一种重组人III型胶原蛋白及其制备方法和应用与流程

一种重组人iii型胶原蛋白及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于优化编码基因技术领域，具体地涉及一种重组人iii型胶原蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.胶原蛋白又称胶原，是一种结构蛋白，iii型胶原蛋白由三条肽链向右卷曲扭成三股螺旋状。一级结构分析表明，其多肽链很长的区段序列是由gly-x-y氨基酸序列重复而成。其中，x通常为脯氨酸，y通常为羟脯氨酸和羟赖氨酸，后两种氨基酸在其他蛋白质中很少见。羟脯氨酸通常由脯氨酸经脯氨酸羟化酶的作用形成。羟脯氨酸羟基参与链间的氢键键合，促进三螺旋结构的形成，提高胶原蛋白的稳定性和功能性。这种三肽重复序列对胶原蛋白的结构起着重要作用，特别是成纤维胶原的胶原域是由长而不中断的三股螺旋组成。
3.胶原蛋白的免疫原性低，具有促进组织修复、止血等功能，现已被广泛应用于食品、化妆品、生物医学材料、药品等领域。现阶段，胶原蛋白的来源主要有从动物组织中提取和通过基因工程技术表达。基因工程技术获得的重组胶原蛋白具有水溶性好，不存在病毒传播的风险，批间一致性好等优点。因此重组胶原蛋白成为当前的研究热点。
4.人源重组胶原蛋白的制备，根据序列的类型可分为：
①
全长表达；
②
片段或重复片段表达。这两种类型的重组胶原蛋白目前都存在容易降解的问题。通过与脯氨酸羟化酶共表达能够增加胶原蛋白的稳定性，但是会增加表达系统的复杂性，若采用大肠杆菌或酵母宿主进行胶原蛋白与脯氨酸羟化酶共表达不易于进行产业化，而采用真核细胞表达胶原蛋白存在成本高昂的缺点。因此获得能够稳定存在的胶原蛋白序列是实现重组胶原蛋白规模化生产的关键。
5.有鉴于此，本领域需要一种具备良好稳定性并能够重组表达的人iii型胶原蛋白。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种稳定性良好的重组人iii型胶原蛋白的制备方法，并同时提供其制备方法和应用。
7.为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：本发明一方面提供了一种重组人iii型胶原蛋白，其氨基酸序列包括基本重复单元，基本重复单元为：gppgppgaigpsgpagkdgesgrpgrpgerglpgppgikgpagipgfpgmkghrgfdgrngekgetgapglkgenglpgengapgpmgprgapgergrpglpgaagargndgargsdgqp。
8.作为本发明的一些优选实施方案，所述重组人iii型胶原蛋白重复单元的dna序列如下：ggtccacccggacctcccggggctataggcccgagcggtccagcgggcaaggacggcgagtccggtcgtccgggccggccgggcgaacgcggtcttccaggcccgcctggcatcaagggtccggctggcatcccgggttttccggggatgaagggtcaccgcggctttgatggtcgtaatggtgagaaaggagaaaccggtgccccaggtctgaaaggcg
agaatggtctgccgggcgagaacggcgctccgggtccgatgggtccacgtggcgcgccgggtgaacgtggtagaccgggactgccgggtgcagcgggagcgcgtggtaatgatggcgcgcgtggtagcgacggccagccggg。
9.作为本发明的一些优选实施方案， 所述基本重复单元的重复次数为3~10。
10.作为本发明的一些优选实施方案，所述基本重复单元的重复次数为5，其氨基酸序列如seq id no:1。
11.作为本发明的一些优选实施方案，所述基本重复单元的重复次数为5，其核苷酸序列如seq id no:2。
12.本发明另一方面，提供了上述重组人iii型胶原蛋白的制备方法，具体包括如下步骤：（1）蛋白序列设计根据人iii型胶原蛋白全长氨基酸序列为参考，选取两个gppgppg之间并包含前端gppgppg的氨基酸序列为重复单元，重复串联3~10次形成重组人iii型胶原蛋白的氨基酸序列；（2）基因设计和合成根据步骤（1）中所述的重组人iii型胶原蛋白的重复单元氨基酸序列反向设计编码核酸序列，并进行密码子优化，得到编码重组人iii型胶原蛋白重复单元的核苷酸序列，然后进行全基因合成，得到编码所述重组人iii型胶原蛋白片段的核酸片段，并通过ndei和xhoi多克隆位点连接到pet30a(+)质粒上，得到表达质粒；（3）表达菌株的构建和筛选：将步骤（2）中所述质粒通过热激法转入宿主细胞感受态中，涂布在含有卡那霉素的抗性板上，挑取单克隆菌株获得表达菌株；（4）诱导表达对步骤（3）得到的表达菌株进行诱导表达，收集菌液；（5）纯化对步骤（4）收集的菌液进行菌体破碎，使用ni亲和层析柱和离子交换层析柱进行重组人iii型胶原蛋白的纯化。
13.作为本发明的一些优选实施方案，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
14.本发明再一方面提供了一种上述重组人iii型胶原蛋白在医疗器械领域的用途。
15.采用上述技术方案所产生的有益效果在于：（1）本发明选用序列位于人iii型胶原蛋白的两个gppgpp组合之间（所需序列包含前端的gppgpp，另一端不包含），采用这样的序列作为重复单元，进行多拷贝表达，在连接处其氨基酸组成与天然氨基酸组成一致，保证了整个序列的稳定性，不会因为拼接处氨基酸序列的不同引起的序列不稳定。
16.（2）本发明的重组人iii型胶原蛋白制备方法适于工业化大规模生产，并且制备出的产品没有动物来源的感染源，因此生物安全性更高。
17.（3）本发明的重组人iii型胶原蛋白相对于动物胶原，有更好的促进细胞迁移的功能。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明具体实施方式中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
19.图1为实施例5制备的重组人iii型胶原蛋白rhc5亲和层析电泳图，图中：m：marker；1：破菌后全菌；2：破菌离心沉淀；3：破菌离心上清；4：亲和层析流穿；5：亲和层析平衡；6：亲和层析洗脱。
20.图2为实施例5制备的重组人iii型胶原蛋白rhc5亲和层析样品离子交换电泳图，图中：1：亲和层析纯化样品；2：离子交换纯化样品。
21.图3 为实施例5制备的重组人iii型胶原蛋白rhc5常温存放稳定性考察电泳图，图中：1：0个月；2：3个月；3：6个月；4：12个月图4 考察例1随机序列得到的蛋白亲和层析电泳图，图中：m：marker；1：破菌后全菌；2：破菌离心沉淀；3：破菌离心上清；4：亲和层析流穿；5：亲和层析平衡；6：亲和层析洗脱。
22.图5 考察例1随机序列得到的蛋白亲和样品离子交换电泳图：图中：mmarker；1：亲和层析纯化样品；2：亲和层析样品稀释后；3：亲和层析样品稀释够过滤；4：流穿；5：离子交换洗脱样品。
23.图6 为实施例5制备的重组人iii型胶原蛋白rhc5与动物胶原促细胞迁移效果对比。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。
25.实施例1 基因设计和合成(1) 基因设计：将人iii型胶原蛋白的片段进行五次重复得到重组人iii型胶原蛋白的氨基酸序列rhc5，其n端以甲硫氨酸开始，以降低蛋白质的降解速率；其c端包含组氨酸标签，以便于鉴定和纯化。所述重组人iii型胶原蛋白片段的氨基酸序列如下所示：mgppgppgaigpsgpagkdgesgrpgrpgerglpgppgikgpagipgfpgmkghrgfdgrngekgetgapglkgenglpgengapgpmgprgapgergrpglpgaagargndgargsdgqpgppgppgaigpsgpagkdgesgrpgrpgerglpgppgikgpagipgfpgmkghrgfdgrngekgetgapglkgenglpgengapgpmgprgapgergrpglpgaagargndgargsdgqpgppgppgaigpsgpagkdgesgrpgrpgerglpgppgikgpagipgfpgmkghrgfdgrngekgetgapglkgenglpgengapgpmgprgapgergrpglpgaagargndgargsdgqpgppgppgaigpsgpagkdgesgrpgrpgerglpgppgikgpagipgfpgmkghrgfdgrngekgetgapglkgenglpgengapgpmgprgapgergrpglpgaagargndgargsdgqpgppgppgaigpsgpagkdgesgrpgrpgerglpgppgikgpagipgfpgmkghrgfdgrngekgetgapglkgenglpgengapgpmgprgapgergrpglpgaagargndgargsdgqphhhhhh （seq id no:1）利用在线设计工具jcat（http://www.jcat.de/）反向设计其编码核酸序列，并针对宿主大肠杆菌表达进行密码子优选。经过上述优化，得到编码编码重组人iii型胶原蛋白的核酸片段rhc5，其核苷酸序列如下所示：
atgggtccacccggacctcccggggctataggcccgagcggtccagcgggcaaggacggcgagtccggtcgtccgggccggccgggcgaacgcggtcttccaggcccgcctggcatcaagggtccggctggcatcccgggttttccggggatgaagggtcaccgcggctttgatggtcgtaatggtgagaaaggagaaaccggtgccccaggtctgaaaggcgagaatggtctgccgggcgagaacggcgctccgggtccgatgggtccacgtggcgcgccgggtgaacgtggtagaccgggactgccgggtgcagcgggagcgcgtggtaatgatggcgcgcgtggtagcgacggccagccgggggtccacccggacctcccggggctataggcccgagcggtccagcgggcaaggacggcgagtccggtcgtccgggccggccgggcgaacgcggtcttccaggcccgcctggcatcaagggtccggctggcatcccgggttttccggggatgaagggtcaccgcggctttgatggtcgtaatggtgagaaaggagaaaccggtgccccaggtctgaaaggcgagaatggtctgccgggcgagaacggcgctccgggtccgatgggtccacgtggcgcgccgggtgaacgtggtagaccgggactgccgggtgcagcgggagcgcgtggtaatgatggcgcgcgtggtagcgacggccagccgggggtccacccggacctcccggggctataggcccgagcggtccagcgggcaaggacggcgagtccggtcgtccgggccggccgggcgaacgcggtcttccaggcccgcctggcatcaagggtccggctggcatcccgggttttccggggatgaagggtcaccgcggctttgatggtcgtaatggtgagaaaggagaaaccggtgccccaggtctgaaaggcgagaatggtctgccgggcgagaacggcgctccgggtccgatgggtccacgtggcgcgccgggtgaacgtggtagaccgggactgccgggtgcagcgggagcgcgtggtaatgatggcgcgcgtggtagcgacggccagccgggggtccacccggacctcccggggctataggcccgagcggtccagcgggcaaggacggcgagtccggtcgtccgggccggccgggcgaacgcggtcttccaggcccgcctggcatcaagggtccggctggcatcccgggttttccggggatgaagggtcaccgcggctttgatggtcgtaatggtgagaaaggagaaaccggtgccccaggtctgaaaggcgagaatggtctgccgggcgagaacggcgctccgggtccgatgggtccacgtggcgcgccgggtgaacgtggtagaccgggactgccgggtgcagcgggagcgcgtggtaatgatggcgcgcgtggtagcgacggccagccgggggtccacccggacctcccggggctataggcccgagcggtccagcgggcaaggacggcgagtccggtcgtccgggccggccgggcgaacgcggtcttccaggcccgcctggcatcaagggtccggctggcatcccgggttttccggggatgaagggtcaccgcggctttgatggtcgtaatggtgagaaaggagaaaccggtgccccaggtctgaaaggcgagaatggtctgccgggcgagaacggcgctccgggtccgatgggtccacgtggcgcgccgggtgaacgtggtagaccgggactgccgggtgcagcgggagcgcgtggtaatgatggcgcgcgtggtagcgacggccagccgggcaccaccaccaccaccac （seq id no:2）。
26.（2）基因合成：根据seq id no:2所示核酸序列，由金斯瑞生物科技股份有限公司合成编码重组人iii型胶原蛋白片段的核酸片段（rhc5）。
27.实施例2表达载体pet30a(+)-rhc5的构建将实施例1得到的核酸片段通过ndei和xhoi多克隆位点连接到pet30a(+)质粒上，得到重组质粒pet30a(+)-rhc5。
28.实施例3表达菌株bl21(de3) / pet30a(+)-rhc5的构建表达菌株的构建参照《分子克隆实验指南（第三版）》（j.萨姆布鲁克等著）中记载的方法，具体步骤如下：挑取大肠杆菌bl21（de3）单菌落到lb试管接种后在37℃振荡过夜培养；在含50ml lb的三角瓶中加入0.5ml的过夜培养液，37℃剧烈振荡培养约2小时使菌体长到对数前期；无菌条件下将细菌转移到用冰预冷的50ml聚丙烯管中，冰上放置10分钟；4℃，4000rpm离心，倒出上清，将管倒置，使残余液尽量流出；加入6ml用冰预冷的0.1mol/l cacl2重悬沉淀，放置冰上30分钟；4℃，3000rpm离心，倒出上清，将管倒置，使残余液尽量流出；加入1.2ml用冰预冷的0.1mol/l cacl2重悬沉淀（若要制备于-70
°
c保存备用的感受态
细胞，则加入含有20%甘油的0.1mol/l cacl2悬浮菌体），4℃放置5~24小时后，吸取200μl感受态细胞悬液，加入实施例2制备的重组质粒pet30a(+)-rhc5（体积《10μl, dna《50ng），轻轻混匀，冰上放置30分钟；42℃水浴静止热激90秒，立即放入冰上冷却；加入500μl液体lb培养液，混匀，放入37℃摇床低速摇动复苏45分钟（也可加lb后直接放入37℃水浴复苏1小时，中间振荡管子使细胞悬浮）；吸取转化的细胞涂布在加有抗生素（卡那霉素）的平板上，放于37℃培养箱中倒置培养，生长出的菌落即为表达菌株bl21(de3) / pet30a(+)-rhc5。
29.实施例4 表达菌株bl21(de3) / pet30a(+)-rhc5的诱导表达挑取实施例3制备的表达菌株bl21(de3) / pet30a(+)-rhc5的单菌落于含50μg/ml kan的lb液体培养基中，37℃ 200r/min培养过夜后成为活化种子，再以3%的接种量接种到装有3l cm培养基的5l发酵罐中培养，发酵过程控制温度37℃，溶氧30%，ph7.0。当od
600
达到60时，加入终浓度为0.5mm的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，继续培养12小时，离心收集菌体。
30.实施例5 重组人iii型胶原蛋白rhc5纯化使用ni亲和层析柱和离子交换层析柱进行重组人iii型胶原蛋白的纯化，具体步骤如下：1、亲和层析（1）样品处理：将实施例3制备的菌体用适量的buffer a（20mm tris, 20mm 咪唑，500mm nacl）重悬后，用高压均质机破碎菌体。破碎的菌液用离心机离心，收集上清，上清用0.45μm滤膜过滤，即为粗蛋白样品。
31.（2）柱平衡：ni sepharose ff层析柱用buffer a平衡至基线平稳。
32.（3）上样：将粗蛋白样品上到层析柱中，控制柱保留时间不低于5min。
33.（4）柱冲洗：用buffer a冲洗层析柱，至基线平稳，不低于5个cv。
34.（5）目标蛋白洗脱：用80%的buffer a和20%的buffer b（20mm tris，500mm咪唑，500mm nacl）洗脱层析柱，收集洗脱液到新的离心管中，得到包含重组人iii型胶原蛋白的溶液。
35.2、离子交换（1）样品处理：将亲和层析获得的重组人iii型胶原蛋白溶液用buffer a（20mmtris）稀释，直到电导小于5ms/cm。
36.（2）柱平衡：离子交换层析柱用buffer a（20mm tris）平衡至基线平稳。
37.（3）上样：将稀释后的重新胶原蛋白样品上到层析柱中，控制柱保留时间不低于5min。
38.（4）柱冲洗：用buffer a（20mm tris）冲洗层析柱，至基线平稳，不低于5个cv。
39.（5）目标蛋白洗脱：用80%的buffer a（20mm tris）和20%的buffer b（20mm tris，100mm nacl）洗脱层析柱，收集洗脱液到新的离心管中，得到包含精纯的重组人iii型胶原蛋白的溶液。
40.3、脱盐将上述重组人iii型胶原蛋白溶液用10kda的超滤膜包装置采用等体积置换的方式用纯化水进行置换，脱去溶液中的盐。
41.实施例6 sds-page蛋白电泳检测样品处理：收集实施例3制备的菌体和实施例4中纯化的样品，加入loading buffer 混合均匀，沸水浴10min，自然冷却，备用。选用金斯瑞surepage
™ꢀ
预制胶（4-12%）上样，在140 v 电压下电泳 45-55分钟直至溴酚蓝条带跑到凝胶底部。
42.考马斯亮蓝 r-250 使用微波炉染色：1) 配制染色液：在40% 乙醇和10% 醋酸溶液中溶解终浓度为0.1%（w/v）的考马斯亮蓝r250。2) 配制脱色液：将终浓度为10%（v/v）乙醇、7.5%（v/v）醋酸溶解在一起。3) 电泳完成后，撬开胶板取出凝胶，然后放入装有100 ml 染色液的染色容器中。4) 盖上容器盖子并放入微波炉中用高热档位加热8分钟。为了避免危险，请注意不要让溶液沸腾。 5) 从微波炉中取出染色容器，放在脱色摇床上常温轻摇5分钟。6) 倒掉染色液并用去离子水小心清洗凝胶。7) 倒掉去离子水，并加入100 ml 脱色液。8) 盖上盖子，放入微波炉中用高热档位加热8分钟。9) 倒掉脱色液，加入新的脱色液，重复步骤8。10) 从微波炉中取出，放在脱色摇床上常温轻轻震荡至背景清晰。
43.实验结果如图1-图2所示，显示诱导后重组人iii型胶原蛋白得到表达，纯化后目的蛋白基本无降解条带。
44.同时，我们考察了纯化样品冻干后在常温保存条件下的稳定性，如图3结果显示，样品常温下保存12个月无明显降解条带。
45.考察例1 其他随机序列重组胶原蛋白表达构建尝试了多种不同序列的表达方案，结果发现这些随机选择的序列表达后的稳定性很差。本考察例选择其中一个序列进行说明。
46.参照实施例1~实施例5的方法构建表达菌株，并制备提纯样品。所选择序列以“gapgpqgp rgdkgetger gaa”为重复单元，全序列如下所示：mgapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaagapgpqgprgdkgetgergaahhhhhh如图4和图5显示，对目的蛋白提纯后经sds-page检测，有许多降解条带。
47.应用例1 重组人iii型胶原蛋白促进细胞迁移试验将l929细胞按每孔5
×
105个细胞接种到6孔板中，在37 ℃，5 % co2培养箱培养24h后，用10μl枪头在6孔板底部轻推，形成纵向和横向的十字划痕，用pbs漂洗细胞3次，去除划掉的细胞。
48.将动物胶原和实施例5所制备的重组胶原蛋白冻干品无血清培养基配制成0.5mg/
ml的溶液，并用0.22μm滤膜过滤除菌，分别在重组胶原蛋白组和动物胶原蛋白组加入2 ml上述溶液。空白对照组只加入无血清培养基。在37 ℃，5 % co2培养箱培养。分别在0h和24h，在光学显微镜下拍照。
49.如图6显示，重组胶原蛋白比动物胶原有更强的促细胞迁移的性能。
50.由上述实施例可以看出，利用本发明的重组人iii型胶原蛋白相较于随机选择的序列具有更高的稳定性，并且比动物胶原有更好的促进细胞迁移的能力。
51.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。