一种酚酰胺类肽的制备方法及其构成的抗炎抑菌中药组合物与流程

1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种酚酰胺类肽的制备方法及其构成的抗炎抑菌中药组合物。


背景技术：

2.口腔溃疡是常见的口腔黏膜病，口腔溃疡的诱因主要为局部创伤、食物、激素水平改变等有关，患者一般会表现明显的疼痛，影响进食。此外，口腔溃疡的发生发展过程与炎症有着密切关系。到目前为止，临床上还没有一种很好的局部用药物用来治疗口腔溃疡。
3.龋齿是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病。龋齿被who列为危害人类健康的三大慢性非传染性疾病之一，仅次于癌症和心血管疾病。在牙菌斑中的细菌种类很多，包括缓症链球菌、变形链球菌等。其中，变形链球菌(streptococcus mutans)是主要致龋菌，在口腔内检出率高达80％。变形链球菌的致龋能力主要涉及形成生物膜、合成胞外多糖、黏附、耐酸和产酸等方面。缓症链球菌(streptococcus mitis)是人体正常菌群之一，是口腔常驻菌群的重要组成菌种之一。研究发现，当缓症链球菌形成牙周生物膜后，不仅会导致口腔疾病，还会导致感染性心内膜炎并引发体内免疫反应。因此，抑制变形链球菌和缓症链球菌生物膜形成及其生物膜致病性一直是学者的研究重点。
4.在植物中分离的一些天然小分子化合物被证明具有一定的抑菌消炎作用，可起到预防和缓解口腔溃疡、抑制龋齿等口腔疾病的作用，受到临床的广泛重视和应用。


技术实现要素：

5.本发明的目的是要提供一种采用中医药提取技术、副作用小、疗效独特的酚酰胺类肽的制备方法及其构成的抗炎抑菌中药组合物。
6.为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
7.一种酚酰胺类肽的制备方法，其包括以下步骤：将枸杞与水混合均匀，枸杞与水的质量比为1:(10-50)，将混合液超声提取，离心，取上清液经真空低温冻干后经色谱法分析及hplc制备即得所述枸杞酚酰胺类肽。
8.上述的一种酚酰胺类肽的制备方法，其所述混合液超声提取30分钟，5000g离心10分钟，超声提取、离心，重复3次。
9.一种抗炎抑菌的中药组合物，其包括所述枸杞酚酰胺类肽，所述枸杞酚酰胺类肽的结构式为分子式为c
30h33
n3o8。
10.上述的一种抗炎抑菌的中药组合物，其还包括中药活性提取物，，所述中药活性提取物与枸杞酰胺类肽的质量比为(1～100):(1～100)。
11.上述的一种抗炎抑菌的中药组合物，其所述中药活性提取物包括枸杞活性提取
物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物中的两种或多种组合。
12.上述的一种抗炎抑菌的中药组合物，其所述枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物的质量比为(1～10):(1～10):(1～10):(1～10)，优选地，所述枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物的质量比为1:1:1:1。
13.上述的一种抗炎抑菌的中药组合物，其还包括辅料基质，所述辅料基质包括单糖、寡糖、多糖、氨基酸、防腐剂、ph调节剂、抗炎助剂中的至少一种。
14.上述的一种抗炎抑菌的中药组合物，其所述中药组合物的形式包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂。
15.上述的一种抗炎抑菌的中药组合物，其还包括载体，所述中药组合物负载在所述载体上，所述中药组合物的质量分数为5％-70％。
16.上述的一种抗炎抑菌的中药组合物，其所述载体包括溶剂、聚合物、脂质体、稀释剂、赋形剂中的至少一种，所述溶剂包括去离子水、生理盐水或其它非水性溶剂，所述聚合物包括聚乙烯亚胺及其改性物、壳聚糖、聚乳酸、明胶。
17.有益效果：
18.本发明通过中药活性提取物及酰胺类肽类化合物制备用于抗炎抑菌的中药组合物，具有舒缓口腔炎症(如口腔溃疡)、抑制缓症链球菌(streptococcus mitis)和变形链球菌(streptococcus mutans)生物膜的形成，及其在防治龋齿、牙周炎等改善口腔问题的口腔卫生用品、口腔保健品中的应用。
19.说明书附图
20.图1本发明实施例中枸杞酚酰胺类肽的高效液相色谱测定结果图；
21.图2本发明实施例中枸杞酚酰胺类肽的1h-nmr谱图；
22.图3本发明实施例中枸杞酚酰胺类肽的
13
c-nmr谱图；
23.图4本发明实施例中中药组合物对生物膜形成抑制效果；
24.图5本发明实施例中中药组合物对变形链球菌、缓症链球菌正常生长的影响
25.图6本发明实施例中中药组合物抑制苯酚诱导的人永生化口腔上皮细胞氧化应激、炎性因子分泌
具体实施方式
26.下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1
28.本实施例提供了一种分离纯化的酚酰胺类肽的制备方法，包括以下步骤：
29.1)枸杞酚酰胺类肽的分离方法。
30.将市售的50g枸杞(干重)与500ml水混合均匀，将混合液超声提取30分钟，5000g离心10分钟，超声提取、离心，重复3次。取上清液经过真空低温冻干后经色谱法分析及hplc制备即得到所述枸杞酚酰胺类肽。枸杞酚酰胺类肽，所述枸杞酚酰胺类肽的结构式为
分子式为c
30h33
n3o8。
31.上述制备型hplc的制备条件为：以0.1v％三氟乙酸水溶液为流动相a，以0.1v％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相b，流动相a：流动相b＝60:40，检测波长为260和300nm。由图1可以看出枸杞酚酰胺类肽-1出峰时间为8.56min。由图2，图3的解析化合物1h nmr及
13
c nmr谱最终确定枸杞酚酰胺类肽为化合物(2,3,4-trimethoxybenzoyl)glycylphenylalanylphenylalanine。
32.2)中药组合物制备
33.本实施例中中药组合物，包括枸杞酚酰胺类肽，还包括中药活性提取物、辅料基质，中药活性提取物与枸杞酰胺类肽的质量比为(1-100):(1-100)。中药活性提取物包括枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物中的两种或多种组合。辅料基质包括单糖、寡糖、多糖、氨基酸、防腐剂、ph调节剂、抗炎助剂中的至少一种。枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物的质量比为1:1:1:1。
34.中药活性提取物及枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)组合物具体配方如下：
35.枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物及枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)的质量比为1:1:1:1:0.01。
36.配方：枸杞活性提取物1g、菠萝活性提取物1g、蓝莓活性提取物1g、白桃活性提取物1g及枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)0.05g。
37.将制备好的枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)与枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物按照上述配方比进行混合均匀，制得中药活性提取物及枸杞酚酰胺类肽组合物。
38.中药组合物负载在载体上，制作成各种形式的中药制剂，中药制剂的形式包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂。其中，中药组合物的质量分数为5％-70％。载体包括溶剂、聚合物、脂质体、稀释剂、赋形剂中的至少一种，所述溶剂包括去离子水、生理盐水或其它非水性溶剂，所述聚合物包括聚乙烯亚胺及其改性物、壳聚糖、聚乳酸、明胶。脂质体可以但不限于为胆固醇、豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂等。稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类、无机盐中的一种或多种。赋形剂包括片剂中的黏合剂、填充剂、润滑剂，半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分，液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、着色剂中的至少一种。
39.本发明中药组合物具有抗菌剂或抗炎剂治疗口腔溃疡、防治龋齿、牙周炎等口腔疾病药物的应用。抗菌剂为抗缓症链球菌(streptococcus mitis)和变形链球菌(streptococcus mutans)生物膜的形成的抗菌剂；抗炎剂为抗苯酚导致口腔上皮细胞炎性损伤的抗炎剂。
40.实验1：本发明对生物膜形成抑制效果评价
41.①
接种复苏的变形链球菌(streptococcus mutans)于bhi液体培养基中培养24h，1％蔗糖-bhi培养基调整菌液浓度为2.0
×
106cfu/ml。
42.②
向变形链球菌菌液中分别加入终浓度为50μg/ml的中药活性提取物(枸杞活性
提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物质量比为1:1:1:1)、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)，加入96孔板中，150μl/孔。
43.③
菌液(含有终浓度为0.1％的dmso)为对照组，放置于37℃的恒温培养箱中培养24h。
44.④
将96孔板内的菌液吸掉，每孔加入200μl无菌水洗涤3次，除去游离的菌体。
45.⑤
干净滤纸吸干孔内残留液体，孔中加入1％的结晶紫溶液150μl，染色20min。
46.⑥
染色结束，吸掉孔内结晶紫溶液，200μl无菌水洗涤3次，干净滤纸吸干孔内残留液体。
47.⑦
每孔中加入33％的乙酸溶液150μl，溶解生物膜结晶紫复合物后，酶标仪检测570nm处的光密度值(od)值，每组做5个平行孔。
48.⑧
实验数据用mean
±
sd表示，以p《0.05，差异具有统计学意义，如图4所示。与对照组相比，中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对变形链球菌生物膜形成具有一定的抑制效果。
49.实验2：本发明对变形链球菌、缓症链球菌正常生长的影响
50.①
复苏的变形链球菌接种于bhi液体培养基中培养24h，含有1％蔗糖的bhi培养基将菌液浓度调整为2.0
×
106cfu/ml。向菌液中分别加入终浓度为50μg/ml的中药活性提取物(枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物质量比为1:1:1:1)或枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)，加入96孔板中，150μl/孔，菌液(含有终浓度为0.1％的dmso)作为空白对照，置于37℃的恒温培养中培养24h，酶标仪600nm检测od值，每组做5个平行孔。
51.②
复苏的缓症链球菌接种于bhi液体培养基中培养24h，用bhi培养基将菌液浓度调整为4.0
×
106cfu/ml。向菌液中分别加入终浓度为50μg/ml的中药活性提取物(枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物质量比为1:1:1:1)或枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)，加入96孔板中，150μl/孔，菌液(含有终浓度为0.1％的dmso)作为空白对照，置于37℃的恒温培养中培养24h，酶标仪600nm检测od值，每组做5个平行孔。
52.从图5可以看出，与空白对照组相比，50μg/ml的中药活性提取物或枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)能够抑制变形链球菌、缓症链球菌的正常生长，说明中药活性提取物或枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对缓症链球菌生物膜的抑制作用可能是通过抑制细菌生长实现的。
53.实验3：本发明对变形链球菌和缓症链球菌生物膜形成的影响
54.按上述方法分别培养变形链球菌和缓症链球菌后，检测中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对变形链球菌生物膜和缓症链球菌生物膜形成的影响，每组做5个平行孔。
55.数据采用mean
±
sd表示，组间比较采用单因素方差分析，以p《0.05为差异具有统计学意义。
56.表1 中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对变形链球菌、缓症链球菌生物膜形成的影响
[0057][0058]
从表1中可以看出，中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)在一定浓度范围内对变形链球菌和缓症链球菌生物膜的形成具有一定的抑制作用(p＜0.05)。中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对变形链球菌及缓症链球菌生物膜形成的具有显著的抑制效果。
[0059]
实验4：本发明抑制苯酚暴露诱导的人永生化口腔上皮细胞损伤
[0060]
人永生化口腔上皮细胞(hioec)复苏后于dk-sfm培养液dk-sfm培养基-角质细胞限定性无血清培养基(gibco invitrogen公司，美国)。配制细胞培养基时，在每500ml dk-sfm中加入dk-sfm growth supplement(内含2.5μg egf human recombinant和25mg bpe,bovine pituitary extract)1ml)37℃、5％co2培养，dic倒置相差显微镜观察细胞生长情况。细胞长至50％～70％汇合时，10nm苯酚刺激hioec细胞12h，dk-sfm洗涤3次，含10μg/ml中药活性提取物(枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物质量比为1:1:1:1)或枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)的dk-sfm培养液继续培养24h。
[0061]
①
cck8方法检测细胞活力变化；
[0062]
②
elisa方法检测细胞内ros及相关炎性细胞因子(tnf-α、no、pge2及il-1β、il-6、il-8)的变化；
[0063]
从图6a中可以看出，苯酚暴露使hioec细胞活力显著降低，而中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)作用后，细胞活力有一定的提高。其中，枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)组细胞活力显著高于苯酚组。
[0064]
进一步的，苯酚暴露使hioec细胞活力显著降低，而中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)作用后，细胞活力有一定的提高。其中，中药活性提取物组细胞活力显著高于苯酚组。
[0065]
hioec细胞按实验设计处理后，收集细胞；参考elisa试剂盒操作说明书检测ros的分泌量。结果如图6b所示，与空白对照组相比，苯酚暴露使hioec细胞内ros含量(细胞活性氧含量)显著增加，而中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)使苯酚暴露诱发的ros降低。
[0066]
hioec细胞按实验设计处理后，收集细胞培养液；参考elisa试剂盒操作说明书检测il-6、il-8、il-1β、no、pge2、tnf-α的分泌量。结果如图6c，d所示，苯酚暴露使hioec细胞il-6、il-8、il-1β、no、pge2、tnf-α分泌增加，说明苯酚暴露诱发hioec细胞严重的炎症反应。而中药活性提取物使苯酚暴露诱发的hioec细胞il-6、il-8、il-1β、no、pge2、tnf-α分泌降低。其中，枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)可显著降低苯酚暴露诱发的hioec细胞炎性细胞因子il-6、il-1β、pge2、tnf-α分泌，活性强于中药活性提取物。
[0067]
实验5：本发明外用缓解口腔溃疡
[0068]
除空白对照组外，其余模型组和治疗组大鼠用3％的戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉后，将1块预制好的直径5mm、厚约1mm的滤纸片，蘸取90％苯酚溶液(完全浸透)，然后将滤纸片置于大鼠左侧颊黏膜上烧灼60s；24h后观察烧灼区，可以看到大鼠口腔黏膜上出现直径
约4-5mm的白色损害，口腔溃疡模型制作成功。给药方法：模型组和各治疗组分别用消毒棉签黏取相应药物(模型组吸附0.5ml的0.9％氯化钠溶液)，涂布于大鼠口腔溃疡处3min。每天给予治疗药物2次，连续治疗5天，空白对照组不做任何处理。于给予治疗药物后的第1天、第3天和第5天(给予治疗药物后3h)。
[0069]
摄下大鼠口腔溃疡情况，采用医学图像分析软件(osi-ris4.19通用)进行溃疡面积计算，按照评判标准进行大鼠口腔溃疡程度评价。
[0070]
于最后1次评分结束后，将对照组和治疗组采用脊髓脱臼的方法将大鼠处死，取下局部口腔溃疡，放入10％甲醛固定，之后行石蜡包埋、切片，光镜观察治疗组和对照组大鼠口腔溃疡组织形态变化(空白组取相对应的口腔溃疡局部组织)。
[0071]
口腔溃疡程度评价标准：0，表示口腔黏膜处于正常状态，无溃疡；ⅰ，表示有溃疡，但溃疡表面无明显的假膜；ⅱ，表示口腔溃疡表面有一层薄的黄白色假膜，但周围无水肿表现；ⅲ，表示口腔溃疡表面出现较厚的假膜，并且周围伴有明显炎性水肿表现；ⅳ，表示口腔溃疡表面出现厚的假膜，溃疡周围伴有明显的炎性水肿。病理标准：
“‑”
表示口腔黏膜上皮完整，表面被覆完整的鳞状上皮，黏膜下层为疏松的结缔组织，毛囊腺体下面为肌组织；“+”表示口腔黏膜溃疡缩小2/3，余1/3的溃疡面积被新生的肉芽组织所取代；“++”表示口腔黏膜溃疡缩小1/2，余1/2的溃疡面被新生的肉芽组织所取代；“+++”表示口腔黏膜溃疡缩小1/3或未缩小，余2/3的溃疡面被新生肉芽组织所取代。
[0072]
①
、中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对大鼠口腔溃疡面积的影响：本实验中空白对照组没有溃疡。与空白对照组比较，在第1-5天，模型组形成溃疡显著(p＜0.05)，说明口腔溃疡造模成功。而与模型组比较，在第1天，各治疗组大鼠口腔溃疡面积，差异无统计学意义(p＞0.05)；在第3-5天，中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)组均可见大鼠口腔溃疡面积显著减小(p＜0.05)，见表2、表3。
[0073]
表2 中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对大鼠口腔溃疡面积的影响(mm2,mean
±
sd)
[0074][0075]
表3 中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对大鼠口腔溃疡程度的影响
[0076][0077]
②
中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对大鼠口腔溃疡程度的影响：本实验中空白对照组没有溃疡。与空白对照组比较，在造模成功后第1-5天内，模型组溃疡边缘红色充血发红、中心灰白色的溃烂面、溃烂面直径较正常组差异有统计学意义(p＜0.05)，说明口腔溃疡造模成功。而与模型组比较，在造模成功后第1天，各药物治疗组溃疡程度差
异无统计学意义(p＞0.05)；在第3天，中药活性提取物治疗组口腔溃疡程度显著减轻(p＜0.05)；在第5天，枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)治疗组口腔溃疡程度显著减轻(p＜0.05)，见表3。
[0078]
表3 中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对大鼠口腔溃疡程度的影响
[0079][0080]
③
、中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对大鼠口腔溃疡组织病理变化的影响：各组大鼠局部口腔黏膜组织病理观察结果，本实验中空白对照组大鼠没有溃疡，黏膜组织结构正常；模型组大鼠口腔黏膜溃疡缩小1/3或未缩小，其余2/3溃疡面被新生的肉芽组织所取代；中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)治疗组大鼠口腔黏膜溃疡缩小2/3，其余1/3溃疡面积被新生的肉芽组织所取代，见表4。
[0081]
表4 中药活性提取物、枸杞酚酰胺类肽(gqpa-1)对大鼠口腔溃疡组织病理变化的影响
[0082][0083]
实施例2
[0084]
本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例的将枸杞与水混合均匀，枸杞与水的质量比为1:(10-50)，中药活性提取物与枸杞酰胺类肽的质量比为(1～100):(1～100)。中药活性提取物包括枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物中的两种或多种组合。枸杞活性提取物、菠萝活性提取物、蓝莓活性提取物、白桃活性提取物的质量比为(1～10):(1～10):(1～10):(1～10)。
[0085]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。