肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法

1.本发明涉及肝癌药物仑伐替尼技术领域，尤其涉及肝癌药物仑伐替尼耐药 机制的研究方法。


背景技术：

2.肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc，简称肝癌)是肝脏最常见的恶性 肿瘤，具有隐匿性、进展迅速、恶性程度高、治疗效果差、化疗耐药率高等特 点。近70％的hcc患者诊断时已处于疾病中晚期，不再适合根治性治疗方案。 基于仑伐替尼的靶向治疗是中晚期hcc患者的首选药物之一，它属于喹啉羧酰 胺类，是一种新型口服多激酶抑制剂，较索拉非尼抑制血管内皮生长因子发挥 抗肿瘤效果具有明显优势。目前tki的临床应用使得部分不可切除的肝癌患者 出现降期，甚至部分患者达到临床手术指征而获得更多治愈机会，因此被认为 是目前中晚期肝癌的重要治疗手段。然而仑伐替尼化疗耐药是其一大挑战。因 此，探索预警仑伐替尼耐药的新分子，可最大程度优化治疗方案，提高治疗效 果。
3.长链非编码rna(lncrnas)是近年来发现的一类主要的非编码rna， 其长度超过200个碱基，不仅调节人体基本生物学过程，而且在人类疾病特别 是肿瘤性疾病中发挥重要作用。肝癌中lncrnas可作为促癌或抑癌分子，是判 断肝癌诊断、治疗、预后的潜在标记物。研究发现，体液中可检测到 lncrnas存在，不同的lncrna代表癌组织的起源，且在细胞外环境中具有动 态调节性、组织特异性和丰富性，对hcc诊断、治疗及监测预后具有重要价值。 据报道，长链非编码rna中的nr2f1-as1及uca1可促进hcc进展，调节 耐药相关蛋白abcc1和经典的akt/mtor癌症通路介导仑伐替尼化疗耐药的 发生。关于lncrna介导仑伐替尼耐药的报道较少，并且缺乏探索仑伐替尼耐 药标记物的相关研究。因此，筛选仑伐替尼耐药相关lncrna，评估lncrna用 于仑伐替尼化疗耐药的诊断标记物的价值，可推进lncrna的临床应用。


技术实现要素：

4.针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种肝癌药物仑伐替尼耐药机制的 研究方法，通过筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子，探索nrav与 仑伐替尼治疗效果的关系，得到nrav与肝癌药物仑伐替尼耐药机制的关系。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
6.肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，
7.s1：分别构建仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感的肝癌细胞；
8.s2：高通量筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子；
9.s3：分析步骤s2中筛选出来的新分子nrav基因在仑伐替尼耐药和仑伐替 尼敏感肝癌细胞及组织中的表达水平；
10.s4：分析nrav调控肝癌仑伐替尼耐药可能机制。
11.进一步的，步骤s2的具体操作包括以下步骤，
12.s201：利用高通量转录组测序技术分析仑伐替尼耐药引起的基因差异，分析 仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感两组肝癌细胞差异的lncrnas；
13.s202：筛选仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感肝癌细胞中显著高表达的 lncrnas。
14.进一步的，步骤s3的具体操作包括以下步骤，
15.s301：提取肝癌蜡块组织总rna，检测nrav水平；
16.s302：根据临床数据分析nrav与肝癌预后以及不同化疗方案患者预后的关 系；
17.s303：利用合成nrav特异性探针进行组织荧光探针原位杂交技术，检测 nrav在仑伐替尼耐药和仑伐替尼敏感肝癌患者肿瘤组织中的水平。
18.进一步的，步骤s301的具体操作包括以下步骤，
19.s3011：将肝癌蜡块样品切成5-10μm厚的片状，并迅速将切片置于1.5ml 无rna酶的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10s，室温下12,000 rpm离心2min；
20.s3012：用枪头吸除上清，然后加入1ml无水乙醇并混匀，室温下12,000 rpm离心2min；
21.s3013：用枪头吸除上清，室温或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完 全；
22.s3014：加入200μl裂解液以及10μl蛋白酶k并充分混匀，55℃孵育 15min，80℃孵育15min，室温下12,000rpm离心5min，转移上清至新的无 rna酶离心管中；
23.s3015：在转移后的上清中加入220μl的缓冲液rb混匀，然后加入660μl的 无水乙醇并充分混匀；
24.s3016：取700μl步骤s3017中形成的溶液和沉淀，转移至吸附柱中， 12,000rpm离心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中，重复此步骤，直到 所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱；
25.s3017：向吸附柱中加入80μl的dnase i工作液，室温静置15min，然后再 向吸附柱中再加入500μl去蛋白液rw，室温下12,000rpm离心1min，弃掉废 液后将吸附柱放回收集管中；
26.s3018：向吸附柱中再加入500μl洗液rw，室温静置2min，12,000rpm离 心1min，弃掉废液后将吸附柱放回收集管中；重复该步骤多次，将吸附柱置于 室温静置5min后转入新的无rna酶离心管，悬空滴加30-100μl depc水，室 温静置5min，12,000rpm离心2min，离心管底即为rna；
27.s3019：采用步骤s202中的方法对离心管底的rna进行逆转录，以及rt
‑ꢀ
pcr检测nrav水平。
28.进一步的，步骤s303中合成nrav特异性探针的具体操作包括以下步骤，
29.s3031：石蜡组织样本依次进行烤片、脱蜡、浸泡、切片、消化、清洗和再浸泡 处理；
30.s3032：对每块组织切片进行预杂交、杂交和清洗；
31.s3033：对杂交处理后的切片进行dna染色；
32.s3034：避光条件下进行封片。
33.进一步的，步骤s4的具体操作包括以下步骤，
34.s401：检测lenva-s和lenva-r的肝癌细胞中ros水平是否存在差异；
35.s402：分析lenva-s和lenva-r肝癌细胞中细胞差异表达的基因，并进行 基因富集分析耐药相关的信号通路；
36.s403：根据步骤s401中分析出来的耐药基因富集的信号通路，筛选此通路 中与耐药相关的基因，统计tcga数据库肝癌病人nrav水平与耐药相关基因 表达量的相关性，确定与nrav相关性最高的基因slc；
37.s404：提取肝癌细胞总rna进行反转录，然后进行rt-pcr检测 nrav在肝癌细胞中的表达情况；
38.s405：提取肝癌细胞总蛋白，检测肝癌细胞中slc蛋白水平；免疫组织化学 染色分析slc与肝癌及仑伐替尼耐药的关系。
39.s406：分析slc与肝癌患者预后的关系。
40.本发明的有益效果是：
41.1、本发明通过筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子，探索 nrav与仑伐替尼治疗效果的关系，得到nrav与肝癌药物仑伐替尼耐药机制 的关系，为nrav在肝癌临床诊断及治疗中的应用提供基础。
42.2、本发明通过转录组测序筛选肝癌化疗药物耐药的差异基因，基于仑伐 替尼耐药肝癌细胞进行高通量转录组测序筛选的耐药基因准确性高，证据充足。
43.3、本发明通过肝癌组织荧光探针检测lncrna表达，分析肝癌化疗耐药中 长链非编码rna的表达水平，是检测肝组织lncrna的有效技术方法。
44.lncrna在组织中的鉴定技术是目前值得改进的新技术，fish荧光探针检测用 于肝癌组织lncrna的检测是检测lncrna的新技术。
附图说明
45.图1为本发明中lenva-r和lenva-s肝癌细胞的构建的流程图；
46.图2为本发明中lenva-r和lenva-s肝癌细胞的相对细胞活力对比结果；
47.图3为本发明中lenva-r和lenva-s肝癌细胞的凋亡细胞染色对比结果；
48.图4为本发明中转录组测序筛选仑伐替尼耐药和敏感差异表达lncrna；
49.图5为本发明中nrav水平及对hcc患者预后影响结果；
50.图6为本发明中与仑伐替尼耐药相关信号通路及相关功能。
51.图7为本发明中nrav相关靶基因slc在肝癌细胞及组织表达水平。
52.图8为本发明中slc水平对肝癌患者预后的影响。
具体实施方式
53.为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合 附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
54.实施例：
55.肝癌药物仑伐替尼耐药机制的研究方法，包括以下步骤，
56.s1：分别构建lenva-r(仑伐替尼耐药，耐药指数为3.0)和lenva-s(仑伐 替尼敏感)的肝癌细胞；如附图1-3所示，其中，图1为lenva-r和lenva
‑ꢀ
s肝癌细胞的构建的流程图，图2为lenva-r和lenva-s肝癌细胞的相对细胞 活力对比结果，图3为lenva-r和lenva-s肝癌细胞的凋亡细胞染色对比结果。 从图1-3中可以看出，与lenva-s的hepg2细胞相比，lenva-r细胞增殖能力 较强、凋亡率较低(p＜0.01)。
57.进一步的，s2：筛选肝癌细胞中与仑伐替尼耐药相关的新分子；
58.s201：利用高通量转录组测序技术分析仑伐替尼耐药引起的基因差异，分 析lenva-r和lenva-s两组肝癌细胞差异的lncrnas；
59.目前，前高通量转录组测序技术已广泛用来探索肿瘤发生及发展的原因， 也是筛选肿瘤进展及耐药基因组差异的重要技术手段，也即高通量转录组测序 技术属于现有技术，本技术中也不做赘述，通过高通量转录组测序技术可以得 出lenva-r和lenva-s两组肝癌细胞差异的lncrnas。
60.s202：rt-pcr分析lenva-r和lenva-s肝癌细胞中前50个显著表达的 lncrnas；
61.(a)分别提取lenva-r和lenva-s肝癌细胞的总rna；
62.(b)配置体系1；将2ug提取出来的总rna与0.5ug的oligo(dt)混合， 加入depc水补齐至15.9μl，混匀，如下表1所示；70℃
×
5min解链，立即冰 浴；
63.表1体系1
[0064][0065]
(c)配置体系2；将5μl 5
×
m-ml v buffer、2.5μl 10mm dntp(4
×
)、 0.6μl rnase inhibitor与1μl m-ml v混匀，如下表2所示；
[0066]
表2体系2
[0067][0068]
(d)将体系1中的预混9.1μl/管加入体系2中混匀，金属浴42℃
×
1h后 95℃
×
5min解链，得到产物cdna，测cdna浓度在4000-5000ug/ml，完成对 总rna的逆转录；
[0069]
(e)向产物cdna中加入ddh2o稀释成500μl，cdna浓度在1000-2000 ug/ml；
[0070]
(f)配置rt-pcr体系；将10μl sybr、0.4μl p1上游引物、0.4μl p2上游 引物和9.2μl步骤(e)中稀释后的cdna混匀，配制成20μlrt-pcr体系，如 下表3所示，以β-actin为内参，每个样本设置3个复孔，上机进行检测，上机 结束后数据按2
‑△△
ct
公式计算出基因相对表达量，结果如附图4所示。
[0071]
表3 rt-pcr体系
[0072][0073]
从图4中可以看出，rna-seq检测到hepg2细胞的lncrna总数为 13490个，其中lenva-s和lenva-r细胞差异表达lncrna有994个(上调的有 827个，下调的有167个)，nrav是仑伐替尼耐药中明显上调的lncrna之 一。rt-pcr检测lenva-s和lenva-r差异明显的lncrnas也证实了，nrav是仑伐替尼耐药中上调最明显的lncrna。
[0074]
进一步的，s3：利用体内和体外的方法，分析步骤s2中筛选出来的新分子 nrav在
的影响，e不同分期肝癌患者nrav水平差异。从附图5中可以看出， gepia网站分析364例肝癌患者nrav与预后关系中，与182例低水平 nrav肝癌患者相比，182例高水平nrav肝癌患者os(p＝1.3e-05)及 dfs较短(p＝0.003)。
[0090]
进一步的，步骤s303中合成nrav特异性探针的具体操作包括以下步骤，
[0091]
s3031：石蜡组织样本处理；
[0092]
①
将石蜡组织切片置于65℃恒温烤片机中烤片2h；
[0093]
②
脱蜡：将烤片后的石蜡组织浸泡于二甲苯中脱蜡15min
×
2次，随后放入 100％无水乙醇中洗涤二甲苯；
[0094]
③
将脱蜡后的石蜡组织切片，然后100％乙醇
×
3min，85％乙醇
×
3min， 70％乙醇
×
3min，ddh2o
×
3min，99℃水
×
15min依次浸泡处理；
[0095]
④
使用2
×
ssc清洗组织切片2次
×
5min；
[0096]
⑤
用200ug/ml蛋白酶k于37℃下消化组织蛋白15min；
[0097]
⑥
再次使用2
×
ssc清洗组织2次
×
5min；
[0098]
⑦
使用70％乙醇
×
3min，85％乙醇
×
3min，100％乙醇
×
3min依次浸泡切片；
[0099]
s3032：探针杂交；
[0100]
①
预杂交：在每块组织切片中加入200μl预杂交液，37℃
×
30min；
[0101]
②
杂交：在37℃避光条件下，把预杂交后的组织放于lncrna fish probe mix储存液或内参fish probe mix储存液中杂交；
[0102]
③
清洗：在42℃避光条件下，依次使用4
×
ssc清洗组织3次
×
5min， 2
×
ssc清洗组织3次
×
5min，1
×
ssc清洗组织3次
×
5min，pbs室温清洗组织 5min，去除染色的背景；
[0103]
s3033：dna染色；
[0104]
①
避光条件下使用1
×
dapi对dna进行染色；
[0105]
②
避光条件下使用1
×
pbs清洗染色后的组织3次
×
5min；
[0106]
s3034：避光条件下进行封片。
[0107]
进一步的，使用该nrav特异性探针检测nrav在7例lenva-s和3例 lenva-r肝癌患者肿瘤组织中的水平，结果如附图6所示。从附图6中可以看 出，lenva-r肝癌组织中nrav水平明显高于lenva-r患者(p＜0.0001)。
[0108]
通过以上三个步骤的研究可以发现，nrav与仑伐替尼耐药密切相关，提 示肝癌患者较差的临床预后，且可能作为仑伐替尼耐药的重要分子标记物，参 与调控仑伐替尼耐药的发生。
[0109]
进一步的，步骤s4：分析nrav与仑伐替尼耐药性的关系。
[0110]
具体的，s401：分析lenva-s和lenva-r肝癌细胞中细胞差异表达的基因， 并进行基因富集分析耐药相关的信号通路；
[0111]
具体的，通过分析步骤s2中转录组测序(rna-seq)数据得出线粒体功能 是仑伐替尼耐药相关基因主要富集的通路。
[0112]
s402：检测lenva-s和lenva-r的肝癌细胞中ros水平是否存在差异；
[0113]
具体的，采用流式细胞术检测lenva-s和lenva-r的细胞ros水平；
[0114]
1)将lenva-s和lenva-r的hepg2细胞铺于6孔板，每孔加入仑伐替尼 (10μm)；
[0115]
2)持续刺激72h，收细胞后胰酶消化，加1ml培基终止消化并吹匀，吸至 ep管中；4
℃离心机3000rpm
×
5min后弃上清。
[0116]
3)加入1ml稀释好的dcfh-da，37℃细胞培养箱内孵育30min；
[0117]
4)用无血清dmem清洗细胞3次，最后用500μl无血清dmem重悬细胞， 半小时内进行流式分析检测ros水平。
[0118]
lenva-s和lenva-r的细胞ros水平检测结果如附图7中c所示，从附图7中c 可以看出，与肝癌lenva-s细胞相比，lenva-r细胞ros水平明显降低(p＜0.01)。
[0119]
筛选并确定nrav调控线粒体相关靶基因为slc家族，分析nrav与各 基因的相关性，确定与nrav相关性最高的基因为slc。从gepia数据库分 析slc水平对364例lihc患者os及dfs的影响，并绘制kaplan-meier生存 曲线。同上步骤提取lenva-s和lenva-r的细胞总rna及蛋白，分析slc在 两种细胞中的表达水平，同上利用免疫组织化学染色分析对照、lenva-s和 lenva-r患者组织中slc表达水平。发现lenva-r的细胞和患者肝癌组织 slc明显高表达。提示slc作为nrav靶基因可能参与仑伐替尼耐药。
[0120]
s403：分别在lenva-s和lenva-r肝癌细胞中进行nrav的过表达转染， 并提取细胞总rna；
[0121]
具体的，构建nrav过表达重组质粒的具体操作包括以下步骤，
[0122]
1)设计引物：分别设计pcdna3.0-nrav的上下游引物。
[0123]
2)目的基因扩增(pcr)：目的基因扩增体系如下表6所示，pcr程序如 下表7所示，按照体系配制pcr反应液，置于pcr仪内按照pcr程序设定反 应条件以扩增目的基因。
[0124]
表6目的基因扩增体系
[0125][0126]
表7 pcr程序
[0127][0128]
3)配制好tae buffer和琼脂糖凝胶，50μl的pcr反应体系结束后加入 10μl的6
×
dna loading buffer，混匀后上样。160v电压条件下电泳12min左右， 将凝胶放于凝胶成像仪观察对应位置是否有清晰条带，若有则用刀片切下，放 入1.5ml ep管内。
[0129]
4)dna片段回收：
[0130]
①
加约400μl左右pg溶胶(没过切下的琼脂糖胶)到上述ep，60℃
×5‑ꢀ
10min彻底溶解凝胶；
[0131]
②
溶解后液体全部加入dna吸附柱内，静置至少30min；
[0132]
③
1,2000rpm离心2min后弃去外管中液体，加750μl pw洗液， 1,2000rpm
×
2min清洗一遍；加250μl pw液，1,2000rpm
×
2min清洗第二遍；
[0133]
④
将吸附柱放入新的ep管内，晾干5min，加入50-60℃ddh2o，50μl静置 5min后1,2000rpm
×
2min离心；ep管内即为回收到的pcr产物。
[0134]
5)酶切目的基因片段和载体：酶切体系如下表8所示，按表8配制反应液， 置于37℃，4-6h或过夜。
[0135]
表8酶切体系
[0136][0137]
6)载体回收：载体酶切后同未酶切质粒一起进行琼脂糖凝胶电泳，并回收 酶切后的载体(同上述dna片段回收)。最后以50μl ddh2o溶解。pcr回收 的目的基因产物直接加入150μl pg溶胶，过柱，最后以30μlddh2o回收。
[0138]
7)酶连：按照下表9的酶连体系进行酶连，置于16℃恒温金属浴，4
‑ꢀ
6h或过夜。
[0139]
表9酶连体系
[0140][0141]
8)转化：
[0142]
①
从-80℃取出感受态细胞(dh5a)，在冰上进行融化。加入全部酶连产物， 冰上静置30min。
[0143]
②
42℃金属浴热冲击1.5min，冰上冷却2min，向离心管中加入500μl无抗 生素液体lb，37℃恒温摇床
×
200rpm振荡培养1h。
[0144]
③
在超净台上将转化后产物均匀涂至带抗性的lb固体培养基平板上，倒置 平板于37℃恒温培养箱培养12-16h。
[0145]
9)挑菌后菌液pcr：挑取8个单克隆样菌落至5ml的液体lb试管中， 37℃恒温摇床
×
200rpm振荡2-3h，按表9中的体系进行菌液pcr。
[0146]
表9菌液pcr体系
[0147][0148]
表10菌液pcr程序
[0149][0150]
按照以上体系配置预混液，加入阴、阳性对照。反应完成后，在pcr产物 中加入5μl的6
×
sds混匀，进行琼脂糖凝胶电泳。选取pcr阳性菌落进行摇菌 扩增。
[0151]
10)质粒提取：
[0152]
①
将扩增好的菌液倒入ep管，离心1,2000rpm
×
2min，弃上清。
[0153]
②
每5ml细菌中加入250μl重悬液，吹打均匀。
[0154]
③
每5ml细菌中加入250μl裂解液，立即向每5ml细菌中加入10μl碱性蛋 白酶，翻转混匀，放置5min。
[0155]
④
每5ml菌液中加入350μl中和液，翻转混匀，将ep管倒置10min，1,2000rpm离心15min。
[0156]
⑤
将离心后的上清液打入内柱，静置2min后1,2000rpm
×
2min离心，回倒， 再次静置，离心。
[0157]
⑥
在内柱中加750μl洗液后1,2000rpm
×
2min离心，倒掉外管中的液体。
[0158]
⑦
再加入250μl洗液后1,2000rpm
×
2min离心。弃外管，套上新ep管，静 置5min晾干。
[0159]
⑧
每5ml菌液加50μl加热的60℃去离子水，静置5min。
[0160]
⑨
离心内柱加ep管，1,2000rpm
×
2min离心，质粒存入ep管。测质粒浓度 后-20℃保存备用。
[0161]
11)双酶切质粒鉴定：双酶切质粒鉴定体系如下表11所示。
[0162]
表11双酶切质粒鉴定体系如
[0163][0164]
双酶切质粒37℃温箱4-6h或过夜，进行dna电泳鉴定是否构建成功，并 送华大基因进行测序，测序成功后，进行细胞转染。
[0165]
12)细胞过表达转染技术鉴定重组质粒：
[0166]
①
铺293t细胞，细胞密度80％左右。
[0167]
②
待细胞贴壁后进行半量换液，更换新鲜dmem。
[0168]
③
转染用量：如表12所示。
[0169]
表12转染用量
[0170][0171]
④
根据表12的量，计算出所用vg，混入氯化钠后静置5min。
[0172]
⑤
将稀释好的质粒加入到稀释后的vg中，混匀，静置15min，缓慢加入细 胞培养液中，培养4-6h后换液。
[0173]
⑥
再培养24-48h后收细胞总rna进行如上步骤的逆转录，后进行rt
‑ꢀ
pcr。
[0174]
⑦
rt-pcr：rt-pcr体系(20μl)如下表13所示。
[0175]
表13 rt-pcr体系
[0176][0177]
⑧
每个样本设置3个复孔,上机结束后以β-actin为内参，按2
‑△△
ct公式计 算两组nrav相对表达量。
[0178]
进一步的，敲低转染mhcc97h细胞nrav基因的具体操作包括以下步骤，
[0179]
1)细胞的量为50-60％为最佳。
[0180]
2)配转染试剂：如表14所示，每份转染试剂rnaimax 10μl+dmem补齐 至500μl。
[0181]
表14转染试剂
[0182][0183]
3)将sirna+转染试剂混匀后静置20min。
[0184]
4)分别加至各培养皿中6-8h后换液，48-72h后收细胞。
[0185]
5)提取细胞总rna，进行rt-pcr，鉴定nrav敲低效果。
[0186]
按照上述nrav过表达重组质粒构建过程和敲低转染mhcc97h细胞 nrav基因的具体操作，在hepg2细胞进行nrav的过表达转染，并提取细 胞总rna。
[0187]
s405：将步骤s404和步骤s405中提取的总rna进行反转录，然后进行rt
‑ꢀ
pcr检测nrav在肝癌细胞中的表达情况；
[0188]
rt-pcr：rt-pcr体系(20μl)如下表15所示。
[0189]
表15 rt-pcr体系
[0190][0191]
基因：β-actin(内参)，每个样本设置3个复孔。
[0192]
4)上机结束后以lenva-s或lo2为对照，按2
‑△△
ct
公式计算出nrav或 slc基因的相对表达量。
[0193]
s407：检测肝癌细胞中slc蛋白水平；
[0194]
具体的，使用western blot和免疫组织化学染色检测肝癌细胞中slc蛋白水平。
[0195]
western blot检测肝癌细胞系slc蛋白水平的具体操作包括：
[0196]
1)收集lenva-s和lenva-r细胞总蛋白：
[0197]
①
去除各组细胞dmem培养基，pbs清洗细胞，胰酶消化后收取细胞至 ep管。
[0198]
②
3000rpm
×
5min离心，弃上清，1ml pbs洗涤细胞，再次 3000rpm
×
5min离心，弃上清，收细胞置于冰上。
[0199]
③
根据细胞的量加入3倍体积ripa裂解细胞，冰浴30min后加入与 ripa等量2
×
sds蛋白上样缓冲液，沸水煮15min，1,2000rpm
×
2min。
[0200]
2)sds-page电泳：分别取10～15μl蛋白样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳(sds-page)，电压设定为160v，电泳至条带明显分散开后终止电泳。
[0201]
3)转膜：将硝酸纤维素膜(nc膜)及滤纸在转膜液中充分浸润，将电泳 后的聚丙烯酰胺凝胶置于nc膜上，并在两侧各夹4层滤纸，自下而上按照滤 纸-nc膜-凝胶-滤纸的顺序小心放置于半干转膜仪，避免各层之间存留气泡， 安装好转膜仪，16v转膜1h。
[0202]
4)抗体孵育+显影：电转完毕后，将nc膜置于用含5％脱脂奶粉的 1
×
tbst封闭液中10min-1h；分别孵育抗β-actin抗体(hrp)、抗slc抗体 (兔源)，室温下1h或4℃过夜，再用1
×
tbst洗膜3次，10min/次；用ecl方法进行显色，bio-rad凝胶成像分析仪显影成像并保存图片。
[0203]
免疫组织化学染色检测肝癌组织中slc水平的具体操作包括：
[0204]
1)烤片：65℃烤片1h。
[0205]
2)脱蜡及覆水：二甲苯
ⅰ×
5min，二甲苯
ⅱ×
5min，100％酒精
×
5min， 90％酒精
×
5min，80％酒精
×
5min，75％酒精
×
5min，蒸馏水
×
5min。
[0206]
3)修复：配置修复液2l，放入高压锅待阀门跳起来以后，调成1000w， 计时2-5min，拨动气阀放气后打开锅盖自然降温至室温。
[0207]
4)封闭：用非特异性染色阻断剂封10min；pbs洗5min
×
2次；非特异性 染色阻断剂封闭
×
30min。
[0208]
5)一抗：抗slc抗体1:50孵育
×
4℃过夜，后用pbs洗5min
×
2次。
[0209]
6)二抗：生物素标记的单抗鼠/兔igg室温孵育
×
15min，pbs洗5min
×
2次。
[0210]
7)三抗：链霉卵白素-过氧化物酶
×
15min，用pbs洗5min
×
2次。
[0211]
8)显色：dab显色1-3min。
[0212]
9)苏木素染色：1-5min，苏木素新则时间短1min，旧则时间延长至 5min。分化30s后，自来水10-30min返蓝。
[0213]
10)脱水：75％酒精
×
5min
→
85％酒精
×
5min
→
90％酒精
×
5min
→
100％酒精
ꢀ×
5min
→
二甲苯
ⅱ×
5min
→
二甲苯
ⅰ×
5min。
[0214]
11)封片晾干后拍照留存：中性树脂胶封片，待晾干后再普通光学显微镜下 拍照存取图片。
[0215]
s408：检测仑伐替尼作用下hepg2和mhcc97h细胞存活情况；
[0216]
具体的，使用cck-8法检测仑伐替尼作用下hepg2和mhcc97h细胞存活情 况。
[0217]
1)胰酶消化细胞正在培养的贴壁hepg2和mhcc97h细胞；
[0218]
2)取100μl细胞到6孔板加培养基至1ml；
[0219]
3)取10μl加至细胞计数板用细胞计数仪测定细胞浓度c；
[0220]
4)取96孔板，每孔铺6000个细胞(v＝6000/cμl)，将培基补至100μl， 待细胞贴壁约4-6h后，向两组细胞加入仑伐替尼，浓度呈对数递增(0，2， 4，8，16，32μm)，每组3个复孔。
[0221]
5)加药后，将96孔板放于37℃细胞培养箱，第3天将各孔的dmem吸 净，每孔加dmem 90μl+cck-8 10μl，培养1h后将反应后上清液全部吸至新 的96孔板，排净气泡，thermo酶标仪选择450nm波长进行上机检测，记录数 值并计算两组存活率差异。
[0222]
s409：对步骤s407和步骤s408中的检测结果进行统计分析。
[0223]
应用spss 21.0及graphad prism 8.0进行数据统计分析。两样本之间比较 采用独立样本t检验，所有的实验数据以均数
±
标准差表示。pearson相关性分 析用于分析两者之间相关性，计算对应r值及p值。kaplan-meier生存曲线采 用log rank法进行统计分析。p＜0.05认为差异具有统计学意义。
[0224]
slc在仑伐替尼敏感及耐药肝癌组织的表达水平如附图7所示，附图 7中a为tcga数据库中肝癌患者和正常对照slc表达水平差异，b为仑伐替 尼敏感和耐药肝癌细胞slc蛋白水平及转录水平的差异，c为正常肝组织与仑 伐替尼敏感、耐药肝癌组织中slc的蛋白表达水平差异。从附图8中可以看出， 与lenva-s的hepg2细胞相比，lenva-r细胞slc转录及翻译水平较高(p＜ 0.01)；与lenva-s肝癌组织相比，肝组织明显较低，而lenva-r肝癌组织 slc表达水平较高(p＜0.01)。
[0225]
slc对肝癌患者预后的影响如附图8所示。附图8为不同水平的slc对 患者总生存期(a)及无疾病进展期的影响(b)。由此可见，高水平的 slc患者总生存期及无疾病进展期较短，提示高水平slc患者临床预后较差， 可能与治疗过程中仑伐替尼耐药有关。
[0226]
综上所述，通过对转录组测序数据进行基因富集分析，发现线粒体功能是 导致仑伐替尼耐药的关键。slc作为该线粒体相关重要基因，受nrav靶向调 控，在耐药hcc细胞及肝癌组织中高表达。临床上，高水平slc提示hcc患 者较差的临床预后，同时反应仑伐替尼治疗效果欠佳。因此，nrav-slc轴可 能是介导仑伐替尼耐药的重要途径。下一步需进一步探索nrav如何调控slc及仑伐替尼在nrav-slc途径中的作用。这将有助于阐明仑伐替尼具
体耐 药机制，为寻找新的治疗方向提供依据。
[0227]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业 的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明 还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本 发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。