一种草鱼细菌小肽识别受体及制备方法与应用

1.本发明涉及一种草鱼细菌小肽识别受体及制备方法与应用。


背景技术：

2.鱼类细菌性肠炎由于其发病广(几乎涉及所有的养殖鱼类)、危害重(感染率与死亡率均 较高)、发病机理复杂(受宿主、病原和环境等因素影响)等特点而备受人们重视，已成为水 产病害和免疫学研究领域的热点和难点。针对鱼体肠道感染的病原菌，早期的免疫学理论认 为，机体能够借助自身的固有免疫系统(innate immunity system)识别外源病原体及其产生 的危险预警信号、诱导机体产生免疫应答反应并最终清除外源致病性物质，以保持肠道的内 稳态。研究表明，固有免疫是机体防御感染的第一道防线，其介导的免疫应答过程包括对病 原体的免疫识别、免疫信号的传导及诱导产生效应分子等过程。其中，对“自己”与“非已
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的识别是诱导免疫应答反应的第一步，也是机体对病原微生物实现有效防御的基础。研究发 现，固有免疫的“非己识别”依赖于宿主基因编码的相应模式识别受体(pattern recognitionreceptor,prr)，通过识别病原微生物的保守结构——病原相关分子模式(pathogen associatedmolecular pattern,pamp)后可激活细胞内下游信号通路进而引发机体产生免疫应答反应。由 于prrs在病原识别中的核心地位，对模式识别受体的研究一直是免疫学的热点。
3.来自高等动物的研究发现，肠道细菌过度繁殖或菌群失调状况下可以释放大量代谢产物 胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,mdp)，通过肠道上皮细胞的小肽转运载体1(oligpeptidetransporter 1,pept1)越过肠黏膜屏障诱发机体产生肠道炎症反应。研究表明，肠道细胞胞内 核苷酸结合寡聚化结构域受体蛋白2(nucleotide-binding oligomerization domain 2，nod2)可 识别pept1介导转运的外来细菌寡肽产物mdp，继而通过核因子κb(nuclear factor kappa b, nf-κb)和有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,mapk)两条途径诱导 肠道细胞炎性因子的表达，从而引起炎症反应。研究表明，nod2是一类能特异性识别胞质 内细菌mdp的模式识别受体蛋白，其表达与炎性肠道疾病(inflammatory bowel disease,ibd) 密切相关，在固有免疫应答中发挥重要作用。
4.目前，针对nod2在低等脊椎动物鱼类中的表达和活性的研究，相对比较匮乏。同时， 与高等动物相比，由于鱼类nod2在结构方面存在较大差异，因而病原模式识别受体蛋白 nod2是否参与鱼类细菌性肠炎反应，尚不清楚。因此开展鱼类nod2表达及活性研究，可 以为监测肠道细菌感染状况以及鱼类细菌性肠炎的防治提供了理论依据，同时在开发新型抗 菌药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种草鱼细菌小肽识别受体及制 备方法与应用。
6.为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
7.一种草鱼细菌小肽识别受体，所述草鱼细菌小肽识别受体为草鱼nod2-lrr蛋白；所述 草鱼nod2-lrr蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种编码上述草鱼细菌小肽识别受体的基因， 所述基因的cdna序列如seq id no.2所示。
9.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述草鱼细菌小肽识别受体的基因的重组 质粒。
10.上述的重组质粒，进一步改进的，所述重组质粒为重组质粒pet32a-nod2-lrr。
11.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的草鱼细菌小肽识别受体的制备方法， 包括以下步骤：
12.s1、克隆草鱼nod2基因；
13.s2、根据草鱼nod2基因cdna序列，构建nod2-lrr功能域表达载体进行密码子优 化，得到nod2-lrr基因；
14.s3、采用bamh i和xho i对nod2-lrr基因、pet32a质粒进行双酶切，连接后转化表 达，得到重组质粒pet32a-nod2-lrr；
15.s4、将重组质粒pet32a-nod2-lrr进行iptg诱导表达，得到重组蛋白，经纯化、复 性后得到草鱼细菌小肽识别受体。
16.上述的草鱼细菌小肽识别受体的制备方法，进一步改进的，步骤s1中，以构建好的草鱼 cdna文库为模板，以cinod2-f1和cinod2-r1为引物进行pcr反应，得到草鱼nod2 基因；所述cinod2-f1的序列如seq id no.3所示；所述cinod2-r1的序列如seq id no.4 所示。
17.上述的草鱼细菌小肽识别受体的制备方法，进一步改进的，步骤s4中，所述iptg诱导 表达过程中控制温度为37℃；所述iptg诱导表达过程中控制体系中iptg的浓度为0.05mm。
18.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的草鱼细菌小肽识别受体的应用，所 述草鱼细菌小肽识别受体用于制备特异性识别鱼类细菌性肠炎的药物。
19.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的草鱼细菌小肽识别受体的应用，所 述草鱼细菌小肽识别受体用于制备治疗鱼类细菌性肠炎的抗菌药物或免疫增强剂。
20.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的草鱼细菌小肽识别受体的应用，所 述草鱼细菌小肽识别受体用于制备鱼类保健品或饲料添加剂。
21.与现有技术相比，本发明的优点在于：
22.本发明中，首次利用分子对接方法建立了草鱼nod2对细菌mdp的免疫识别模型，利 用原核表达系统成功获得了nod2-lrr蛋白，通过表面等离子体共振(srp)技术发现 nod2-lrr蛋白具有对细菌mdp的结合活性，可特异性识别细菌mdp，因此，草鱼 nod2-lrr蛋白在细菌mdp免疫识别中发挥中重要的作用，为监测鱼类肠道细菌感染状况 以及鱼类细菌性肠炎的防治提供了理论依据，在开发新型抗菌药物、免疫增强剂和饲料添加 剂等方面具有潜在应用价值。
附图说明
23.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附 图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
24.图1为本发明实施例1中草鱼nod2基因在细菌mdp刺激下的表达水平。
25.图2为本发明实施例1中草鱼nod2蛋白与细菌mdp的分子结合模式。图3为本发明实施例1中草鱼nod2蛋白的sds-page检测结果。
具体实施方式
26.以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本 发明的保护范围。
27.以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售。
28.实施例1
29.一种草鱼细菌小肽识别受体，该草鱼细菌小肽识别受体为草鱼nod2-lrr蛋白，氨基酸 序列如seq id no.1所示。
30.一种上述本实施例中的草鱼细菌小肽识别受体(草鱼nod2-lrr蛋白)的制备方法，包 括以下步骤：
31.(1)样品收集：
32.取健康的鲜活草鱼(平均体重30g左右)，平均分为2组。实验组草鱼采用腹腔注射100 μl mdp溶液(10μg/ml,invitrogen)，对照组每条鱼注射等体积的pbs缓冲液。注射后的草鱼 立即放回养殖桶，同时每组随机取样3条作为0h的样品。在注射后3、6、12、24、48和72 小时随机取每组的3条草鱼，用消毒的镊子和剪刀解剖鱼体并取出肠道组织，样品置于液氮 中保存用于总rna的提取。
33.(2)总rna提取：
34.肠道样品总rna使用rnaiso(takara)试剂提取，具体步骤如下：取100mg草鱼肠道组 织于液氮预冷的研钵中，将组织磨成粉末之后，转移到装有1ml rnaiso的离心管中，吹打、 混匀；加入200μl氯仿，剧烈震荡40s，室温放置5min；4℃，12,000
×
g离心15min，吸 取上清0.5ml转移至新管；加入0.5ml的异丙醇，混匀；4℃，12,000
×
g离心10min，弃 上清；用1ml 75％乙醇清洗rna沉淀；弃上清，加入30μl depc水溶解rna；用1.2％琼 脂糖凝胶电泳和核酸蛋白定量仪分别检测rna的完整性和浓度。
35.(3)cdna文库构建：
36.草鱼肠道cdna文库构建使用primescripttmrt reagent kit with gdna eraser(takara)， 具体步骤如下：
①
去除基因组dna反应：在microtube管中配制反应液，包括2μl 5
×
gdnaeraser buffer，1μl gdna eraser，1μg草鱼肠道总rna，加rnase free h2o将总体积补至 10μl；42℃，2min，4℃结束。
②
反转录反应：在上述microtube管中配制反转录反应液， 包括步骤1中10μl反应液，4μl 5
×
primescript buffer 2(for real time)，1μl primescript rtenzyme mix 1，4μl rnase free h2o和1μl rt primer mix；反应体系轻弹混匀，稍离心； 37℃，15min；85℃，5s使反转录酶失活；冰上冷却，-20℃保存。
37.(4)草鱼nod2基因cdna序列克隆：
38.根据草鱼肠道转录组数据库中筛选到的序列信息，设计一对包含草鱼nod2基因的
拓扑和坐标结构，然后进行模拟。在分子动力学过程中，将蛋白质所有重原子进行限制 (position restrain：-2000kcal/mol)，即保持蛋白质整体结构不发生较大变化。如果在这种参 数设定下蛋白结构还产生较大变化，说明蛋白质结构上该部分氨基酸较容易发生变化，对小 分子结合影响比较大。
57.结果如图2所示，草鱼nod2蛋白对mdp的结合口袋主要由lrr区域(由9个lrr 结构组成，每个lrr包含典型的β-sheet和α-helix二级结构)构成，含有较多的极性氨基酸， 可与小分子mdp之间形成较好的极性氢键作用；而mdp结构中含有较多的极性化学基团， 能与nod2-lrr区域的亲水性以及疏水性氨基酸口袋形成较好的结合作用(图2a、b)。通 过进一步的分子结合模式分析发现，影响草鱼nod2结合细菌mdp的潜在关键氨基酸位点 包括：arg793、asp768、phe821、arg847、lys817等(图2c、d)。通过本研究建立的草鱼 nod2-lrr对细菌二肽mdp的结合模型，将为后续揭示草鱼nod2对细菌mdp的免疫识 别机制，开展nod2活性蛋白制备研究奠定基础。
58.(6)草鱼nod2-lrr蛋白的表达
59.(6.1)载体构建：
60.基于图2结果，选择草鱼nod2蛋白中对mdp的结合口袋lrr区域(nod2-lrr： 731-977aa)序列，在大肠杆菌系统中进行密码子优化，获得优化后的基因片段序列，送公司 合成，即为nod2-lrr基因序列，其核苷酸序列如seq id no.2所示，含有741个碱基。采 用bamh i和xho i对pet32a质粒进行双酶切，反应体系为：quickcut xho i 1μl，quickcutbamh i 1μl，10
×
quickcut buffer 5μl，pet32a质粒1μg，ddh2o up to 50μl。轻轻混匀后 瞬时离心，37℃保温10min。酶切反应结束利用琼脂凝胶电泳检测双酶切效果，并通过割胶 方式进行回收。利用clonexpress
tm ii(vazyme)试剂进行重组反应，反应体系如下：exnase
tm ii 2μl，5
×
ce ii buffer 4μl，线性化pet32a载体50～200ng，pcr扩增产物200ng，ddh2o up to 20μl。体系配制完成后，置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰 水浴中冷却5min。重组反应结束后，将产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5α中，菌落pcr 检测后选取阳性克隆送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。测序成功后扩大培养，利用hipureplasmid ef micro kit(magen)提取重组质粒(pet32a-nod2-lrr)，该重组质粒 (pet32a-nod2-lrr)含有草鱼细菌小肽识别受体nod2-lrr蛋白的基因。
61.(6.2)草鱼nod2-lrr蛋白的表达
62.将测序正确的重组质粒pet32a-nod2-lrr转入大肠杆菌bl21感受态细胞，热激后涂布 在含有对应抗生素的平板上培养；挑取单克隆到含有氨苄青霉素的液体培养基中培养；当od 值达到0.6时，添加诱导剂0.5mm iptg，继续培养，37℃条件下培养12h，未添加诱导剂的 为阴性对照；离心，弃上清，收集菌体；在收集到的菌体中加入缓冲液a(pbs,ph7.4)悬 浮，使用超声破碎仪使其充分溶解，离心，离心后的沉淀使用缓冲液b(8m urea,50mmtris-hcl,300mm nacl,ph8.0)进行溶解，分别对上清和沉淀处理，制样，sds-page检测。
63.(6.3)草鱼nod2-lrr蛋白的纯化
64.细胞菌体用缓冲液c(8m urea,50mm tris,300mm nacl,0.1％triton x-100,ph8.0)溶 解、超声破碎，离心收集上清粗蛋白；取5ml ni-nta，用5倍柱床体积的binding buffer(8 m urea,50mm tris,300mm nacl,ph8.0)清洗平衡柱子，流速5ml/min；将粗蛋白与平衡 后的柱填料孵育1h；将孵育后的产物上柱，收集流出；用binding buffer清洗平衡
autodock等对接软件进行了结合模式分析，获得了最佳结合构象下的结合自由能，同时 预测nod2对mdp的结合口袋及其关键结合位点。通过分子对接建立的nod2-mdp结合模 型可为进一步以nod2作为靶点开展草鱼肠道免疫应答机理以及相关药物开发的研究提供理 论依据。
72.本实施例中，从编码序列(稀有密码子)和表达条件(温度和iptg浓度)方面优化了 nod2-lrr原核表达体系，具体为：利用密码子优化技术构建了识别mdp的草鱼 pet32a-nod2-lrr原核表达载体，利用合适的温度(37℃)和iptg浓度(0.05mm)筛选得 到高效表达草鱼nod2-lrr蛋白片段的原核表达体系，最终获得了较高纯度的表达产物。本 发明建立的原核表达体系和条件可为下一步进行工业化生产nod2-lrr奠定基础，同时为开 展nod2-lrr免疫识别功能研究及开发nod2作为免疫增强剂应用于水产养殖产业提供条 件。
73.本实施例中，利用表面等离子体共振技术发现免疫模式识别受体nod2蛋白对细菌mdp 具有较好的结合活性，具体为：利用表面等离子体共振技术检测了草鱼nod2-lrr片段和细 菌mdp的结合活性，结果表明草鱼nod2-lrr和细菌mdp具有一定的亲和力，为开展鱼 类免疫模式识别受体对病原相关分子模式的识别机制研究提供了切实可行的技术手段，同时 亦为以nod2为草鱼细菌性肠炎治疗的分子靶点，为后续开展基因治疗、药物治疗等研究提 供重要依据。
74.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本 发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在 不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发 明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱 离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同 替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。