
:,具体涉及一类高通量蛋白质组定量试剂的固相合成方法。
背景技术
::2.近年来,蛋白质组学在蛋白质识别和定量技术上有着巨大的进展,对于我们深入理解细胞中蛋白质的表达、翻译后修饰、不同蛋白质之间的相互作用,以及探索其对应的生物学功能方面起着重要作用。生物质谱技术是最为广泛使用的蛋白质组学研究工具,具有一次能够精确分析上万个蛋白质的特点。但是,因为质谱信号容易受到各种因素的干扰,包括仪器设备的电信号噪声,生物样品中的干扰分子与基质效应等,采用质谱技术对蛋白组学进行定量分析需要专门的样品和数据处理方法,主要分为非标法(labelfreemethods)和稳定同位素标记法(labeledmethods)两大类。非标法主要是通过算法比较在不同液相串联(lc-ms/ms)质谱分析试验中多肽信号强度,保留时间等参数来对蛋白质进行定量分析。稳定同位素标记法是首先对不同样品的多肽进行标记,然后混合在一起进行lc-ms/ms分析。由于稳定同位素标记试剂的化学结构完全一致,仅在采用的稳定同位素种类和位置上有所不同,因此,全部样品在一次lc-ms/ms分析中完成,这样可以最大限度地减少不同的样本在不同此测量中产生的差异,对仪器设备重现性的要求低,降低了在非标法中无法避免的重复性问题。同时,因为多个样品可以在一次lc-ms/ms中分析,可以大大节省大队列体样品的分析时间。3.根据定量的不同原理,稳定同位素标记法又可以分为两大类。第一类是基于一级质谱(ms1)定量。silac(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture)是一种基于ms1定量的代表方法。这是通过在细胞培养基中分别加入普通氨基酸和含有稳定同位素标记的氨基酸实现的。在不同条件中生长的细胞混合在一起后,经过正常的蛋白质组学样品处理后,不同来源的蛋白在ms1上显示一定的质量差异,其对应的峰面积代表了在原始样品中的相对含量。第二类是基于二级质谱(ms2)定量。其中同量异位标记法(isobariclabeling)是基于ms2的代表分析方法,包括itraq(isobarictagforrelativeandabsolutequantification),tmt(tandemmasstag)以及ibt(isobarictag)等。与silac等基于一级质谱的定量方法相比,同量异位标记后的多个样品混合后,在ms1上不会显示质量差异。因此,不同样品中所含的同一多肽合并产生一个分子峰,相当于增强了样品浓度,使检测的灵敏度大大提高。同时并未增加ms1图谱的复杂度,更加适用于多个样品的比较分析。同时,silac标记的定量方法依赖于细胞摄入含稳定同位素的精氨酸或赖氨素合成蛋白,进而再分析这些含有标记氨基酸的蛋白质。这种方法只在可以培养的细胞中容易实现,但在动物组织,人体样品的分析中难以应用。而同量异位标记法则不受样本来源的限制,可以广泛应用于各种临床样品。4.目前,市场上已经有多种同量异位标签试剂,包括itraq-4plex(最多同时鉴定4个蛋白组样品),itraq-8plex(最多同时鉴定8个蛋白组样品),tmt-10plex(最多同时鉴定10个蛋白组样品),ibt-10plex(最多同时鉴定10个蛋白组样品),tmtpro-16plex(最多同时鉴定16个蛋白组样品)等。我们也开发了ibt-16plex(最多同时鉴定16个蛋白组样品)。每组ibt-16plex是由16个化学结构和分子量一致,但在不同位置含有13c或者15n的化学分子。其结构包括了三部分:报告基团-平衡基团-活化基团。具体结构如下:[0005][0006]其中,活化基团通过与多肽侧链官能团的特异性反应(n-端氨基,赖氨酸的氨基,半胱氨酸的巯基,酪氨酸的羟基等)对多肽进行标记。报告基团与平衡基团的总质量是一致的。但是,报告基团和平衡基团通过一个ms/ms可剪切键连接,这样,在二级质谱中,ibt-16plex标记的样品会产生一组特征性报告离子,其相对峰高用于测定原样品中的相对含量。[0007]ibt-16plex试剂的合成是通过一个11步的液相合成法完成的(中国发明专利申请202011518641.8)。每套试剂的合成需要16×11=176个反应。同时在每个反应中,需要进行分离纯化步骤,因此需要消耗大量的时间和溶剂。技术实现要素:[0008]本发明的目的在于提供一类高通量蛋白质组定量试剂的固相合成方法,以解决上述
背景技术
:中提出的问题,从而能够提高合成的效率,降低合成的成本。[0009]本发明的合成路线如下:[0010][0011]通过上述固相合成法,选用不同的含有稳定同位素的原料,可以很方便的合成ibt-16plex试剂。为了保证每步反应的完成,通常过量(2倍相对于固相树脂上的官能团摩尔量)的稳定同位素fmoc-beta-ala-oh或者fmoc-gly-oh加入到反应混合液中,未反应的fmoc-beta-ala-oh和fmoc-gly-oh可以通过制备液相色谱纯化回收使用,从而降低了合成成本。[0012]下表中为不同标签对应的不同原料:[0013][0014][0015]为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一类高通量蛋白质组定量试剂的固相合成方法,按照先后顺序包括以下步骤:[0016]第1步:fmoc保护的氨基酸在脱水偶和剂dic(diisopropylcarbodiimide,casno.693-13-0),添加剂hobt(1-hydroxybenzotriazole,casno.123333-53‑ꢀ9),催化剂dmap(4-dimethylaminopyridine,casno.1122-58-3)作用下,偶和到固相树脂wangresin中;[0017]第2步:采用哌啶(piperidine,casno.110-89-4)脱去fmoc保护基团,得到一级胺基;[0018]第3步:fmoc保护的氨基酸-1在脱水偶和剂hbtu(2-(1h-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate,casno.94790-37-1),添加剂hobt(1-hydroxybenzotriazole)和有机碱dipea(n,n-diisopropylethylamine,casno.7087-68-5)作用下,偶和到第2步中产生的一级胺基基团上;[0019]第4步:采用哌啶(piperidine)脱去fmoc保护基团,得到一级胺基;[0020]第5步:fmoc保护的氨基酸-2在脱水偶和剂hbtu(2-(1h-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate),添加剂hobt(1-hydroxybenzotriazole)和有机碱dipea(n,n-diisopropylethylamine)作用下,偶和到第4步中产生的一级胺基基团上;[0021]第6步:采用哌啶(piperidine)脱去fmoc保护基团,得到一级胺基;[0022]第7步:丙酮在还原剂nacnbh3(氰基硼氢化钠,casno.25895-60-7)作用下,进行还原胺化反应,加到第6步产生的一级胺基上,由于丙酮的位阻效应,只能加上一个丙酮分子。然后,具有醛基的分子在还原剂nacnbh3作用下,进行第二个还原胺化反应,由于丙醛没有位阻效应,因此可以顺利加到二级胺基上,形成一个三级胺;[0023]第8步:采用4n的hcl/dioxane溶液,将上述步骤中化合物ibt-16plex-oh从固相树脂上切除;[0024]第9步:将ibt-16plex-oh在有机碱性条件下(dipea),用tstu(n,n,n′,n′‑四甲基-o-(n-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐,casno.105832-38-0)活化成能与多肽胺基直接偶和的活化琥珀酸酯ibt-16plex-nhs。[0025]本发明的技术效果和优点:1、在固相合成中,由于反应中间体和产物是固定在固相树脂上,反应物是在溶液中,可以采用过量的反应物促进反应中间体向产物的100%转化,在反应完全后,过量的反应物可以很容易的通过过滤除去,而不用像在液相反应中,需要通过复杂的样品处理和柱层析纯化去除过量的反应物以及反应的副产品;[0026]2、由于每套ibt-16plex含有16个结构一样,但是在不同位置具有不同稳定同位素的化学试剂,采用液相合成需要人工对每一个试剂分别进行11步的合成,共需要16×11=176步反应,采用固相合成法,可以利用现有的多肽合成仪,进行自动化的并行合成,大大节省人力成本和需要的时间;[0027]3、液相合成法需要合成人员具有一定的合成经验,对反应中可能出现的副产品等进行及时的分析和处理,在采用新的反应物时需要进行繁琐的优化,固相合成法操作简单,对合成人员的要求不高,同时可以在无需优化或者很少优化的情况下扩展合成具有类似结构和性能的新型衍生化合物。具体实施方式[0028]下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。[0029]在采用固相合成法制备ibt-16plex的基础上,我们也利用不同反应物,对ibt系列试剂的化学结构进行了一些优化,例如:ibt-v5引入了一个三氟乙酸基本保护的胺基,可以在碱性条件下脱去,从而引进一个胺基进行更进一步的修饰,同时也引进一个额外的氮原子位置用于稳定同位素变换(从14n到15n)。这类新型ibt-16plex的衍生化合物可以用于开发更高通量,更低成本的蛋白质组定量试剂。[0030]下表为不同类型的ibt-16plex衍生化合物生产用到的反应物:[0031][0032]实施例1[0033]一类高通量蛋白质组定量试剂的固相合成方法,按照先后顺序包括以下步骤:[0034]第1步:fmoc保护的beta-ala(fmoc-beta-ala)在脱水偶和剂dic(diisopropylcarbodiimide,casno.693-13-0),添加剂hobt(1-hydroxybenzotriazole,casno.123333-53-9),催化剂dmap(4-dimethylaminopyridine,casno.1122-58-3)作用下,偶和到固相树脂wangresin中。[0035]第2步:采用哌啶(piperidine,casno.110-89-4)脱去fmoc保护基团,得到一级胺基。[0036]第3步:fmoc保护的gly-1(fmoc-gly)在脱水偶和剂hbtu(2-(1h-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate,casno.94790-37-1),添加剂hobt(1-hydroxybenzotriazole)和有机碱dipea(n,n-diisopropylethylamine,casno.7087-68-5)作用下,偶和到第2步中产生的一级胺基基团上。[0037]第4步:采用哌啶(piperidine)脱去fmoc保护基团,得到一级胺基。[0038]第5步:fmoc保护的gly-2(fmoc-gly)在脱水偶和剂hbtu(2-(1h-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate),添加剂hobt(1-hydroxybenzotriazole)和有机碱dipea(n,n-diisopropylethylamine)作用下,偶和到第4步中产生的一级胺基基团上。[0039]第6步:采用哌啶(piperidine)脱去fmoc保护基团,得到一级胺基。[0040]第7步:丙酮在还原剂nacnbh3(氰基硼氢化钠,casno.25895-60-7)作用下,进行还原胺化反应,加到第6步产生的一级胺基上,由于丙酮的位阻效应,只能加上一个丙酮分子。然后,丙醛在还原剂nacnbh3作用下,进行第二个还原胺化反应,由于丙醛没有位阻效应,因此可以顺利加到二级胺基上,形成一个三级胺。[0041]第8步:采用4n的hcl/dioxane溶液,将化合物ibt-16plex-oh从固相树脂上切除。[0042]第9步:将ibt-16plex-oh在有机碱性条件下(dipea),用tstu(n,n,n′,n′‑四甲基-o-(n-琥珀酰亚胺)脲四氟硼酸盐,casno.105832-38-0)活化成能与多肽胺基直接偶和的活化琥珀酸酯ibt-16plex-nhs。[0043]实施例2:ibt-16plex-t114的合成[0044][0045]干树脂(wangresin,0.4mmol/g,0.75g,总官能团为0.3mmol)添加到固相反应容器中,加入dmf20ml进行预处理,半小时后过滤得到膨胀后的湿树脂体积约为6ml。溶解fmoc-beta-ala(13c3,15n)(189mg,0.6mmol)在1mldmf+9mldcm溶液中,溶解hobt(0.6mmol,81mg),dmap(0.06mmol,7.32mg)在1mldmf中,混合加入树脂,然后添加dic(93μl,0.6mmol),在强烈振荡和氮气保护下反应2小时,过滤,滤液保留用于回收过量的fmoc-beta-ala(13c3,15n)。树脂用dmf(20ml×3)洗涤后,加入10ml20%的piperidine/dmf溶液摇晃30分钟脱去fmoc基团后,用dmf(20ml×3)洗涤。[0046]加入10ml含有fmoc-gly(13c2,15n)(gly-1,180mg,0.6mmol),hbtu(0.6mmol,227mg),hobt(0.6mmol,81mg),dipea/dmf(2m)的dmf溶液。摇晃2小时后,过滤出树脂,用dmf洗涤20ml×3次。加入20%piperidine/dmf溶液摇晃30分钟脱去fmoc基团,继续用dmf洗涤20ml×ꢀ3次。加入10ml含有fmoc-gly(1-13c)(gly-2,180mg,0.6mmol),hbtu(0.6mmol,227mg),hobt(0.6mmol,81mg),dipea/dmf(2m)的dmf溶液。摇晃2小时后,过滤出树脂,用dmf洗涤20ml×3次。加入20%piperidine/dmf溶液摇晃30分钟脱去fmoc基团,继续用dmf洗涤20ml×ꢀ3次。然后用甲醇洗涤20ml×3次。[0047]在树脂中加入10ml含有氰基硼氢化钠(0.45mmol,28mg)的甲醇溶液,然后加入丙酮(0.6mmol,44μl),摇晃2小时后,过滤,在树脂中加入10ml含有氰基硼氢化钠(0.45mmol,28mg)的甲醇溶液,然后加入丙醛(0.6mmol,44μl),继续反应2小时。过滤出树脂,用dmf洗涤3次,用dmf洗涤20ml×3次,然后用dcm洗涤20ml×3次。加入4nhcl/dioxane溶液6ml,摇晃1小时后,过滤并将滤液滴入乙醚溶液中。所得淡黄色沉淀用乙醚洗涤后,过滤并干燥得到白色固体72mg(0.244mmol,产率81.4%)[0048]溶解上述白色固体在10ml无水乙腈中,加入tstu(0.244mmol,73.5mg),加入dipea(0.732mmol,120μl),在氮气保护下反应2个小时,旋干溶剂,加入20mldcm,分别用20ml饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤,干燥有机相,旋干溶剂,重新加入10mldcm,然后加入1ml1nhcl/dioxane溶液振荡将三级胺转换成盐酸盐,旋干溶剂,重新溶解在5ml无水乙腈溶液中,然后旋干溶液得到白色固体89.8mg(分子量427.5,0.21mmol,总产率70.0%)。nmr(d6-dmso):9.09(s,1h),8.98(s,0.5h),8.72(s,0.5h),8.42(s,0.5h),8.19(s,0.5h),3.89~4.05(m,2h),3.77~3.85(m,1h),3.60(m,2h),3.22(s,1h),3.02(m,3h),2.82(s,4h),2.71(s,1h),1.64(m,2h),1.24(t,6h),0.88(t,3h)。esi-ms:[m+h]+=393.2(calc.),[m+h]+=393.4(measured)[0049]实施例3:ibt-16plex-t117n的合成[0050][0051]遵循实施例1中的步骤,稳定同位素原料分别采用fmoc-beta-ala(13c3)(189mg,0.6mmol),fmoc-gly(15n)(gly-1,180mg,0.6mmol),fmoc-gly(1-13c,15n)(gly-2,180mg,0.6mmol),丙酮(1,3-13c2)(0.6mmol,44μl),获得ibt-16plex-t117n81.2mg(分子量427.5,0.19mmol,总产率63.3%)。nmr(d6-dmso):9.23(s,0.5h),9.00(m,1h),8.77(m,0.5h),8.33(s,1h),3.99~4.09(m,1h),3.77~3.88(m,3h),3.63(m,2h),3.22(s,1h),3.05(m,3h),2.82(s,4h),2.71(m,1h),1.67(m,2h),1.40(t,3h),1.07(t,3h),0.92(t,3h)。esi-ms:[m+h]+=393.2(calc.),[m+h]+=393.3(measured)[0052]实施例4:ibt-16plex-t119c的合成[0053][0054]遵循实施例1中的步骤,稳定同位素原料分别采用fmoc-gly(1-13c,15n)(gly-1,180mg,0.6mmol),fmoc-gly(13c2)(gly-2,180mg,0.6mmol),丙酮(2-13c)(0.6mmol,44μl),丙醛(13c3)(0.6mmol,44μl),获得ibt-16plex-t119c75.2mg(分子量427.5,0.17mmol,总产率56.7%)。nmr(d6-dmso):9.05(s,1h),8.95(s,0.5h),8.72(m,1h),8.31(s,1h),4.12~4.25(m,1h),3.91~4.02(m,1h)3.83(m,2h),3.42(m,2h),3.21(m,1h),2.88(t,2h),2.82(s,4h),1.80(m,1h),1.50(m,1h),1.25(t,6h),1.04(m,1.5h),0.71(m,1.5h)。esi-ms:[m+h]+=393.2(calc.),[m+h]+=393.2(measured)[0055]实施例5:ibt-16plex-t122的合成[0056][0057]遵循实施例1中的步骤,稳定同位素原料分别采用fmoc-gly(2-13c,15n)(180mg,0.6mmol),丙酮(13c3)(0.6mmol,44μl),丙醛(13c3)(0.6mmol,44μl),获得ibt-16plex-t12285.4mg(分子量427.5,0.20mmol,总产率66.7%)。nmr(d6-dmso):9.14(s,0.5h),8.95(s,0.5h),8.81(m,1h),8.29(m,1h),4.14~4.25(m,1h),3.94~4.02(m,1h)3.83(m,2h),3.40(m,2h),3.21(m,1h),2.88(t,2h),2.82(s,4h),1.80(m,1h),1.50(m,1h),1.39(t,3h),1.05(m,4.5h),0.73(m,1.5h)。esi-ms:[m+h]+=393.2(calc.),[m+h]+=393.0(measured)[0058]实施例6:ibt-v1的合成[0059][0060]遵循实施例1中的步骤,分别采用非同位素标记的fmoc-beta-ala(ala‑ꢀ1,189mg,0.6mmol),fmoc-beta-ala(ala-2,189mg,0.6mmol),fmoc-gly(gly-1,180mg,0.6mmol),丙酮(0.6mmol,44μl),丙醛(0.6mmol,44μl)做为原料,获得ibt-v192.3mg(分子量433.5,21.3mmol,产率71.0%)。nmr(d6-dmso):9.25(s,1h),8.95(m,1h),8.39(m,1h),4.01~4.10(m,1h),3.82~3.89(m,1h),3.63(m,1h),3.45(m,2h),3.42(m,2h),3.07(m,2h),2.88(m,4h),2.82(s,4h),1.67(m,2h),1.26(m,6h),0.90(m,3h)。esi-ms:[m+h]+=399.2(calc.),[m+h]+=399.1(measured)。[0061]实施例7:ibt-v2的合成[0062][0063]遵循实施例1中的步骤,分别采用非同位素标记的fmoc-beta-ala(189mg,0.6mmol),fmoc-gly(gly-1,180mg,0.6mmol),fmoc-gly(gly-2,180mg,0.6mmol),丙酮(0.6mmol,44μl),丁醛(0.6mmol,54μl)做为原料,获得ibt-v285.5mg(分子量433.5,19.7mmol,产率65.7%)。nmr(d6ꢀ‑dmso):9.25(s,1h),8.95(m,1h),8.39(m,1h),4.28(m,1h),4.01~4.10(m,1h),3.82~3.89(m,1h),3.81(m,2h),3.63(m,1h),3.07(m,2h),2.82(s,4h),1.67(m,2h),1.56(m,2h),1.26(m,6h),0.90(m,3h)。esi-ms:[m+h]+=399.2(calc.),[m+h]+=399.1(measured)。[0064]实施例8:ibt-v3的合成[0065][0066]遵循实施例1中的步骤,分别采用非同位素标记的fmoc-beta-ala(189mg,0.6mmol),fmoc-ala(189mg,0.6mmol),fmoc-gly(180mg,0.6mmol),丙酮(0.6mmol,44μl),丙醛(0.6mmol,44μl)做为原料,获得ibt-v388.5mg(分子量433.5,20.4mmol,产率68.0%)。nmr(d6-dmso):9.25(s,1h),8.95(m,1h),8.39(m,1h),4.38(m,1h),4.01~4.10(m,1h),3.82~3.89(m,1h),3.63(m,1h),3.42(m,2h),3.07(m,2h),2.88(m,2h),2.82(s,4h),1.67(m,2h),1.49(d,3h),1.26(m,6h),0.90(m,3h)。esi-ms:[m+h]+=399.2(calc.),[m+h]+=399.1(measured)。[0067]实施例9:ibt-v4的合成[0068][0069]遵循实施例1中的步骤,分别采用非同位素标记的fmoc-ala(189mg,0.6mmol),fmoc-gly(gly-1,180mg,0.6mmol),fmoc-gly(gly-2,180mg,0.6mmol),丙酮(0.6mmol,44μl),丙醛(0.6mmol,44μl)做为原料,获得ibt-v484.6mg(分子量419.5,20.2mmol,产率67.2%)。nmr(d6-dmso):9.25(s,1h),8.95(m,1h),8.39(m,1h),4.01~4.10(m,1h),3.82~3.89(m,1h),3.63(m,1h),3.07(m,2h),2.82(s,4h),1.67(m,2h),1.49(d,3h),1.26(m,6h),0.90(m,3h)。esi-ms:[m+h]+=385.2(calc.),[m+h]+=385.2(measured)。[0070]实施例10:ibt-v5的合成[0071][0072]遵循实施例1中的步骤,分别采用非同位素标记的fmoc-ala(189mg,0.6mmol),fmoc-gly(gly-1,180mg,0.6mmol),fmoc-gly(gly-2,180mg,0.6mmol),丙酮(0.6mmol,44μl),三氟酰胺基乙醛(0.6mmol,93mg)做为原料,获得ibt-v596.6mg(分子量516.7,18.7mmol,产率62.2%)。nmr(d6-dmso):nmr(d6-dmso):9.25(s,1h),8.95(m,1h),8.39(m,1h),8.08(s,1h),4.28(m,1h),4.01~4.10(m,1h),3.82~3.89(m,1h),3.81(m,2h),3.63(m,1h),3.14(t,2h),3.07(m,2h),2.82(s,4h),2.55(t,2h),1.26(m,6h)。esi-ms:[m+h]+=482.2(calc.),[m+h]+=482.3(measured)。[0073]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12
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