多巴胺能神经元增殖祖细胞的标记物Msx1/2的制作方法

专利名称:多巴胺能神经元增殖祖细胞的标记物Msx1/2的制作方法
技术领域：
本发明涉及Msxl基因和Msx2基因，该基因是多巴胺能神经元增殖祖 纟田月包(dopaminergic neuron proliferative progenitor cell)的才示i己物。更具体;t也， 本发明涉及^r测多巴胺能神经元增殖祖细胞的手段，检测该细胞的方法和 检测该细胞的试剂盒。
背景技术：
多巴胺系统是很重要的系统，它参与对哺乳动物脑而言至关重要的运 动控制、激素分泌控制、情感控制等。因此，多巴胺能神经传递异常会导 致多种神经系统疾病。例如，帕金森氏病是锥体外系统的神经变性疾病， 它是由中脑黑质中多巴胺能神经元的特异性变性引起的(HARRISON， S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE Vol. 2 23rd ed., Isselbacher et al. edited by McGraw-Hill Inc., NY (1994) pp. 2275-7)。
治疗帕金森氏病的方法，即口服L-DOPA (3,4-二羟基-苯丙氨酸)的方法 主要用于补偿多巴胺产量的降低，但已知其疗效并不持久。
因此，为了补偿多巴胺能神经元的损失，最近人们尝试了一种治疗方 法，即移植6-9周龄流产胎儿的中脑腹侧区域，该区域内含有多巴胺能神经 元前体(美国专利5690927; Spencer et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1541-8; Freed et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1549-55; Widner et al. (1992) N, Engl. J. Med, 327:1556-63; Kordower et al. (1995) N. Engl. J. Med. 332:1118-24; Defer et al. (1996) Brain 119:41-50; and Lopez-Lozano et al. (1997) Transp. Proc. 29:977-80)。然而，目前除了细胞供应和伦理道德问题外(Rosenstain (1995) Exp. Neuroi.33:106; Turner et al. (1993) Neurosurg. 33:1031-7)，多种其它问题 也已显现，例如，传染性污染的风险、免疫移植物排斥(L叩ez-Lozano et al. (1997) Transp. Proc. 29:977-80 and Widner and Brudin(1988) Brain Res. Rev. 13:287-324)、因胎儿组织主要依赖于脂质代谢而不是糖酵解所造成的低存 活率(Rosenstein (1995) Exp. Neurol. 33:106)等。例如，为了解决伦理道德或供应短缺问题，已被建议的方法有使用
得自猪的皮质、紋状体和中脑细胞(例如日本专利特许公开号10-508487、 10-508488和10-509034)等。然而，在此方法中，需要经过复杂的程序来修 饰细胞表面抗原(MHCI类抗原)以抑制排斥。例如，为了解决移植物排斥问
特许公开号11-509170、 11-501818; and Selawly and Cameron (1993) Cell Transplant 2:123-9)。移植细胞可能来自MHC匹配的亲属、他人的骨髓、骨 髓库、脐血库等。然而，如果可使用患者自身的细胞，无需额外的程序和 麻烦即可解决排斥问题。
因此，得自非-神经细胞，如胚胎-干细胞(ES细胞)和骨髓基质细胞的多 巴胺能神经元体外分化系统有望被用作移植材料，以替代得自流产胎儿的 细胞。实际上，有报道表明通过将ES细胞移植到大鼠帕金森氏病模型的 损害条紋中，形成了功能性的多巴胺能神经元(Kim et al. (2002) Nature 418:50-56)。据认为，得自ES细胞或患者自身神经干细胞的再生药物的重 要性将会增加。
另一方面，治疗神经组织损伤时，需要重构脑功能，而为了与周围的 细胞形成适当的联接(网络形成)，需要移植的不是成熟细胞，而是可在体内 分化成神经元的祖细胞。然而，在移植神经元祖细胞时，除了存在上述与 供应有关的问题，还存在一个问题，即祖细胞可分化成不均一的细胞群体。 例如，在治疗帕金森氏病时，需要在含有儿茶酚胺神经元中选择性地移植 多巴胺能神经元。以前，有人建议将下述细胞用作移植细胞以治疗帕金森 氏病紋状体(Lindvall et al. (1989) Arch. Neurol. 46:615-31 and Widner et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1556-63)，得自人胚胎神经的无限增殖化细胞系 (曰本专利特许公开号8-509215, 11-506930和2002-522070), NT2Z细胞有 丝分裂后的人神经元(日本专利特许公开号9-5050554)，神经元原基细胞(曰 本专利特许公开号11-509729)，被外源基因转染以产生儿茶酚胺，如多巴胺 的细胞，骨髓基质细胞(日本专利特许公开号2002-504503和2002-513545), 基因被修饰的ES细胞(Kimetal. (2002) Nature 418:50-56)，等等。然而，这 些细胞无一仅含有多巴胺能神经元或能分化成多巴胺能神经元的细胞。
有人建议了一种从未分化的细胞群体中选择性浓缩或分离多巴胺能神 经元的方法在细胞群体的每个细胞中导入表达焚光蛋白的报道基因，所述基因处于在多巴胺能神经元中表达的基因，如酪氨酸羟化酶(TH)基因的 启动子/增强子的控制之下，分离发出荧光的细胞，籍此用肉眼观察活的多
巴胺能神经元，以进行浓缩、分离或鉴定(日本专利特许公开号2002-51775)。 然而，该方法需要复杂的导入外源基因的步骤，此外，当用于基因治疗时， 报道基因的存在会导致毒性和免疫原性的问题。
如上所述，目前，移植治疗帕金森氏病的最大问题之一是多巴胺能 神经元祖细胞无论是得自流产胎儿的中脑腹侧区域，还是经诱导后分化的， 皆为多种细胞的混合物。考虑到神经网络形成的安全性，仅分离和使用所 需的细胞种类才是合乎需要的。另外，考虑到存活力或在移植了细胞的脑 中正确形成网络的能力，可以说分离和移植较早的增殖祖细胞会获得合意 的治疗效果。
以前，有人报道过在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达的基因 Lrp4(WO 2004/065599)。另外， 一些多巴胺能神经元前体的标记物也已被报 道(WO 2004/038018和WO 2004/052190)。其中，关于Lmxla,已证实它表 达于人和小鼠的多巴胺能神经元增殖祖细胞，有丝分裂后的多巴胺能神经 元前体(postmitotic dopaminergic neuron precursor cell)和多巴胺能神经元 (WO 2005/052190)。
Msx基因是参与器官形成的同源异型框基因，已知Msxl、Msx2和Msx3 存在于小鼠中，Msxl和Msx2存在于人中(Davidson, D.(1995). Trends Genet 11:405-411)。以前曾有人报道Msxl在多种脑细胞中表达(Ramos, C., et al. (2004). Dev Dyn 230:446-60)。另据报道在Msxl/Msx2突变体小鼠中，参 与背腹方向神经管图式形成的Wntl的表达在间脑和嘴侧中脑的背侧中线 完全消失(Bach, A" et al. (2003). Development 130:4025-36)。另有报道认为: Msxl参与神经管形成早期的发育(Liu, Y.， et al. (2004). Development 131:1017-28)。
然而，无人报道Msxl和Msx2在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性 表达。
发明简述
最近，本发明人发现Msxl基因和Msx2基因(下文中有时也将其简称为 "Msxl"和"Msx2")在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达。本发明基于此发现。
本发明的目的是提供检测多巴胺能神经元增殖祖细胞的手段，检测多
巴胺能神经元增殖祖细胞的方法和检测多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂 备
J3L 。
此外，本发明的目的是提供筛选物质的方法，所述物质能有效诱导生 成多巴胺能神经元增殖祖细胞的分化过程。
另外，本发明的目的是提供产生可用于治疗帕金森氏病的多巴胺能神 经元增殖祖细胞的方法。
本发明提供了可用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的多核苷
酸探针或多核苷酸引物，它们可与由Msx 1基因或Msx2基因的核苷酸序列 组成的多核苷酸，或其互补序列杂交(下文有时也称之为"本发明的探针"或 "本发明的引物")。
本发明提供了可用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的抗Msxl 蛋白或Msx2蛋白的抗体或其部分(下文有时也称之为"本发明的抗体")。
本发明还提供了检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，其包 括检测Msxl基因或Msx2基因表达的步骤(下文有时也称之为"本发明的检 测方法")。
本发明还提供了检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂盒，其 至少包含本发明的探针，本发明的引物或本发明的抗体。
本发明提供了筛选物质的方法，所述物质能有效诱导生成多巴胺能神 经元增殖祖细胞的分化过程，所述方法包括4企测Msxl基因或Msx2基因表 达的步骤。
本发明提供了产生可用于治疗帕金森氏病的多巴胺能神经元增殖祖细 月包的方法。
本发明提供了多核苷酸用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的 用途，所述多核苷酸可与由Msxl基因或Msx2基因的核苷酸序列组成的多 核香酸，或其互补序列杂交。
本发明提供了抗Msxl蛋白或Msx2蛋白的抗体或其部分用于检测或选 择多巴胺能神经元增殖祖细胞的用途。
本发明的探针，本发明的引物，和本发明的抗体可用作多巴胺能神经 元增殖祖细胞的选择标记。因此，本发明对于移植材料的纯度^r测，以及开发体外诱导生成多巴胺能神经元增殖祖细胞的分化过程的方法等十分有 用，本发明有望促进再生医疗的实际应用。
附图简述

图1显示了与多巴胺能神经元相关的标记基因的表达时期。
图2显示了 12.5曰龄小a^月台的中脑。沿着背腹轴将中脑分成四个区^(V:最 腹侧区域，VL:腹侧区域，DL:背侧区域，D:最背侧区域)。
图3显示了通过RT-PCR法，分析Msxl, Msx2, DAT, Lmxla和Lrp4在中脑各 个区域中的mRNA表达的结果。
图4显示了通过原位杂交，分析Msxl,Nuirl和TH在11.5日龄小鼠胚胎中 脑中的mRNA表达的结果。点多汰示产生多e^肯a申^iL的区域，破折号症汰示VZ (脑室区)和ML (套层)之间的分界。
图5显示了通过免疫染色法，分析Msxl/2和Lmxla在U.5日龄小鼠胚月台中
脑中的蛋白质表ii^jy^表ii(双染色)的结果。
图6显示了通过免疫染色法，分析Msxl/2,Lmxla和TH在11.5日龄小鼠胚 胎中枢神经系MJ1侧区域的蛋白质表达的结果。
图7显示了通过RT-PCR法，分析Msxl, Msx2和其它多巴胺能神经元标 记基因在由ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞中的表达结果。
图8显示了通过细胞分选仪分离Lrp4阳性细月fe^阴性细胞。
图9显示了通过RT-PCR法，分析Msxl,Msx2和其它多巴胺能神经元标 记基因在每个多巴胺能神经元祖细胞中的表达结果，所迷细胞分离自由12.5 曰龄小鼠胚胎(E12.5)的中脑获得的细胞和SDIA分化诱导细胞。
发明详述
下文将要详细解释本发明。以下描述是解释本发明的例子，本发明并 不局限于所描述的实施方案。本说明书中使用的所有技术术语、科技术语 和术语学与本发明所属技术领域：
的普通技术人员通常所理解的含义相同，
它们仅用于解释具体的实施方案，而不会对其构成限制。只要不背离本发 明的精神，本发明可在不同的实施方案中被实施。本说明书中提及的所有 现有技术文献、公开出版物、专利出版物和其它专利文献皆以参考文献的 形式被引入本说明书中，可用于实施本发明。[多巴胺能神经元增殖祖细胞]
身为本发明中被检测或选择的目标的"多巴胺能神经元增殖祖细胞"指 的是有丝分裂停滞前的多巴胺能神经元祖细胞。
经过增殖祖细胞和有丝分裂后前体细胞的分化阶段，多巴胺能神经元 由神经上皮细胞分化为成熟的多巴胺能神经元。多巴胺能神经元增殖祖细 胞是多巴胺能神经元中最早的祖细胞，因此，预期可获得高存活力，并在 移植了细胞的脑中获得网络形成的高能力。因此，多巴胺能神经元增殖祖 细胞可用于移植疗法，以治疗因多巴胺能神经元变性使多巴胺减少而导致 的疾病，3口帕金力，氏病。
使用本发明的探针、引物或抗体作为指标选择的细胞是有丝分裂停滞 前的多巴胺能神经元增殖祖细胞，因此，从安全性、存活率和网络形成能 力方面考虑，与常规的混合细胞群体或导入外源基因的多巴胺能神经元前 体相比，本发明的多巴胺能神经元增殖祖细胞可优选用于神经变性疾病， 如帕金森氏病的移植治疗。细胞是有丝分裂停滞前的多巴胺能神经元增殖 祖细胞，即为处于增殖过程中的细胞，其具有在脑中的大多数合适的位置 分化为成熟细胞的可能性，另外，多巴胺能神经元祖细胞也具有在体内增 殖的可能性，因此，预期可获得较长期的治疗效果。因此，可以认为本发 明为神经变性疾病，如帕金森氏病的有效移植治疗的实际应用铺平了道路。
本发明的探针和引物可与Msxl基因或Msx2基因特异性杂交。如上所 述，Msxl基因或Msx2基因的表达可用作多巴胺能神经元增殖祖细胞的指 标。因此，本发明的探针或引物可用作检测多巴胺能神经元增殖祖细胞的 才示i己物。
本发明的探针和引物可用于检测Msxl基因或Msx2基因的表达，相当 于由多个碱基或碱基对，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)组成的聚 合物。已知双链cDNA也可用于组织原位杂交，本发明的探针和引物包括 该双链cDNA。用于检测组织中的RNA的特别优选的探针和引物可以是例 如RNA探针(核糖核酸探针)。
本发明的探针和引物包括由含有Msxl基因或Msx2基因核苷酸序列的 至少10个，优选至少15个，更优选至少20个，更优选至少25个连续核 苷酸的序列的多核苷酸，或其互补序列组成的探针和引物。本发明的探针和引物也包括由含有Msxl基因或Msx2基因核苷酸序列的10-50或10-30, 15-50或15-30, 20-50或20-30，以及25-50或25-30个连续核芬酸的序列 的多核苦酸，或其互补序列组成的探针和引物。
本发明的探针和引物的长度可以至少为10个碱基，优选至少为15个 碱基，更优选至少为20个碱基，更优选至少为25个碱基。本发明的探针 和引物的长度也可以为10-50个碱基或10-30个碱基，15-50个碱基或15-30 个碱基，20-50个碱基或20-30个碱基，以及25-50个碱基或25-30个碱基。
本发明探针和引物的优选实施方案提供了长度为15-30个碱基的探针 和引物，用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞，所述探针和引物由 含有Msxl基因或Msx2基因核苷酸序列的至少IO个(优选至少15个，更优 选至少20个，更优选至少25个)连续核香酸的序列的多核苦酸，或其互补 序列组成，并能与Msxl基因或Msx2基因杂交。
本发明探针和引物的优选实施方案提供了可与Msx 1基因或Msx2基因 核香酸序列的高辨别部分杂交的探针和引物。使用该探针和引物，可以较 高的准确度检测到增殖祖细胞。所述探针和引物包括可与含有选自SEQID N0:1的核苷酸1-710和963-1713，SEQ IDN0:3的核苷酸1-677和943-1546, SEQIDNO:5的核苦酸1-484和736-1316, SEQIDNO:7的核苷酸1-612和 864-1801， SEQIDNO:9的核苷酸1-737和976-1724， SEQIDNO:ll的核苷 酸1-525和777-1189， SEQ ID NO:13的核苷酸1-612和864-1810, SEQ ID NO:15的核苦酸1-754和994-1754， SEQ ID NO:16的核苷酸1-744和 996-1935， SEQ ID NO:17的核苦酸1-610和864-1806, SEQ IDNO:19的核苷 酸1-610和864-1785， SEQ IDNO:21的核苷酸1-1456和1710-1905, SEQ ID NO:23的核香酸1-625和891-1062, SEQ ID NO:25的核苷酸1-709和 963-1895， SEQ ID NO:27的核普酸1-520和786-1310, SEQIDNO:29的核 苷酸1-510和767-1259, SEQ ID NO:31的核苦酸1-473和712-2180, SEQ ID NO:33的核普酸1-468和707-1138, SEQ ID NO:35的核苷酸1-435和 674-1143， SEQ ID NO:37的核普酸1-473和712-1164， SEQIDNO:39的核 苷酸1-473和712-1164, SEQIDNO:41的核香酸1-473和712-2048， SEQ ID NO:43的核香酸1-473和712-2182, SEQ ID NO:45的核苷酸1-413和 651-804, SEQIDNO:47的核苷酸1-431和670-2605， SEQIDNO:49的核香 酸1-435和674-2136, SEQIDNO:51的核苷酸1-778和1015-1452， SEQ IDNO:53的核苷酸1-780和1017-1453， SEQ ID NO:55的核芬酸1-370和 609-800, SEQ ID NO:57的核苷酸1-29和267-420, SEQ ID NO:59的核香酸 1-1340和1578-1731， SEQ ID NO:61的核苷酸1-541和778-2225, SEQ ID NO:63的核香酸1-404和651-804， SEQ ID NO:65的核苦酸1-632， SEQ ID NO:67的核苦酸1-489和728-1107,和SEQ ID NO:69的核苷酸1-487和 708-2569的梭苷酸序列的部分或全部的核苷酸序列杂交的探针和引物。
本发明的探针可在检测感兴趣基因的已知方法，如northern印迹法、 southern印迹法、原位杂交法等中用作根据一般方法的探针。
可根据本说明书中公开的核苷酸序列，化学合成本发明的探针。探针 的制备方法是众所周知的，可根据例如"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.，，(Cold Spring Harbor Press (1989))和"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997))进行制备。
本发明的引物也可用作由两种或多种引物组成的引物套。
本发明的引物和引物套可在利用核酸扩增法，如PCR法、RT-PCR法、 实时PCR法、原位PCR法或LAMP法检测感兴趣基因的已知方法中用作 根据一般方法的引物和引物套。
可选择本发明的引物套，以使通过核酸扩增法可扩增出Msxl基因或 Msx2基因的核苷酸序列。核酸扩增法是众所周知的，核酸扩增法中引物对 的选择也是本领域技术人员可以理解的。例如，在PCR法中，可选择引物， 以4吏两个引物(引物对)中的一个与Msxl基因或Msx2基因双链DNA的正《连 配对，另一个引物与双链DNA的负链配对，由一个引物延伸的链可与另一 个引物配对。另外，在LAMP法(WO 00/28082)中，关于靶基因，从3，末端 一侧，限定了三个区域F3c、 F2c和Flc，,人5，末端一侧，限定了三个区i或 Bl、 B2和B3，通过使用这六个区域，可设计四种引物。
可根据本说明书中公开的核苷酸序列，化学合成本发明的引物。引物 的制备方法是众所周知的，可冲艮据例如"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.，，(Cold Spring Harbor Press (1989))和"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997))进行制备。
在本发明中，"Msxl基因，，是多巴胺能神经元增殖祖细胞存在的指标， 已知其存在于人、小鼠、大鼠、黑猩猩、狗、牛、鸡等中。已知"Msx2基 因"存在于人、小鼠、大鼠、黑猩猩、狗、牛、鸡、鹌鹑等中。公开各个序列的GenBank登录号如下。 Msxl基因
人NMJ)02448(SEQ ID NO: 1 (碱基序列)，SEQ ID NO:2 (氨基酸序列)， 下文中以相同的次序表示)，BC021285(SEQ ID NO:3， SEQ ID NO:4), M97676 (与NM—002448相同)和BC067353(SEQ ID NO:5， SEQ ID NO:6)
小鼠NM_010835(SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8), BC016426(SEQ ID NO:9， SEQ ID NO:10)， AF308572(SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:12)， X14759(SEQ ID NO:13， SEQ ID NO:14), AK078600(SEQ ID NO:15(碱基序 列))，AK077524(SEQIDNO:16(碱基序列))和X59251(与NM_010835相同)
大鼠NM—031059(SEQ ID NO:17， SEQ ID NO:18)和D83036(SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20)
黑猩猩XM—517087(SEQ ID NO:21 ， SEQ ID NO:22)
狗XM_545946(SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24)
牛NM—174798(SEQ ID NO:25， SEQ ID NO:26)和D30750(与 NM一174798相同)
鸡NM_205488(SEQ IDNO:27， SEQ IDNO:28), D10372(与NM一205488 相同)和M76985(SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30)
Msx2基因
人NM—002449(SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32), CR592938 (SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34), BC015509(SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36), D31771(SEQ ID NO:37， SEQ ID NO:38)， S75308(SEQ ID NO:39， SEQ ID NO:40)， S75361(SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42)， D89377(SEQ ID NO:43， SEQ ID NO:44), BT009814(SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:46), X69295(SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48)和D26145(SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50)
小鼠NM—013601(SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52)和X59252(SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54)
大鼠U12514(SEQ ID NO:55， SEQ ID NO:56)和NM_012982(SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58)
黑猩猩XM—523807(SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60)
狗NM—001003098(SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62)和AJ277753(SEQ ID NO:63， SEQ ID NO:64)牛XM—592489(SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66)
鸡NM—204559(SEQ ID NO:67， SEQ ID NO:68)和S64478(与 NM—204559相同)
鹌鹁M57611(SEQIDNO:69， SEQIDNO:70)
至于除上述动物外的动物(优选哺乳动物)，本领域技术人员可以基于已 知的全长Msxl基因或Msx2基因序列，详细列出其固有的Msxl基因或 Msx2基因序列。例如，通过基于人或小鼠Msxl基因或Msx2基因的同源 性检索，可检索并鉴定出动物的Msxl基因或Msx2基因。在同源性检索中， 可使用下文描述的BLAST等。
Msxl基因包括
编码人Msxl蛋白的多核香酸，所述蛋白由选自SEQIDNO:2、 SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的至少一个氨基酸序列组成；
编码小鼠Msxl蛋白的多核苷酸，所述蛋白由选自SEQIDNO:8、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14的至少一个氨基酸序列组成；编码大鼠Msxl蛋白的'多核苷酸，所述蛋白由选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20的至少一个氨基酸序列组成；
编码黑猩猩Msxl蛋白的多核苦酸，所述蛋白由SEQIDNO:22的氨基 酸序列组成；
编码狗Msxl蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQ ID NO:24的氨基酸序 列组成；
编码牛Msxl蛋白的多核香酸，所述蛋白由SEQIDNO:26的氨基酸序 列组成；和
编码鸡Msxl蛋白的多核苷酸，所述蛋白由选自SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30的至少一个氨基酸序列组成。
此外，Msxl基因包括
含有选自SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的至少一个人 Msxl基因DNA序列的多核苷酸；
含有选自SEQIDNO:7、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQ ID NO: 13、 SEQ IDNO:15和SEQ IDNO:16的至少一个小鼠Msxl基因DNA序列的多 核苷酸；含有选自SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 19的至少一个大鼠Msxl基因
DNA序列的多核香酸；
含有SEQIDNO:21的黑猩猩Msxl基因DNA序列的多核香酸； 含有SEQ ID NO:23的狗Msxl基因DNA序列的多核香酸； 含有SEQ ID NO:25的牛Msxl基因DNA序列的多核苷酸；和 含有选自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29的至少一个鸡Msxl基因
DNA序列的多核苷酸。 Msx2基因包括
编码人Msx2蛋白的多核苦酸，所述蛋白由选自SEQIDNO:32, SEQID NO:34， SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38， SEQ ID NO:40， SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:50的至少一个氨基 酸序列组成；
编码小鼠Msx2蛋白的多核苷酸，所述蛋白由选自SEQ ID NO: 52和SEQ IDNO:54的至少一个氨基酸序列组成；
编码大鼠Msx2蛋白的多核苦酸，所述蛋白由选自SEQ ID NO: 5 6和SEQ IDNO:58的至少一个氨基酸序列组成；
编码黑猩猩Msx2蛋白的多核香酸，所述蛋白由SEQ ID NO:60的氨基 酸序列组成；
编码狗Msx2蛋白的多核苦酸，所述蛋白由选自SEQIDNO:62和SEQ IDNO:64的至少一个氨基酸序列組成；
编码牛Msx2蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQIDNO:66的氨基酸序 列组成；
编码鸡Msx2蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQ ID NO:68的氨基酸序 列组成；和
编码鹌鸫Msx2蛋白的多核苦酸，所述蛋白由SEQ ID NO:70的氨基酸 序列组成。
此外，Msx2基因包括
含有选自SEQIDNO:31， SEQIDNO:33， SEQIDNO:35, SEQIDNO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43， SEQ ID NO:45， SEQ ID NO:47和SEQ IDNO:49的至少一个人Msx2基因DNA序列的多核芬酸；
含有选自SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:53的至少一个小鼠Msx2基因DNA序列的多核香酸；
含有选自SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:57的至少一个大鼠Msx2基因
DNA序列的多核苷酸；
含有SEQIDNO:59的黑猩猩Msx2基因DNA序列的多核苦酸； 含有选自SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:63的至少一个狗Msx2基因
DNA序列的多核苷酸；
含有SEQ ID NO:65的牛Msx2基因DNA序列的多核苷酸； 含有SEQIDNO:67的鸡Msx2基因DNA序列的多核苷酸；和 含有SEQIDNO:69的鹌鹁Msx2基因DNA序列的多核苷酸。 本发明的Msxl基因或Msx2基因包括编码与Msxl蛋白或Msx2蛋白
功能等同的蛋白质的基因。通过评价与Msx 1基因或Msx2基因的表达相关
的生物学现象或功能，例如，通过评价基因是否在多巴胺能神经元增殖祖
细胞中选择性表达，即可测定基因是否为"功能等同的"基因。
此外，当编码氨基酸序列(如SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID
NO:32的氨基酸序歹'J)的基因具有多态性时，与Msxl蛋白或Msx2蛋白功能
等同的蛋白质包括具有多态性的蛋白质。
编码与Msxl蛋白功能等同的蛋白质的基因包括
编码Msxl蛋白(例如SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:8的氨 基酸序列)经一个或多个氨基酸残基的插入、取代或缺失，或在氨基酸序列 的 一端或两端添加所得的氨基酸序列(经修饰的氨基酸序列)的基因；
在严紧条件下与编码Msxl蛋白氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2的氨基 酸序列和SEQIDNO:8的氨基酸序歹'〗)的基因杂交的基因；和
编码与Msxl蛋白氨基酸序歹'j(例如SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ IDNO:8的氨基酸序列)具有至少70%或更高同一性的氨基酸序列的基因。
此外，编码与Msx2蛋白功能等同的蛋白质的基因包括
编码Msx2蛋白(例如SEQ ID NO:32的氨基酸序列和SEQ ID NO:52的 氨基酸序列)经一个或多个氨基酸残基的插入、取代或缺失，或在氨基酸序 列的 一端或两端添加所得的氨基酸序列(经修饰的氨基酸序列)的基因；
在严紧条件下与编码Msx2蛋白氨基酸序列(例如SEQ ID NO:32的氨基 酸序列和SEQIDNO:52的氨基酸序列)的基因杂交的基因；和
编码与Msx2蛋白氨基酸序列(例如SEQ ID NO:32的氨基酸序列和SEQIDNO:52的氨基酸序列)具有至少70%或更高同 一性的氨基酸序列的基因。
在本说明书中，"经一个或多个氨基酸残基的插入、取代或缺失，或在 氨基酸序列的一端或两端添加"指的是通过众所周知的技术方法，如定点i秀 变或通过在自然产生的程度下取代多个氨基酸而进行的修饰。
Msxl蛋白或Msx2蛋白经修饰的氨基酸序列可以是如下所述的氨基酸 序列，其中1-30,优选1-20，更优选1-9,更优选1-5,特别优选1或2个 氨基酸被插入、取代或缺失，或在氨基酸序列的一端或两端净皮添加。优选 经修饰的氨基酸序列可以是在Msxl蛋白或Msx2蛋白的氨基酸序列中具有 一个或多个(优选一个或几个，或1,2,3或4个)保守取代的氨基酸序列。
术语"保守取代"指的是一个或多个氨基酸残基被其它化学类似氨基酸 残基所取代，但实质上不会改变蛋白质的活性。例如，某个疏水残基^L另 一个疏水残基取代的情形，某个极性残基被另 一个具有相同电荷的极性残 基取代的情形。对每个氨基酸而言，可按照此方式被取代的功能类似的氨 基酸是本领域已知的。具体例如非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、曱碌^氨酸。极性(中性) 氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半 胱氨酸。带正电(碱性)的氨基酸包括精氨酸、祖氨酸和赖氨酸。另外，带负 电(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在本说明书中，"杂交"指的是在严紧条件下与靶多核苷酸杂交。具体地 说，例如，当使用缺省参数(最初的设置)，用同源性检索软件，如FASTA, BLAST, Smith-Waterman [Meth. Enzym.， 164, 765 (1988)]进行计算时，与耙核 苷酸序列具有的同一性为至少70%或更高，优选80°/。或更高，更优选85% 或更高，更优选90%或更高，更优选95%或更高，特别优选98%或更高， 最优选99%或更高的多核苷酸。另外，"在严紧条件下"可根据本领域技术人 员通常使用的在杂交緩冲溶液中进行反应的方法来进行，以使温度为 40-70°C,优选为60-65°C,并在盐浓度为15-300 mmol/L，优选为15-60 mmol/L的漂洗溶液中进行洗涤。可根据所用探针的长度适当调整温度和盐 浓度。另外，洗涤杂交核苷酸的条件可以是0.2或2xSSC, 0.1%SDS,温度 为20-68°C。至于控制严紧条件(高严紧度)或温和条件(低严紧度)，洗涤时 的盐浓度或温度即可提供差异。当由盐浓度提供杂交差异时，可使用严紧 的洗涤緩冲液(高严紧度洗涤緩冲液)0.2xSSC和0.1。/。 SDS,以及温和的洗涤緩沖液(低严紧度洗涤緩冲液)2xSSC和0.1% SDS。另外，当由温度提供 杂交差异时，严紧条件下的温度为68。C,中度严紧条件下的温度为42°C， 温和条件下的温度为室温(20-25。C)，每种情形都可在0.2xSSC和0.1% SDS 中进行。
一般说来，在与杂交相同的条件下进行预杂交。然而，不局限于在相 同条件下进行杂交和初步洗涤。
可根据已知方法进行杂交。另外，在使用商购的文库时，可根据所附 使用说明中描述的方法进行杂交。
在本说明书中，与氨基酸序列有关的术语"同一性"(有时也称之为同源 性)指的是在被比较的序列之间，各个序列的氨基酸残基的同一性水平。此 时，要考虑缺口的存在和氨基酸的特性(Wilbur， Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730(1993))。为了计算同源性，可使用BLAST(Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990》、FASTA (Peas應Methods in Enzymiology 183:63-69 (1990))等。
与Msxl蛋白或Msx2蛋白氨基酸序列的同 一性至少为70%或更高的氨 基酸序列可以是同一性优选为80%或更高，更优选为85%或更高，更优选 为90%或更高，更优选为95%或更高，特别优选为98%或更高，最优选为 99%或更高的氨基酸序列。
"同 一性，，可以是使用本领域技术人员已知的同源性检索程序计算出的 !K直,通过例长口4吏用NCBI (National Center for Biotechnology Information)的 同源性算法BLAST(Basic local alignment search tool) http:www.ncbi.nhTL nih.gov/BLAST/中的缺省参数(最初的设置)即可计算同一性。
本发明的抗体可特异性识别Msxl蛋白或Msx2蛋白。如上所述，Msxl 基因或Msx2基因的表达可用作多巴胺能神经元增殖祖细胞的指标。因此， 本发明的抗体可用作检测多巴胺能神经元增殖祖细胞的标记物。
用于获得本发明抗体的Msxl蛋白或Msx2蛋白可具有Msxl或Msx2 的抗原性，其包括在Msxl蛋白或Msx2蛋白氨基酸序列中进行一个或多个 氨基酸残基的缺失、插入、取代或添加所得的蛋白质。已知在这种蛋白质 中，会维持与原始蛋白质相同的生物活性(Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-6; Zoller and Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-500;Wang et al. (1984) Science 224:1431-3; and Dalbadie隱McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409-13)。缺失、插入、取代或添加一个或多个 氨基酸残基，而能在蛋白质中维持原始蛋白质的抗原性的方法是已知的。 例如，编码突变蛋白质的多核苷酸可通过定点诱变的方法来制备，并能被 适当表达(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989)， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997); Sections 8.1-8.5; Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152:271-5; Kinkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 82:488-92; Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol. 154:350-67; and Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85:2763-6)。
本发明的抗体包括特异于Msxl蛋白或Msx2蛋白的一部分的抗体。具 体地说，用于获得本发明抗体的Msxl蛋白或Msx2蛋白包括具有Msxl蛋 白或Msx2蛋白的至少6个或更多个氨基酸残基(例如6, 8， 10, 12或15个或 更多个氨基酸残基)的多肽片段，以及具有全长氨基酸序列的多肽。本说明 书中Msxl蛋白或Msx2蛋白的多肽片段包括每一个片段，只要该片段具有 Msxl蛋白或Msx2蛋白的抗原性即可。
优选的片段包括多肽片段，例如Msx 1蛋白或Msx2蛋白的氨基末端或 羧基末端。通过分析蛋白质氨基酸序列的疏水性/亲水性的方法 (Kyte-Doolittle(1982) J. Mol. Biol. 157:105-22)，或分析二级结构的方法 (Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:251-76)估计多肽的抗原决定蔟 位点，再通过计算机程序(Anal, Biochem. 151:540-6 (1985))或合成短肽并证 实抗原性的^支术，如PEPSCAN法(日本专利特许公开号60-500684)进一步 证实该位点。
抗Msxl蛋白的抗体包括
抗具有选自SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的至少一个氨 基酸序列的蛋白质或其部分的抗体；
抗具有选自SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:IO、 SEQ ID NO:12和SEQ ID NO: 14的至少 一个氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体；
抗具有选自SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO:20的至少一个氨基酸序列的 蛋白质或其部分的抗体；
抗具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体；抗具有SEQ IDNO:24的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体； 抗具有SEQIDNO:26的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体；和 抗具有选自SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30的至少一个氨基酸序列的 蛋白质或其部分的抗体。
抗Msx2蛋白的抗体包括
抗具有选自SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36， SEQ ID NO:38， SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42， SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46， SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:50的至少一个氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗 体；
抗具有选自SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:54的至少一个氨基酸序列的 蛋白质或其部分的抗体;
抗具有选自SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:58的至少一个氨基酸序列的 蛋白质或其部分的抗体；
抗具有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体； 抗具有选自SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的至少一个氨基酸序列的 蛋白质或其部分的抗体；
抗具有SEQIDNO:66的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体； 抗具有SEQIDNO:68的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体；和 抗具有SEQ IDNO:70的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体。 本发明抗体的优选实施方案提供了可识别Msxl蛋白或Msx2蛋白的高 辨别多肽部分的抗体。使用该抗体，可以较高的准确度检测到增殖祖细胞。 所述抗体包括抗Msxl蛋白的高辨别多肽部分的抗体，所述多肽部分例如可 为选自SEQ ID NO:2的氨基酸1-143和242-297， SEQ ID NO:4的氨基酸 1-216和315-370, SEQ ID NO:6的氨基酸1-143和242-297， SEQ ID NO:8 的氨基酸1-149和248-299, SEQ IDNO:IO的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:12的氨基酸1-149和248-303, SEQ ID NO:14的氨基酸1-143和 242-323, SEQIDNO:18的氨基酸1-143和242-297， SEQ IDNO:20的氨基 酸1-143和242-297, SEQ ID NO:22的氨基酸1-472和571-634, SEQ ID NO:24 的氨基酸1-208和298-353, SEQIDNO:26的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:28的氨基酸1-138和237-288，和SEQ ID NO:30的氨基酸1-100和 199-242的至少6个氨基酸残基或全部氨基酸序列。此外，能以较高的准确度检测增殖祖细胞的抗体包括抗Msx2蛋白的高辨别多肽部分的抗体，所述
多肽部分例如可为选自SEQ ID NO:32的氨基酸1-120和218-267, SEQ ID NO:34的氨基酸1-120和218-268， SEQ ID NO:36的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:38的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:40的氨基酸1-120 和219-267， SEQ ID NO:42的氨基酸1-120和219-267, SEQIDNO:44的氨 基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:46的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:48的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:50的氨基酸1-119和218-266, SEQ ID NO:52的氨基酸1-121和220-268, SEQ ID NO:54的氨基酸1-121 和220-269, SEQ ID NO:56的氨基酸1-9和99-139, SEQ ID NO:58的氨基 酸1-9和99-139, SEQ IDNO:60的氨基酸1-466和527-576, SEQ IDNO:62 的氨基酸1-120和219-267, SEQIDNO:64的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:66的氨基酸1-120, SEQ ID NO:68的氨基酸1-112和211-259，和SEQ ID NO:70的氨基酸1-112和211-259的至少6个氨基酸残基或全部氨基酸序 列。
Studies Hybridoma Bank。
通过使用本领域技术人员众所周知的方法，例如"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987) and Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988),也 可获得本发明的抗体。
本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体 (scFv)、人源化抗体、多特异性抗体和抗体片段，如Fab, Fab'， F(ab，)2, Fc和 Fv。
对于多克隆抗体而言，抽取经过抗原致敏的哺乳动物的血液，通过已 知方法从血液中分离出血清，用作含有多克隆抗体的血清。
根据需要，也可以进一步分离含有多克隆抗体的级分。
对单克隆抗体而言，提取从经过上述抗原致敏的哺乳动物的脾脏或淋 巴结中获得的能产生抗体的细胞，并将所述细胞与骨髓瘤细胞融合。对所 得杂交瘤进行克隆，从培养物中收集抗体以用作单克隆抗体。
可将Msxl蛋白或Msx2蛋白的片段用作免疫抗原。或者，可使用基于 上述氨基酸序列合成的抗原。抗原可以以与载体蛋白形成复合物的形式来使用。为了制备抗原与载体蛋白的复合物，可使用多种凝聚剂(condensation), 如戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺-活化的酯等。载体蛋白可以是常用的那 些，如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白等， 一般以l-5倍量进行连接。
被免疫的动物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。注射方法包括皮下、 肌肉或腹膜内给药。给药时，抗原可与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂混 合。 一般每2-5周给药一次。
将得自经免疫动物的脾脏或淋巴结的能产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞 进行细胞融合，并分离杂交瘤。可使用得自小鼠、大鼠或人的骨髓瘤细胞， 优选其与产生抗体的细胞源自相同物种，但源自不同物种的细胞有时也是
可以的。
可根据先前已知的方法，例如Nature, 256,495, 1975中公开的方法进行 细胞融合。
融合促进剂包括聚乙二醇或仙台病毒，通常，在20-40°C，优选30-37。C， 使用浓度约为20-50%的聚乙二醇(平均分子量为1000-4000),反应约1-10 分钟，使抗体生成细胞的数目与骨髓瘤细胞的数目之比大致约为1:1-10:1， 以进行细胞融合。
为了筛选产生抗体的杂交瘤，可使用多种免疫化学方法。例如，使用 包被Msxl蛋白或Msx2蛋白的微滴板进行ELISA法，使用包被抗-免疫球 蛋白抗体的微滴板进行EIA法，以及将含Msxl蛋白或Msx2蛋白的样品电 泳之后使用硝酸纤维素转移膜进行免疫印迹法。
通过例如有限稀释法从所述孔中进行进一步克隆，籍此获得克隆。一 般在添加了 HAT(次黄。票呤、氨基蝶呤和胸苷)的含有10-20%牛胚胎血清的 动物细胞培养基(例如RPMI1640)中进行杂交瘤的选择和培养。将按上述方 法获得的克隆移植到预先施用过pristine的SCID小鼠的腹腔中，10-14天后， 收集含有高浓度单克隆抗体的腹水液以用作纯化抗体的材料。另外，培养 克隆，培养物也可以是纯化抗体的材料。
为了纯化单克隆抗体，可使用先前已知的纯化免疫球蛋白的方法，通 过例如硫酸铵分级分离法、PEG分级分离法、乙醇分级分离法、使用阴离 子交换剂、使用了 Msxl蛋白或Msx2蛋白的亲和层析等可以容易地进行纯 化。可按类似方法，从血清中纯化多克隆抗体。 [冲全测方法]
Msxl基因或Msx2基因的表达可用作多巴胺能神经元增殖祖细胞存在 的指标。因此，根据本发明，通过检测Msxl基因或Msx2基因的表达，即 可检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。
对本文所用的"4全测Msxl基因或Msx2基因表达"的方法没有特别的限 制，只要它能检测待测试细胞样品中的Msxl基因或Msx2基因表达即可， 例如，所述方法包括杂交法、核酸扩增法和抗原-抗体反应法。
本文所用的"待测试细胞样品，，可以是据认为含有多巴胺能神经元增殖 祖细胞的细胞样品，可以使用中脑腹侧区域的细胞。通过已知方法可获得 中脑腹侧区域的细胞(Studer, L., et al. Nature Neurosci (1998) 1:290-295)。优 选将胎儿(优选人流产胎儿)或患者本人中脑腹侧区域的细胞用作待测试细 胞样品。另外，可将培养物细胞用作待测试细胞样品，所述培养物细胞中 含有在体外能被诱导分化的多巴胺能神经元增殖祖细胞。通过将已知的ES
细月包(Kawasaki et al. Neuron (2000) 28(1):31-40 and Lee, SH.， et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)、骨髓基质细胞、得自神经的无限增殖化细胞系 (曰本专利特许公开号8-509215, 11-506930和2002-522070)、神经元原基细 胞(日本专利特许公开号11-509729)等用作起始材料，用已知方法进行分化 处理即可体外诱导其向多巴胺能神经元增殖祖细胞分化，所述方法如SDIA 法(Kawasaki et al. Neuron (2000) 28(1):31-40)或5-阶4殳法(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。优选将用SDIA法进行分化处理的ES细 胞用作待检测细胞样 品。
通过在无血清培养基中共培养ES细胞和基质细胞系PA6来进行本文所 用的"SDIA法，，(Kawasakietal. Neuron (2000) 28(1):31-40)。另外，可按下述 进行"5-阶段法"。在存在血清时，在非-贴壁的培养板上培养ES细月包，籍此 形成胚状体(embryoid body, EB),随后，将EB粘附在贴壁培养板上，籍此 选择神经元祖细胞。最后，在其中加入生长因子，如Shh、 FGF2或FGF8， 从而诱导多巴胺能神经元祖细胞(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。
根据本发明检测方法的第 一 个实施方案，本发明的探针与核酸样品 (mRNA或其转录物)杂交，检测杂交复合物，即核苷酸双链。因此，可检测细胞样品中的Msxl基因或Msx2基因表达。
关于杂交方法的详细程序，可参考"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.，，(Cold Spring Harbor Press (1989),特别是第9.47-9.58节， "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997》，特 别是第6.3和6.4节，"DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed." (Oxford University (1995),特别是与条件有关的第2.10节)。
可通过例如下述步骤，利用杂交法检测Msxl基因或Msx2基因的表达
(a) 使得自待测试细胞样品的多核苷酸与本发明的多核苷酸探针接触；
和
(b) 检测杂交复合物。
在步骤(a)中，可将由据认为含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的待测试 细胞样品制备的mRNA,或由该mRNA转录的互补DNA(cDNA)用作得自 待测试细胞样品的多核苷酸，进而与探针接触。
在使用探针的检测方法中，可标记探针。标记物包括利用放射性(如"P, 14C和35S)、荧光(如FITC、铕)、酶(如过氧化物酶或碱性磷酸酶)反应，如 化学显色等的标记物。
4吏用众所周知的方法，如northern杂交、southern杂交或集落杂交即可
进行杂交产物的检测。
检测到其中的杂交复合物的细胞是表达Msxl基因或Msx2基因的细 胞，因此，可被测定为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
根据本发明检测方法的第二个实施方案，通过使用本发明的引物或引 物对的核酸扩增法扩增核酸样品(mRNA或其转录物)，并检测扩增产物，即 可检测到细胞样品中的Msxl基因或Msx2基因表达。
通过例如下述步骤，可利用核酸扩增法检测Msxl基因或Msx2基因的 表达
(c) 使用得自待测试细胞样品的多核苷酸作为模板，并使用本发明的多 核苷酸引物或多核苷酸引物对进行核酸扩增法；和
(d) 检测所形成的扩增产物。
在步骤(c)中，可将由据认为含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的待测试 细胞样品制备的mRNA,或由该mRNA转录的互补DNA(cDNA)用作模板。 使用核酸扩增法，如PCR法、RT-PCR法、实时PCR法或LAMP法可进行扩增产物的检测。
检测到其中的扩增产物的细胞也表达Msx 1基因或Msx2基因，因此，
可被测定为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
根据本发明检测方法的第三个实施方案，使本发明的抗体与细胞样品
接触，检测抗原-抗体反应。因此，可检测到细胞样品中的Msxl基因或Msx2 基因表达。
通过例如下述步骤，可利用抗原-抗体反应检测Msxl基因或Msx2基因 的表达
(e) 使得自待测试细胞样品的蛋白质与本发明的抗体接触；和
(f) 测定抗原-抗体复合物。
检测抗原-抗体反应的方法是本领域技术人员众所周知的，例如，可通 过免疫学方法，在据认为含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的待测试细胞样 品中检测Msxl蛋白或Msx2蛋白。关于免疫学方法，可对根据需要经适当 处理，如细胞的分离或提取操作的细胞样品使用先前已知的方法，如免疫 组织染色法、酶联免疫吸附测定法、western印迹法、凝集法、竟争法或夹 心法。可通过例如使用经标记抗体的直接法，或使用经标记的抗抗体之抗 体的间接法来进行免疫组织染色法。关于标记试剂，可使用已知的标记物 质，如荧光物质、放射性物质、酶、金属或色素。
检测到其中的抗原-抗体复合物的细胞是表达Msx 1基因或Msx2基因的 细胞，因此，可被测定为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
为了用于治疗帕金森氏病，多巴胺能神经元增殖祖细胞的纯度较高才 是合乎需要的。
通过将上述检测步骤中的每一步重复多次，而不是一次，即可增强检 测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的准确度。
因此，根据本发明的检测方法，通过将上述步骤进行两次或多次，即 可以高准确度;f佥测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。
另外，通过同时使用其它标记基因，优选除Msxl基因和Msx2基因以 外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因，也可增强^f企测或选择多巴胺能 神经元增殖祖细胞的准确度。
因此，根据本发明的检测方法，通过同时使用除Msxl基因和Msx2基 因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因以及有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞标记基因等，并同时检测Msxl基因或Msx2基因的表达以及 上述其它标记基因的表达，也可以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经
元增歹i^且细〗包。
图1显示了在各个分化阶段选择性表达的与多巴胺能神经元相关的标 记基因。
在特征在于检测Msxl基因或Msx2基因表达的检测方法中，通过同时 使用除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基 因，同时检测Msxl基因或Msx2基因以及除Msxl基因和Msx2基因以外 的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因，即可以高准确度检测或选择多巴 胺能神经元增殖祖细胞。
具体地说，在步骤(a)、步骤(c)或步骤(e)中，通过将其中的除Msxl基 因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因的表达需被检 测的细胞用作待测试细胞样品，即可以高准确度检测或选择多巴胺能神经 元增殖祖细胞。此时，在步骤(b)中被检测杂交复合物的细胞，在步骤(d)中 被检测扩增产物的细胞，在步骤(f)中被检测抗原-抗体复合物的细胞各自表 达Msxl基因或Msx2基因和除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神 经元增殖祖细胞标记基因。因此，可以高准确度将细胞测定为被检测或选 择的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
另外，关于在步骤(b)中被检测杂交复合物的细胞，在步骤(d)中被检测 扩增产物的细胞，以及在步骤(f)中被检测抗原-抗体复合物的细胞，分别进 行检测除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基 因表达的步骤(g-l)，即可以高准确度检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细 胞。此时，在步骤(g-l)中，其中的除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺 能神经元增殖祖细胞标记基因的表达需被检测的细胞是表达Msxl基因或 Msx2基因，以及除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖 细胞标记基因的细胞。因此，可以高准确度将细胞测定为被检测或选择的 多巴胺能神经元增殖祖细胞。
在特征在于检测Msxl基因或Msx2基因表达的检测方法中，通过同时 使用有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因，可以证实表达了 Msxl基因或Msx2基因，但未检测到有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细 胞标记基因的表达。因此，可以高准确度检测或选择多巴胺能神经元增殖前体细胞。
具体地说，在步骤(a)、步骤(c)或步骤(e)中，通过使用未^^测到其有丝
分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因表达的细胞，即可以高准确度
检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。此时，在步骤(b)中被检测杂交复 合物的细胞，在步骤(d)中被检测扩增产物的细胞，在步骤(f)中被检测抗原-抗体复合物的细胞各自表达Msxl基因或Msx2基因，但不表达有丝分裂后 的多巴胺能神经元前体细胞标记基因。因此，可以高准确度将细胞测定为 被才企测或选4奪的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
另外，关于在步骤(b)中被检测杂交复合物的细胞，在步骤(d)中被检测 扩增产物的细胞，以及在步骤(f)中被;险测抗原-抗体复合物的细胞，分别进 行检测有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因表达的步骤(g-2), 即可以高准确度检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。此时，在步骤(g-2) 中，其中的有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因的表达未被检 测到的细胞是表达Msxl基因或Msx2基因，但不表达有丝分裂后的多巴胺 能神经元前体细胞标记基因的细胞。因此，可以高准确度将细胞测定为被 检测或选择的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
"除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基 因"包括在中脑最腹侧脑室区域(VZ区)表达的、除Msxl基因和Msx2基因 以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因，其包括Lrp4基因、Nato3基 因和Mashl基因。
Lrp4基因描述于WO 2004/065599。 Mashl基因描述于Kele J, Simplicio N, Ferri AL, Mira H, Guillemot F， Arenas E， Ang SL. Neurogenin 2 is required for the development of ventral midbrain dopaminergic neurons , 以及 Development. 2006 Feb; 133(3):495-505。本发明人已证实Nato3基因在多巴 胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达(数据未显示)。
对除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基 因的检测没有限制，只要使用可^r测已知基因表达的方法即可，例如，所 述方法包括上述的杂交法、核酸扩增法和抗原-抗体反应法。
"有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因，，包括在中脑最腹侧 套层(ML区)表达的基因，其包括Nurrl基因、Enl基因、En2基因、Ptx3 基因和TH基因。另外，标记基因包括在中脑最腹侧脑室区(VZ区)表达的基因，其包括65B13基因。
Nurrl基因描述于Science. 1997 11; 276(5310):248-50。 Enl基因描述于 J. Neu薩i. 2001 21(9): 3126-34。 En2基因描述于J. Ne画ci. 2001 21(9) 3126-34。 Ptx3基因描述于Proc.Natl.Acad.Sci. 1997 94: 13305-10。 TH基因 描述于Science 1997 11; 276(5310):248-50。 65B13基因描述于WO 2004/ 038018。
对有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因的检测没有特别的 限制，只要使用可检测已知基因表达的方法即可，例如，所述方法包括上 述的杂交法、核酸扩增法和抗原-抗体反应法。
本发明的检测方法可用于筛选物质，所述物质能有效诱导生成多巴胺 能神经元增殖祖细胞的分化过程。具体地说，通过使用Msxl基因或Msx2 基因的表达为指标，测定待测试的物质的添加是否能诱导生成多巴胺能神 经元增殖祖细胞的分化过程，即可筛选出能有效诱导生成多巴胺能神经元 增殖祖细胞的分化过程的物质。
因此，本发明提供了筛选物质的方法，所述物质能有效诱导生成多巴 胺能神经元增殖祖细胞的分化过程，所述方法包括下述步骤(i) 使能分化成多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞与待测试的物质接
触；和
(ii) 检测与待测试物质接触的细胞中的Msxl基因或Msx2基因表达。 步骤(i)中可分化成多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞优选收集自胚胎
中脑腹侧区域，或收集自含有由ES细胞诱导分化的神经元祖细胞的培养物 细胞。
通过例如在含有能分化成多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞的培养物 细胞中加入待测试物质，即可进行步骤(i)中的"与待测试物质接触"。
"待测试物质"包括合成的低分子量化合物、蛋白质、合成的肽、纯化或 部分纯化的多肽、抗体、细菌-释放物质(含有细菌代谢产物)和核酸(如反义 核酸、核酶和RNAi)，优选为化合物或其盐，或其溶剂化物(如水合物)，但 并不局限于此。"待测试物质"可以是新物质或已知物质。
在步骤(ii)中，根据本发明的检测方法，可检测到Msxl基因或Msx2基 因的表达。
具体地说，进行步骤(a)和(b)以利用杂交法进行检测。进行步骤(c)和(d) 以利用核酸扩增法进行检测。进行步骤(e)和(f)以利用抗原-抗体反应进行检 测。因此，可检测到Msxl基因和Msx2基因的表达。
在步骤(ii)中，当通过与待测试物质接触检测到细胞样品中的Msxl基 因和Msx2基因表达时，可将该物质测定为能有效诱导生成多巴胺能神经元 增殖祖细胞的分化过程的物质。
通过本发明的筛选方法筛选出的物质可用作能有效诱导生成多巴胺能 神经元增殖祖细胞的分化过程的物质。
本发明提供了筛选物质的方法，所述物质能有效诱导生成多巴胺能神 经元增殖祖细胞的分化过程，所述方法还包括下述步骤
(iii) 检测除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞 标记基因的表达。
当在步骤(ii)中检测到Msxl基因或Msx2基因的表达，在步骤(iii)中检 测到除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因 的表达时，可以高准确度将物质测定为能有效诱导生成多巴胺能神经元增 殖祖细胞的分化过程的物质。
步骤(iii)可在步骤(i)之后进行，可在步骤(ii)之前或之后进行。"除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基 因"包括在中脑最腹侧脑室区域(VZ区)表达的、除Msxl基因和Msx2基因 以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因，其包括例如Lrp4基因、Nato3 基因和Mashl基因。
对除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基 因的检测没有特別的限制，只要使用可检测已知基因表达的方法即可，例 如，所述方法包括上述的杂交法、核酸扩增法和抗原-抗体反应法。
本发明的检测方法可^r测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。多巴胺 能神经元增殖祖细胞可用于治疗帕金森氏病。因此，可使用Msxl基因或 Msx2基因的表达为指标，由被检测或选择的多巴胺能神经元增殖祖细胞制 备可用于治疗帕金森氏病的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
本发明提供了制备多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，所述方法包括 下述步骤
(iv) 获得含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞；
(v) 使用本发明的检测方法检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞；和
(vi) 培养步骤(v)中检测或选择的细胞。
本发明提供了治疗帕金森氏病的方法，所述方法包括将通过本发明的 检测方法检测或选择的多巴胺能神经元增殖祖细胞，或通过本发明的制备 方法产生的多巴胺能神经元增殖祖细胞移植到包括人的哺乳动物体内的步骤。
根据本发明的治疗方法，移植的多巴胺能神经元增殖祖细胞能产生多 巴胺，因此，可预防和/或治疗帕金森氏病。
当进行本发明的治疗方法时，可能含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的 细胞可收集自哺乳动物，包括人，优选收集自接受移植的个体或流产胎儿。
多巴胺能神经元增殖祖细胞可^:移植到脑，优选移植到中脑。
在本说明书中，"检测"包括"区分"。
实施例
下文将通过实施例具体解释本发明，但下文的实施例不会限制本发明 的范围。[实施例11 Msxl基因和Msx2基因的表达分析 (1)通过RT-PCR法进行分析
为了证实Msxl基因和Msx2基因在多巴胺能神经元系的细胞中表达， 根据下述方法，通过RT-PCR法研究Msxl， Msx2， DAT, Lmxla和Lrp4的 mRNA在小鼠胚胎中脑各个区域中的表达。此处，DAT是多巴胺能神经元 的标记基因(Development. 2004; 131(5):1145-55.)， Lmxla是多巴胺能神经元 和多巴胺能神经元前体细胞的标记基因(W02005/052190), Lrp4是多巴胺能 神经元增殖祖细胞的标记基因(W02004/065599)。
从12.5日龄小鼠(得自SLC)胚胎中切下图2所示的中脑的4个区域(V 区最腹侧区域，VL区:.腹侧区域，DL区背侧区域，和D区:最背侧 区域)，使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)制备总RNA,使用cDNA合成试剂 盒(TAKARA)合成双链cDNA。接着，用限制性酶Rsal (TAKARA)消化合成 的cDNA,然后在其中加入ad2,使用ad2S为引物进行PCR，籍此扩增出 cDNA并用作RT-PCR的模板。在下述条件下进行扩增72。C保温5分钟， 然后于94。C反应30秒，65。C反应30秒，72°C反应2分钟，共15个循环， 最后，于72。C保温2分钟。
ad2S: cagctccacaacctacatcattccgt (SEQ ID N0:71)
ad2A: acggaatgatgt (SEQ ID NO:72)
接着，使用与4ng、 0.4ng和0.04ng经扩增的cDNA相当的cDNA为模 板，在下述反应体系中进行PCR。10xExTaq 1 fil
2.5 mM dNTP 0.8 jal
ExTaq 0.05 |il
100pM引物 各为0.1(il cDNA 1 pl
蒸馏水 6.95 pi
94。C保温2分钟之后，94。C30秒，65。C30秒，72。C2分钟以进行扩 增反应，最后，于72。C保温2分钟。对Lrp4, DAT和Lmxla进行26个PCR 扩增循环，对Msxl进行32个PCR扩增循环，对Msx2进行27个PCR扩 增循环。
PCR中使用了下列引物。Lrp4: tagtctaccactgctcgactgtaacg (SEQ ID NO:73)
cagagtgaacccagtggacatatctg (SEQ ID NO:74)
DAT: cagaatcctgtgctcacggtagttgc (SEQ ID NO: 75)
actaaagtggctgcaagctgaccagg (SEQ ID NO:76)
Lmxla:tggttcaggtgtggttccagaaccag (SEQ ID NO:77)
tctgaggttgccaggaagcagtctcc (SEQ ID NO:78)
Msxl: tagcctacatgggcggtgtagagtcc (SEQ ID NO:79)
caccgagacccaggtgaagatgatgg (SEQ ID NO:80)
Msa2: atatccaaccggcgtggcatagagtc (SEQ ID NO:81)
tggttccagaaccgaagggctaaggc (SEQ ID NO: 82) 结果，揭示出Msxl基因和Msx2基因的mRNA在中脑的V区和D区 中选择性表达，在所述区域中，多巴胺能神经元和多巴胺能神经元前体细 胞的标记基因被表达(图3)。
(2)通过原位杂交进行分析
另外，为了详细研究表达模式，根据下述方法，通过原位杂交进行Msxl 、 Nurrl和酪氨酸羟化酶(TH) mRNA的表达分析。Nurrl和TH是标记基因， 已知它们在多巴胺能神经元前体细胞中，能在有丝分裂后最先被诱导表达 (Science. 1997 11; 276(5310):248-50.)。
首先，通过下述方法产生DIG-探针。
从12.5日龄小鼠(得自SLC)胚胎中切下中脑后脑区域，使用RNeasy微 型试剂盒(Qiagen)制备总RNA，使用cDNA合成试剂盒(TAKARA)合成双链 cDNA。使用合成的cDNA为模板，扩增Msxl、 Nurrl和TH的cDNA。
10xExTaq 5 )al
2.5 mM dNTP 4 jixl
ExTaq 0.25 pi
100)iM引物 各为0.5pl
cDNA 1 pi
蒸馏水 38.75 |il
在下述条件下进行扩增94°C保温5分钟，然后于94。C反应30秒， 65。C反应30秒，72。C反应2分钟，共35个循环，最后，于72。C保温2 分钟。PCR中使用了下列引物。
Msxl: gccttcggcctctcttttcctcttgg (SEQ ID NO:83) ttcaaaagggatgcttgagagccacg (SEQ ID NO:84) TH:
gctgtcacgtccccaaggttcattgg (SEQ ID NO: 8 5) ggagcgcatgcagtagtaagatgtgg (SEQ ID NO:86) Nurrl: catatgatcgagcagaggaagacacc (SEQ ID NO:87) agtgcgaacaccgtagtgctgacagg (SEQ ID NO:88) 将扩增的cDNA片段克隆至pCRII (Invitrogen)并用作模板，从而通过下 述反应体系合成DIG-探针(所有试剂皆购自Roche)。 RNA聚合酶緩冲液 2)^1 NTP标记混合物 2jil Rnase^中制剂 1 |il
RNA聚合酶(T7或SP6) 2 模板DNA 1吗
蒸馏水 总量为20 pi
37。C放置2小时之后，于37°C用DNasel (Roche)处理15分钟，通过 乙醇沉淀收集DIG-RNA探针。
接着，取出11.5日龄的小鼠胚胎，于4。C使用4%PFA(WAKO)/PBS(-) 固定2小时，然后，于4。C,替换成20。/。蔗糖(WAKO)/PBS (-)溶液放置过夜， 用OCT (Sakura Seiki Co.， Ltd.)包埋胚胎。制备12 pm厚的切片，在载玻片 上干燥，然后于室温使用4。/。PFA再固定30分钟。用PBS洗涤之后，于68。C 杂交(lpg/ml DIG-RNA探针，50%曱酰胺(Nacalai Tesque， Inc.), 5xSSC, 1% SDS, 50吗/ml酵母RNA(Sigma)， 50jag/ml肝素)40小时。然后于68。C进行 洗涤(50%甲酰胺，5xSSC和1°/。SDS),于68。C再次进4亍洗涤(50%甲酰胺， 5xSSC)。室温用lxTBST洗涤，然后进行封闭(封闭剂Roche)。于4。C将 经碱性磷酸酶-标记的抗-DIG抗体(DAKO)反应过夜，洗涤(lxTBST, 2mM 左旋。米唑)之后，将NBT/BCIP (DAKO)用作生色底物。
结果表明在处于生成多巴胺能神经元阶段的11.5日龄小鼠胚胎中， Msxl的mRNA按照与TH和Nurrl的mRNA相同的方式在V区强表达(图 4)。另外，TH和Nurrl的mRNA仅在存在有丝分裂后的神经元的套层(ML) 区表达，与之形成对照的是，Msxl的mRNA不在ML区表达，而仅在存在增殖祖细胞的脑室区(VZ)表达(图4)。上述结果揭示出Msxl的mRNA在多 巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性地表达。
Msxl蛋白和Msx2蛋白的表达分析
才妄着，通过4吏用才元-Msxl/2 ^元体(Developmental Studies Hybridoma Bank (http:〃www.uiowa.edu/ dshbwww/))研究Msx 1/2蛋白的表达。另夕卜，通过l吏 用抗-Lmxla抗体进4亍双染色。
取出11.5日龄的小鼠胚胎，于4。C使用4Q/oPFA(WAKO)/PBS(-)固定2 小时，然后，于4。C，替换成20。/。蔗糖(WAKO)/PBS (-)溶液放置过夜，用 OCT(SakuraSeikiCo.，Ltd.)包埋胚胎。制备12pm厚的切片，固定在载玻片 上，室温干燥30分钟，然后再用PBS(-)润湿。接着，于室温封闭(BIockase (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.))30分钟，然后，室温与第一抗体 (Developmental Studies Hybridoma Bank)反应1小时，随后，于4。C反应过 夜。室温使用0.1。/。吐温-20/PBS(-)洗涤15分钟，共3次。接着，室温使经 荧光-标记的第二抗体(Jackson)反应1小时，按相同的方式进4亍洗涤，然后 于室温用PBS(-)洗涤IO分钟，并密封。
结果表明Msxl/2在11.5日龄小鼠胚胎的中脑中被表达成蛋白质以及 mRNA(图5)。抗-Lmxla抗体的双染色结果表明Msxl/2蛋白与Lmxla蛋 白共表达在VZ区的相同细胞中，因此揭示出在背腹侧方向，表达区域彼 此完全对应(图5)。
另外，当根据上述方法研究与Msxl/2蛋白表达有关的中枢神经系统区 域特异性时，得出以下结果Msxl/2蛋白在产生多巴胺能神经元的中脑腹 侧区，特别是VZ区选择性地表达(图6)。
Msxl基因和Msx2基因在由ES细胞诱导分化的多巴胺能神 经元中的表达
本实施例研究了当ES细胞被诱导分化成多巴胺能神经元时，Msxl基 因和Msx2基因是否表达。
首先，根据SDIA法(Kawasaki et al. Neuron. 2000 28(1):31-40.)， ES细胞 (小鼠CCE品系，由Riken CDB的Mr. Nishikawa才是供，Kawasaki et al. Neuron. 2000 28(1):31-40.)被诱导分化成多巴胺能神经元。诱导4, 6, 8， 10, 12天后收 集细胞。使用Rneasy微型试剂盒(Qiagen)制备总KNA,进行RT-PCR。首先， 对于1吗总RNA，使用RNA PCR试剂盒(TAKARA)进行cDNA合成。使用相当于10ng, 1 ng和O.l ng的cDNA为模板，在下述反应体系中进行PCR。 10xExTaq 2 jil
2.5mMdNTP 1.6 |il
ExTaq 0.1 |il
100pM引物 各为0.2pl cDNA 1 pi
蒸馏水 14.9 pi
94。C保温2分钟，然后于94。C反应30秒，65。C反应30秒，72。C反 应2分钟，共35个循环，最后，于72。C保温2分钟。 PCR中使用了下列引物。
TH:
gttcccaaggaaagtgtcagagttgg (SEQ ID NO:89) gaagctggaaagcctccaggtgttcc (SEQ ID NO:90) DAT: ctccgagcagacaccatgaccttagc (SEQ ID NO:91) aggagtagggcttgtctcccaacctg (SEQ ID NO:92) Nurrl: cactcctgtgtctagctgccagatgc (SEQ ID NO:93) agtgcgaacaccgtagtgctgacagg (SEQ ID NO:94) Ptx3: tgagccgcaggtctgtggatccatcc (SEQ ID NO:95) tccctgttcctggccttagtcctagg (SEQ ID NO:96) Enl: atcctccgagtggacattcacatagg (SEQ ID NO:97) atgtccagcaaatagagatcgctacac (SEQ ID NO:98) 另外，对于Msxl、 Msx2和Lmxla而言，使用的是实施例1中的引物。 此外，已知Ptx3和Enl是有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞的标记物。 结果，在ES细胞(CCE)中未检测到Msxl mRNA的表达，但该结果表 明作为分化诱导的结果，从第4天开始，按照与Lmxla相同的方式诱导 表达，所述Lmxla是多巴胺能神经元增殖祖细胞的标记基因(图7)。
另 一方面，在ES细胞(CCE)中检测到Msx2 mRNA的表达，结果表明 经分化诱导后，表达有所增加(图7)。
Msxl基因和Msx2基因在通过Lrp4分选的多巴胺能神经元 增殖祖细胞中的表达
为了证实Msxl基因和Msx2基因在多巴胺能神经元增殖祖细胞中表 达，使用在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达的Lrp4作为标记物，分别从得自12.5日龄小鼠胚胎中脑的细胞和SDIA分化诱导细胞中分离多 巴胺能神经元增殖祖细胞，并研究这些细胞中的Msxl mRNA和Msx2 mRNA表达。
首先，将编码Lrp4基因胞外区域(161-502氨基酸)的基因序列转染至 293E细胞(ATCC),表达并收集Lrp4蛋白的胞外区域。用收集的蛋白质免 疫仓鼠(得自SLC),然后，提取淋巴细胞，与骨髓瘤细胞(ATCC)融合，以获 得能产生抗-Lrp4抗体的杂交瘤。
使用细胞解离緩冲液TM(Invitrogen)分散细胞群，该细胞群含有得自12.5 曰龄小鼠胚胎中脑，或在体外由ES细胞诱导分化成的多巴胺能神经元祖细 胞，然后，无需经固定和透化处理，于4。C用抗-Lrp4单克隆抗体(由杂交瘤 (保藏号为FERM BP-10315和FERM BP-10316)产生的抗体，稀释至1/2的 培养物上清液，P/。胎牛血清(JRH), lmMEDTA/SDIA分化培养基(Kawasaki et al. Neuron (2000)28(1):31-40))将细胞染色20分钟。然后，于4。C用1%胎 牛血清和lmM EDTA/SDIA分化培养基洗涤3分钟，共3次，于4。C使用 经生物素标记的抗-仓鼠IgG抗体(Jackson, 10吗/ml， 1。/。胎牛血清，lmM EDTA/SDIA分化培养基)将细胞染色20分钟，然后，按相同的方式进行洗 涤。于4。C使用经PE标记的链霉亲和素(Pharmingen， 20 pg/ml， 1%胎牛血 清，lmMEDTA/SDIA分化培养基)将细胞染色20分钟，然后，按相同的方 式进行洗涤。染色后，通过细胞分选仪(FACS vantage SE,Becton Dickinson) 分离Lrp4阳性细胞和阴性细胞(图8)。分离后，立即使用Rneasy微型试剂 盒(Qiagen)从细胞中制备总RNA，使用eDNA合成试剂盒(TAKARA)合成双 链cDNA。用限制性酶RsaI(TAKARA)消化之后，在其中加入ad2，将ad2S 用作引物，通过15个PCR循环扩增cDNA,并用作RT-PCR的模板。在下 述条件下进行扩增72。C保温5分钟，然后于94。C反应30秒，65。C反应 30秒，72。C反应2分钟，共15个循环，最后，于72。C保温2分钟。
接着，使用相当于4ng、 0.4ng和0.04ng扩增cDNA的cDNA为模板， 在下述反应体系中进行PCR。
10xExTaq 1 jul
2.5 mM dNTP 0.8
ExTaq 0.05 pl
100pM引物
各为0.1 plcDNA 1 |il
蒸馏水 6.95 j^l
使用了具有上述序列的引物。
94。C保温2分钟之后，94。C30秒，65。C30秒，72。C2分钟以进行扩 增反应，最后，于72。C保温2分钟。对Lmxla和Nurrl进行24个PCR扩 增循环，对其它的进行26个PCR扩增循环。
结果，在得自12.5日龄小鼠胚胎中脑的细胞中，Msxl mRNA和Msx2 mRNA在Lrpl阳性细胞群体(即多巴胺能神经元增殖祖细胞)中强表达(图 9)。另外，在SDIA分化诱导细胞中，Msxl mRNA或Msx2 mRNA在Lrp4-阳性细胞群体中强表达(图9)。因此揭示出Msxl mRNA或Msx2 mRNA在 多巴胺能神经元增殖祖细胞、SDIA分化诱导细胞以及得自小鼠胚胎中脑的 细胞中表达。
因此，本发明揭示出Msxl基因和Msx2基因是有用的标记物，它不仅 可区分得自胚胎中脑的多巴胺能神经元增殖祖细胞，还能区分在体外由ES 细胞诱导分化成的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
权利要求
1.用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的多核苷酸探针或多核苷酸引物，所述探针或引物能与由Msx1基因或Msx2基因的核苷酸序列或其互补序列组成的多核苷酸杂交。
2. 根据权利要求
1的多核苷酸探针或多核苷酸引物，所述探针或引物 由含有Msxl基因或Msx2基因的核苷酸序列或其互补序列中至少10个连 续核苷酸的多核苷酸组成。
3. 根据权利要求
1或2的多核苷酸探针或多核苷酸引物，其中Msxl基 因或Msx2基因的核苦酸序列含有部分或完整的选自由以下核苦酸序列组 成的组的核苦酸序列SEQ ID NO:l的核苦酸1-710和963-1713, SEQ ID NO:3的核苷酸1-677和943-1546, SEQ ID NO:5的核苷酸1-484和 736-1316， SEQ ID NO:7的核苷酸1-612和864-1801, SEQIDNO:9的核苷 酸1-737和976-1724, SEQ ID NO: 11的核苷酸1-525和777-1189, SEQ ID NO:13的核苷酸1-612和864-1810, SEQ ID NO:15的核苷酸1-754和 994-1754， SEQ ID NO:16的核芬酸1-744和996-1935, SEQIDNO:17的核 苦酸1-610和864-1806, SEQ ID NO: 19的核苦酸1-610和864-1785, SEQ ID NO:21的核苷酸1-1456和1710-1905， SEQ ID NO:23的核苷酸1-625和 891-1062, SEQ ID NO:25的核香酸1-709和963-1895, SEQIDNO:27的核 苷酸1-520和786-1310， SEQ ID NO:29的核苦酸1-510和767-1259, SEQ ID NO:31的核香酸1-473和712-2180, SEQ ID NO:33的核苷酸1-468和 707-1138， SEQIDNO:35的核香酸1-435和674-1143， SEQIDNO:37的核 香酸1-473和712-1164, SEQ ID NO:39的核苷酸1-473和712-1164, SEQ ID NO:41的核瞽酸1-473和712-2048, SEQ ID NO:43的核苷酸1-473和 712-2182, SEQ ID NO:45的核苷酸1-413和651-804, SEQ ID NO:47的核苷 酸1-431和670-2605， SEQ ID NO:49的核苷酸1-435和674-2136, SEQ ID NO:51的核苷酸1-778和1015-1452， SEQ ID NO:53的核苷酸1-780和 1017-1453， SEQ ID NO:55的核苦酸1-370和609-800, SEQIDNO:57的核 苷酸1-29和267-420， SEQIDNO:59的核苷酸1-1340和1578-1731, SEQ ID NO:61的核苷酸1-541和778-2225， SEQ ID NO:63的核苷酸1-404和 651-804， SEQIDNO:65的核苷酸1-632, SEQIDNO:67的核苷酸1-489和728-1107,和SEQIDNO:69的核苦酸1-487和708-2569。
4. 根据权利要求
1至3中任一项的多核苷酸探针或多核苷酸引物，其 长度至少为15个;威基。
5. 多核苷酸引物套，含有根据权利要求
1至4中任一项的多核苷酸引物。
6. 抗Msxl蛋白或Msx2蛋白或其部分的抗体，是用于检测或选择多巴 胺能神经元增殖祖细胞的抗体。
7. 根据权利要求
6的抗体，其中Msxl蛋白或Msx2蛋白或其部分含有 选自下组的氨基酸序列中的至少6个氨基酸残基或其整个序列SEQ ID NO:2的氨基酸1-143和242-297, SEQIDNO:4的氨基酸1-216和315-370, SEQ ID NO:6的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:8的氨基酸1-149和 248-299， SEQIDNO:10的氨基酸1-143和242-297, SEQIDNO:12的氨基 酸1-149和248-303, SEQ ID NO: 14的氨基酸1-143和242-323, SEQ ID NO: 18 的氨基酸1-143和242-297， SEQ IDNO:20的氨基酸1-143和242-297， SEQ ID NO:22的氨基酸1-472和571-634, SEQ ID NO:24的氨基酸1-208和 298-353, SEQIDNO:26的氨基酸1-143和242-297, SEQIDNO:28的氨基 酸1-138和237-288， SEQ ID NO:30的氨基酸1-100和199-242, SEQ ID NO:32 的氨基酸1-120和218-267， SEQIDNO:34的氨基酸1-120和218-268， SEQ ID NO:36的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:38的氨基酸1-120和219- 267, SEQ ID NO:40的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:42的氨基 酸1 -120和219-267 ， SEQ ID NO:44的氨基酸1 -120和219-267, SEQ ID NO:46 的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:48的氨基酸1-120和219-267， SEQ ID NO:50的氨基酸1-119和218-266, SEQ ID NO:52的氨基酸1-121和220- 268， SEQ ID NO:54的氨基酸1-121和220-269, SEQ ID NO:56的氨基 酸1-9和99-139， SEQ ID NO:58的氨基酸1-9和99-139， SEQIDNO:60的 氨基酸i_466和527-576， SEQ ID NO:62的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:64的氨基酸1-120和219-267， SEQ ID NO:66的氨基酸1-120, SEQ ID NO:68的氨基酸1-112和211-259,和SEQ ID NO:70的氨基酸1-112和 211-259。
8. 检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，其包括4企测Msxl基 因或Msx2基因表达的步骤。
9. 根据权利要求
8的方法，其中检测Msxl基因或Msx2基因表达的步 骤包括下述步骤(a) 使得自待测试细胞样品的多核苷酸与根据权利要求
1至4中任一项 的多核苦酸探针接触；和(b) 检测杂交复合物。
10. 根据权利要求
9的方法，其中在步骤(a)中，将制备自待测试细胞 样品的mRNA或由该mRNA转录出的互补DNA(cDNA)与所述多核苷酸探 针接触。
11. 根据权利要求
8的方法，其中检测Msxl基因或Msx2基因表达 的步骤包括下述步骤(c) 使用得自待测试细胞样品的多核苷酸作为模板，并使用根据权利要 求1至4中任一项的多核苷酸引物或根据权利要求
5的多核苷酸引物对， 进4亍核酸扩增；和(d) 检测所形成的扩增产物。
12. 根据权利要求
11的方法，其中在步骤(c)中，将制备自待测试细 胞样品的mRNA或由该mRNA转录出的互补DNA(cDNA)用作模板。
13. 根据权利要求
8的方法，其中检测Msxl基因或Msx2基因表达 的步骤包括下述步骤(e) 使得自待测试细胞样品的蛋白质与根据权利要求
6或7的抗体接 角虫；牙口(f) 测定抗原-抗体复合物。
14. 根据权利要求
9至13中任一项的方法，其中待测试细胞样品是 经诱导而向多巴胺能神经元增殖祖细胞分化的ES细胞。
15. 根据权利要求
14的方法，其中通过SDLA法进行分化诱导。
16. 根据权利要求
9至13中任一项的方法，其中待测试细胞样品是 得自胚胎中脑腹侧区域的细胞。
17. 根据权利要求
9至16中任一项的方法，其中在步骤(a)、步骤(c) 或步骤(e)中，将冲全测到除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增 殖祖细胞标记基因的表达的细胞用作待测试细胞样品。
18. 根据权利要求
9至16中任一项的方法，其中在步骤(b)、步骤(d) 或步骤(f)之后，还包括步骤(g),其检测除Msxl基因和Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因的表达。
19. 根据权利要求
17或18的方法，其中除Msxl基因和Msx2基因 以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因是选自Lrp4基因、Nato3基因 和Mashl基因中的至少一个基因。
20. 用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂盒，其至少含 有根据权利要求
1至4中任一项的多核苷酸探针。
21. 根据权利要求
20的试剂盒，其进一步包括能检测除Msxl基因和 Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因表达的探针、引物、 引物套或抗体。
22. 用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂盒，其至少含 有根据权利要求
1至4中任一项的多核苷酸引物或根据权利要求
5的多核 芬酸引物套。
23. 根据权利要求
22的试剂盒，其进一步包括能检测除Msxl基因或 Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因表达的探针、引物、 引物套或抗体。
24. 用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂盒，其至少含 有根据权利要求
6或7的抗体。
25. 根据权利要求
24的试剂盒，其进一步包括能检测除Msxl基因或 Msx2基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因表达的探针、引物、 引物套或抗体。
26. 筛选物质的方法，所述物质能有效诱导生成多巴胺能神经元增殖 祖细胞的分化过程，所述方法包括下述步骤(i) 使能分化成多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞与待测试的物质接 触^ 和(ii) 检测与待测试物质接触后的细胞中的Msxl基因或Msx2基因表达。
27. 根据权利要求
26的方法，其进一步包括下述步骤(iii) 在与待测试物质接触后的细胞中^r测除Msxl基因和Msx2基因以 外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因的表达。
28. 根据权利要求
27的方法，其中除Msxl基因和Msx2基因以外的 多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因是选自Lrp4基因、Nato3基因和Mashl 基因中的至少一个基因。
29. 制备多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，所述方法包括下述步骤(iv) 获得多个细胞，其中含有多巴胺能神经元增殖祖细胞；(v) 使用根据权利要求
8至19中任一项的方法检测或选择多巴胺能神 经元增歹直3且细月包；禾口(vi) 培养步骤(v)中检测到或选择出的细胞。
30. 多核苦酸用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的用途，所 述多核苷酸能与由Msxl基因或Msx2基因的核苷酸序列组成的多核苷酸或 其互补序列杂交。
31. 根据权利要求
30的用途，其中能杂交的多核苷酸由Msxl基因或 Msx2基因核苷酸序列或其互补序列中至少10个连续核苷酸的序列组成。
32. 根据权利要求
30或31的用途，其中Msxl基因或Msx2基因的 核苦酸序列含有部分或完整的选自由以下核苷酸序列组成的组的核苦酸序 列SEQIDNO:l的核苷酸1-710和963-1713, SEQIDNO:3的核苷酸1-677 和943-1546， SEQ ID NO:5的核苷酸1-484和736-1316, SEQ ID NO:7的 核苷酸1-612和864-1801, SEQ ID NO:9的核香酸1-737和976-1724, SEQ ID NO:ll的核香酸1-525和777-1189， SEQ ID NO:13的核苷酸1-612和 864-1810, SEQ IDNO:15的核香酸1-754和994-1754, SEQIDNO:16的核 苦酸1-744和996-1935， SEQ ID NO: 17的核苷酸1-610和864-1806, SEQ ID NO:19的核香酸1-610和864-1785, SEQ ID NO:21的核芬酸1-1456和 1710-1905, SEQIDNO:23的核芬酸1-625和891-1062, SEQIDNO:25的核 苷酸1-709和963-1895, SEQ IDNO:27的核苦酸1-520和786-1310, SEQ ID NO:29的核香酸1-510和767-1259, SEQ ID NO:31的核苦酸1-473和 712-2180, SEQ ID NO:33的核苦酸1-468和707-1138, SEQIDNO:35的核 芬酸1-435和674-1143, SEQ IDNO:37的核苷酸1-473和712-1164， SEQ ID NO:39的核芬酸1-473和712-1164, SEQ ID NO:41的核苦酸1-473和 712-2048, SEQIDNO:43的核苦酸1-473和712-2182, SEQIDNO:45的核 苷酸1-413和651-804， SEQIDNO:47的核苦酸1-431和670-2605， SEQ ID NO:49的核苷酸1-435和674-2136， SEQ ID NO:51的核苦酸1-778和 1015-1452, SEQIDNO:53的核苷酸1-780和1017-1453， SEQIDNO:55的 核苷酸1-370和609-800, SEQ IDNO:57的核苷酸1-29和267-420, SEQ IDNO:59的核苦酸1-1340和1578-1731, SEQ ID NO:61的核苷酸1-541和 778-2225， SEQIDNO:63的核芬酸1-404和651-804， SEQIDNO:65的核香 酸1-632, SEQIDNO:67的核芬酸1-489和728-1107,和SEQ ID NO:69的 核苷酸1-487和708-2569。
33. 根据权利要求
30至32中任一项的用途，其中能杂交的多核苷酸 的长度至少为15个碱基。
34. 抗Msxl蛋白或Msx2蛋白或其部分的抗体用于检测或选择多巴 胺能神经元增殖祖细胞的用途。
35. 根据权利要求
34的用途，其中Msxl蛋白或Msx2蛋白或其部分 含有选自下组的氨基酸序列中的至少6个氨基酸残基或其整个序列SEQ ID NO:2的氨基酸1-143和242-297， SEQIDNO:4的氨基酸1-216和315-370, SEQ ID NO:6的氨基酸1-143和242-297， SEQ ID NO:8的氨基酸1-149和 248-299, SEQIDNO:10的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:12的氨基 酸1-149和248-303 ， SEQ ID NO: 14的氨基酸1-143和242-323, SEQ ID NO: 18 的氨基酸1-143和242-297, SEQIDNO:20的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:22的氨基酸1-472和571-634, SEQ ID NO:24的氨基酸1-208和 298-353, SEQ ID NO:26的氨基酸1-143和242-297, SEQ ID NO:28的氨基 酸1-138和237-288, SEQ ID NO:30的氨基酸1-100和199-242， SEQ ID NO:32 的氨基酸1-120和218-267, SEQIDNO:34的氨基酸1-120和218-268, SEQ ID NO:36的氨基酸1-120和219-267， SEQ ID NO:38的氨基酸1-120和219- 267， SEQIDNO:40的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:42的氨基 酸1-120和219-267, SEQ ID NO:44的氨基酸1-120和219-267， SEQ ID NO:46 的氨基酸1-120和219-267， SEQIDNO:48的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:50的氨基酸1-119和218-266, SEQ ID NO:52的氨基酸1-121和220- 268, SEQIDNO:54的氨基酸1-121和220-269, SEQIDNO:56的氨基 酸1-9和99-139, SEQ ID NO:58的氨基酸1-9和99-139， SEQIDNO:60的 氨基酸1-466和527-576, SEQ ID NO:62的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:64的氨基酸1-120和219-267, SEQ ID NO:66的氨基酸1-120, SEQ ID NO:68的氨基酸1-112和211-259，和SEQ ID NO:70的氨基酸1-112和 211-259。
专利摘要
本发明提供了用于检测多巴胺能神经元增殖祖细胞的探针、引物和抗体。本发明还提供了用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的多核苷酸探针和多核苷酸引物，所述探针和引物能与由Msx1基因或Msx2基因的核苷酸序列组成的多核苷酸或其互补序列杂交，本发明还提供了用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的抗Msx1蛋白或Msx2蛋白或其部分的抗体。
文档编号C12Q1/02GKCN101292030SQ200680038826
公开日2008年10月22日 申请日期2006年8月18日
发明者中川康子, 中谷智哉, 坂本佳正, 尾野雄一 申请人:卫材R&D管理有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan