专利名称:禽Ⅰ型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种禽I型马立克病病毒疫苗株基因工程通用载体的构建方法和在获得的 重组禽I型马立克病病毒疫苗毒株方方面的应用，属于兽用生物制品领域。
技术背景
马立克病病毒(Marek's Disease Virus, MDV)，学名为禽疱疹病毒2型(Gallid herpesvirus 2)，是鸡的重要传染病病原，并具有致肿瘤特性(陆承平主编.兽医微生物学. 第四版，中国农业出版社，2007， 359)。马立克病病毒Marek's Disease Virus, MDV)引起 鸡一种高度接触性传染性肿瘤病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和各内脏器官的淋巴样 细胞浸润、增生和肿瘤形成为特征，传播速度快、潜伏期长。它在世界范围内流行，使严 重危害养禽业发展的三种主要疫病之一。利用血清学技术，可将马立克病病毒其分为3个 血清型I型马立克病病毒强病毒株及其致弱毒株(MDV)，天然不致瘤株(MDV2)，天 然不致病的HVT。在MDV基因组中含有许多病毒复制的非必须区，这为重组马立克病病 毒的构建提供了理论基础。
在MDV三个血清型的疫苗毒株中，禽I型马立克病病毒更适于构建重组疫苗病毒， 如CVI988株比火鸡疱疹病毒(HVT)更具优越性，因为其与流行毒株抗原性更接近，除 此以外作为重组病毒载体还具有如下优点(1) MDV为细胞结合性病毒，可持续感染。经 疫苗免疫的鸡可终生带毒，产生持久的免疫力。(2)MDV疫苗接种后，病毒在细胞间传播， 因而不受母源抗体的干扰。(3) MDV的基因组较大，可插入多个外源基因，现在已经研究 清楚US区有多个外源基因插入位点，在US基因中插入外源基因片段不会影响病毒的复制。 (4)该病毒的自然宿主只有禽类，对其它家畜和人类是安全的。
随着对MDV的毒力相关的基因或分子位点和结构研究的深入，研究方向转向马立克 病病毒基因工程重组疫苗，即利用己有的马立克病病毒疫苗毒株作为活载体，表达其它病 原的保护性抗原基因，如以HVT为载体表达IBDV的VP2基因及NDVF基因等。其技术
3核心是利用同源重组原理，将外源抗原基因插入MDV中并表达，具有抗多种病毒的效果。 重组MDV构建中最关键的一步，是构建MDV转移载体。李永清、周雪媚、张培君等发明 的是一种转移载体pUS2-LacZ,其特征在于重组质粒pUS2上的US2基因片段由CMV立 即早期启动子、LacZ基因、转录终止信号SV40polyA、氨苄青霉素和新霉素标记基因以及 一个多克隆位点基因替换。通过与MDV疫苗病毒同源重组并纯化筛选，获得LacZ标记基 因的重组病毒MDV (《重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用》(公开号CN1763205;)。
现在已有报道的MDV转移载体，筛选基因和标记基因都是单独使用，这造成现有的 MDV转移载体，在应用中存在一些问题和缺点。如果单独使用筛选基因，如氨苄青霉素、 新霉素标记基因，其缺点在于无法直观显示重组病毒的数量和重组病毒的纯度，造成实验 的盲目性。若是单独采用标记基因，如李永清;周雪媚;张培君等单独使用的标记基因是 LacZ，缺点在于重组病毒筛选过程中，无法抑制母源MDV的污染，导致不能有效区分重 组病毒和母源MDV，影响筛选效率，造成筛选时间长，易失败。另一方面，已有的载体只 能允许一个外源抗原基因的插入表达(《重组鸡马立克氏病病毒转移载体及应用》(公开号 CN1763205;)。以上的缺点限制了现在已有转移载体的应用，无法快速构建重组病毒，阻 碍了重组MDV的生产应用。
本发明设计所构建禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体，可以克服已有MDV转移载 体的缺点，从而可以快速构建、筛选获得重组MDV，有利于重组MDV疫苗的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是构建一种高效的禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体，为重组马立 克病毒基因工程疫苗生产用毒株的研制提供新的可靠技术保障。 发明简述
本发明公开了一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体构建方法及其在 构建疫苗生产用重组马立克氏病病毒上的应用。
本发明公开了构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基 因(S-g-n)的如序列l所示的核苷酸序列。
本发明公开了构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的筛选同源臂 (U)，如序列6所示的核苷酸序列。
本发明公开了构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的的表达盒基因，(C-M-A)，如序列9所示的核苷酸序列。
本发明将以上元件的核苷酸序列连接后构建禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载
体质粒，命名为T-Us;将该质粒与禽I型马立克病病毒共转染，获得重组病毒，同时还 可以验证载体的有效性。
本发明通过基因工程的方法构建高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体， 可通过如下步骤实现-
1) 由设计合成的序列2， 3和序列4， 5所示的两对引物经扩增后获得具有序列1所示
的报告和筛选基因核苷酸序列；
2) 由设计合成的序列7， 8所示的一对引物经扩增后获得具有序列6所示的同源臂基 因(U)的核苷酸序列，连入pMD18-T质粒中，构建通用载体同源臂质粒T-U;
3) 由设计合成的序列IO， 11所示的一对引物经扩增后获得具有序列9所示的表达盒 核苷酸序列；
4) 将以上元件的核苷酸序列在体外连接后，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，构建 成通用载体T-Us。
5) 与禽I型马立克病病毒共转染，获得重组MDV同时也进一步验证了通用载体(T-Us) 的有效性。
本发明还涉及获得绿色荧光标记基因和新霉素抗性基因的重组MDV，同时通用载体上 具有多克隆位点，可插入多个外源病毒基因，通过同源重组得到的重组病毒，可不受母源 抗体影响，刺激机体产生对多种病毒的抗体，且能有效保护禽类免遭禽马立克病毒的攻击。 发明详述
本发明公开了一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体构建方法及其在 构建疫苗生产用重组马立克氏病病毒上的应用。
本发明公开了构建高效的禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基因，
该基因是本发明人设计合成了绿色荧光和新霉素基因(S-g-n)，在SV40早期启动子调控下
高效融合表达作为通用载体的报告和筛选基因，如序列1所示的核苷酸序列。
本发明选择了 MDV复制非必需区US10作为外源基因插入位点，同时筛选了通用载体 同源臂的最适长度，左、右长度分别为1000 2000bp之间，如序列6所示的核苷酸序列。 将扩增得到的同源臂基因(U)连入T质粒(T即为质粒pMD18-T，是TAKARA公司产品， 由pUC18质粒改建，是用于克隆基因的专用质粒)中，构建通用载体同源臂质粒(T-U)。 本发明新合成改造了多克隆位点，并引入合适的间隔子，构建表达盒(C-M-A),如序 列9所示的核苷酸序列。将以上元件连接后构建通用载体(T-Us)。
与禽I型MDV共转染，获得重组病毒验证载体的有效性。
本发明将增强型绿色荧光基因(来源于pEGFP-Cl载体，经扩增改造获得)和新霉素 基因(来源于pCDNA3.1(+)质粒，经扩增改造获得)共同作为禽I型MDV疫苗株基因工 程通用载体的报告和筛选基因，以独立的早期启动子调控，高效融合表达，这样获得的重 组病毒既可进行药物筛选，同时可以方便直观的检测病毒滴度和含量。为扩增如上所述的 报告筛选基因(S-g-n)，本发明设计并合成了如下相应引物
序列2 (Gl): 5'-GTGGGTCGACTAGTTATTAATAGTAATC-3';
序列3 (G2): 5'-TGAGATCTACGCGTTAAGATACATTG-3';
序列4 (Nl): 5'-GGATCCATGATTGAACAAGATGGA-3';
序列5 (N2): 5'-CTCGAGTCAGAAGAACTCGTCAAG-3';
构建过程如下将以引物G1/ G2经PCR扩增得到的增强型绿色荧光基因经限制性内 切酶Bgin和SalI酶切后，回收；以引物N1/N2经PCR扩增得到的新霉素基因经限制性内 切酶BamHI和Xhol酶切后，回收(因基因经BglII和BamHI、 Xhol和Sail酶切后可分别 产生具有互补的序列，因此可以相互连接)与前面回收的增强型绿色荧光基因连接后作为 PCR模板，使用引物G1和G2扩增即得到通用载体的报告和筛选基因(S-g-n)。
本发明分析了禽I型马立克病毒的基因组结构和功能，筛选病毒复制的非必需区，在 对这些非必需区分析基础上选择基因组中的US10基因作为外源基因的插入位点。这样既 能保证不影响禽I型马立克病毒的复制，同时又能保证外源基因的高效、稳定表达，增强 了重组马立克病毒的遗传稳定性。本发明选取US10基因两侧的序列作为禽I型马立克病 毒疫苗株基因工程通用载体的同源臂(U)，设计合成了一对PCR引物，优选序列7 (Ml) 和序列8(M2)所示序列的引物进行扩增后，将扩增产物连入T载体(T即为载体pMD18-T， 是TAKARA公司产品，由pUC18载体改建，是用于克隆基因的专用载体)构建通用载体 的同源臂质粒(T-U)。
为扩增通用载体的同源臂(U)设计合成了如下引物
序列7 (Ml): 5'-GAGTATTGTGAAGCACT-3';
序列8 (M2): 5'-GAAACTGGTCAGTGGAG-3';
本发明采用基因工程的方法构建禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的表达盒
6(C-M-A)。具体过程如下设计一对PCR引物，优选序列9 (Cl)和序列IO (C2)所示 序列的引物进行扩增得到的产物，包含有巨细胞病毒(CMV)早期启动子(Promoter)、多克 隆位点(MCS)和转录终止信号polyA基因，在下游引入SalI酶切位点；同时选择合适的 间隔子(IR)经EcoRV酶切后连入多克隆位点(MCS)内，构建成表达盒(C-M-A)，这 样保证在一个启动子的调控下同时高效表达多个外源基因。
为扩增通用载体的通用载体的表达盒设计合成了如下PCR引物,如序列10 (Cl)和序 列11 (C2):
序列10 (Cl): 5'-GTTCTGCTGGTTGACATTGATTATTGA-3'; 序列11 (C2): 5'-TAGTCGACCCATAGAGCCCACCGC-3';
如上所述禽I型MDV疫苗株基因工程通用载体的核苷酸序列连接后构建通用载体 (T-Us)，具体过程如下
将PCR扩增得到的具有序列1所示的报告基因和筛选基因(S-g-n)和PCR扩增得到 的具有序列9所示的表达盒基因(C-M-A)，分别经限制性内切酶SalI酶切，回收，体外连 接后作为PCR模板，使用如上引物G1和G2，用可产生平端的T叫酶，经PCR扩增得到 包含报告基因和筛选基因(S-g-n)以及表达盒基因(C-M-A)的基因序列(具有平末端)， 将报告基因和筛选基因(S-g-n)、表达盒基因(C-M-A)回收；用限制性内切酶Pstl酶切 并用DNA聚合酶I将两端补平，得到了同源臂基因质粒(T-U) (T即为载体pMD18-T， 是TAKARA公司产品，由pUC18载体改建，是用于克隆基因的专用载体)，最后将报告基 因和筛选基因(S-g-n)、表达盒基因(C-M-A) —同连入同源臂基因质粒(T-U),连接产 物再转化入大肠杆菌，获得禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体(T-Us)。
禽I型MDV的重组方法如下
将通用载体(T-Us)质粒转染已经感染CVI988的鸡胚成纤维细胞。待病毒蚀斑出现后， 荧光显微镜下观察绿色的荧光病毒蚀斑，结果表明外源性的基因已经被重组到马立克病毒 基因组中。经药物筛选5代后(用含0.4mg/mlG418培养液加压24h的CEF细胞，接种重 组病毒，37t:继续培养，每24h更换50。/。的培养液维持G418筛选压力不变，于第5天将 感染的细胞消化下来，再接种于新鲜的细胞上，如此重复4次)，即获得纯化的禽I型重组 MDV CVI988-26株(或称GalUd herpesvirus 2 CV麵-26， 2009年06月18日已将本 病毒株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo. 3132)。
以上结果表明本发明构建的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体(T-Us)可以 调控外源基因的高效表达，具备高效、快捷、稳定的特点，克服了己有转移载体的缺点。 本发明的积极意义
本发明构建了禽I型马立克病毒的通用载体(T-Us)，只需几代药物筛选和荧光筛选， 实现了在短时间内即获得稳定高效表达外源基因重组病毒的设计目标。同时，本发明也提 供了一套重组马立克病毒筛选纯化的工艺，获得了一株重组禽I型马立克病病毒CVI988-26 株，该病毒携带有禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us，用该病毒免疫动物可 不受母源抗体影响，刺激机体产生对多种病毒的抗体，且能有效保护禽类免遭禽马立克病 毒的攻击。为新型马立克病疫苗的研制奠定了坚实的基础。
图1绿色荧光蛋白基因的扩增结果该图是本发明实施例通用载体绿色荧光蛋白基因 的扩增结果图，其结果与预期结果一致，约1600bp，表明成功扩增得到标记基因绿色荧光 蛋白基因。
图2通用载体的表达盒(C-M-A)基因的扩增结果该图显示表达盒(C-M-A)基因 的扩增结果的与预期结果一致，片段大小约lOOObp，表明成功扩增得到表达盒。
图3同源臂的PCR扩增结果该图显示结果表明成功扩增得到同源臂，约2000bp。
图4重组马立克病毒通用载体鉴定是本发明实施例重组马立克病毒通用载体鉴定 图，结果与预期片段大小一致，表明成功构建了通用载体。
图5重组MDV通用载体的构建是本发明实施例重组MDV通用载体的构建图，由图 可见重组病毒转移质粒构建的技术路线。
图6重组MDV在CEF细胞上形成的荧光蚀斑是重组马立克病毒在CEF细胞上形成 的荧光蚀斑图，结果表明获得了表达荧光的重组马立克病毒，说明禽I型马立克病毒疫苗 株基因工程通用载体是有效的，设计合理，可用于重组病毒的构建。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施进行具体说明 1.禽I型马立克病毒的繁殖自液氮中取出冻存的禽I型马立克病毒(毒株名CVI988-1，青岛易邦生物工程有限公司 保存提供)，快速置于37X:水浴，快速溶化，低速离心弃上清，以含有8%犊牛血清的1640 培养液悬浮细胞，取适量的病毒接种已经长满单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)(按常规方法 制备的)上，37'CC02温箱培养，待70%病变出现后收集细胞，冻存细胞于液氮中。
2. PCR扩增通用载体的报告筛选基因(S-g-n)、表达盒基因(C-M-A)、同源臂基因(U) 克隆与序列测定。(参考附图l、图2、图3)，图l为报告筛选基因(S-g-n)的扩增结果， 与预期结果一致，约2400bp，电泳结果表明成功得到报告筛选基因。图2为表达盒基因的 扩增结果，由图可见扩增得到约1000bp的目的片段(C-M-A)。图3为同源臂(U)的扩增 结果，预期的片段大小一致，约2700bp，琼脂糖电泳结果表明成功扩增同源臂。
3. 禽I型马立克病毒的通用载体(T-Us)的构建
将扩增得到的同源臂基因(T-U)经限制性内切酶Pstl酶切用DNA凝胶回收试剂盒(购 自上海生物工程有限公司)回收，再使用DNA聚合酶I (Klenow Fragment)将两端补平； 报告筛选基因(S-g-n)、表达盒基因(C-M-A)分别经SalI酶切后，回收，16。C定向连接， 再与补平的同源臂基因(T-U)连接，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选出阳性克隆 质粒，构建成通用载体(T-Us)，结果见图4、 5。
图4为通用载体的酶切鉴定结果。图4中第1道为标准marker (TAKATADL15000)， 具体条带大小见图；第2、 3道为通用载体的酶切结果与预期片段大小一致，分别约为650bp 和9000bp;第4道为标准marker (TAKATADL2000)，具体条带大小见图。酶切电泳结果 证明，构建的通用载体正确。
测序验证序列和读码框。测序结果表明，构建的禽I型马立克病毒的通用载体(T-Us) 与试验设计一致正确，含有完整的报告筛选基因(S-g-n)，同时将CMV启动子及其多克隆 位点(C-M-A)与之连接，构成CMV启动子和增强子控制下的外源基因表达盒，插入到 含有马立克病毒(MDV)复制非必需区基因(短独特区US10)的克隆片段(T-U)中，构 建成重组MDV的通用载体。在该载体中，表达盒的两端分别与两段约1000bp的MDV同 源片段连接，用于在病毒内的同源重组。构建成重组马立克病毒的通用载体(T-Us)经测 序证明各部件正确连接，且未发生突变和读码框错位。具体构建过程和结果见图5。
碱裂解法(按照《分子克隆》第二版中的方法)大量提取质粒并纯化，用于转染细胞
9获得重组病毒。
4. 按照脂质体介导转化法(依照Lipfectin2000,InvitrogenCorp.的产品说明书操作)用重组MDV的通用载体质粒(T-Us)转染已经感染CVI988的鸡胚成纤维细胞获得重组MDV:
(1) 转染前l天，传代CEF，接种6孔细胞培养板，待细胞单层长至80%融合准备转染。
(2) 用无血清培养液洗涤，然后用禽I型马立克病毒疫苗株(毒株号CVI988-1)感染细胞，感染量为200PFU，在37'C感作2h，其间每20min摇动病毒感作液一次，然后倒掉感染液，洗涤细胞；
(3) 取两只1.5 ml无菌E卯endorf管。管A加入2 10pL LIPOFECTIN 2000 (购自Invitrogen公司)和100pL无血清培养基OPTI-MEM (购自Invitrogen公司)，混匀后室温静置5rnin。其间于管B中加入lOOpL无血清培养基OPTI-MEM和2.0ng/nL的重组MDV的通用载体质粒(T-Us)。
(4) 将管A中的LIPOFECTIN 2000和OPTI-MEM混合液滴加至管B中，混匀后于室温静置20 min。加入已经感染禽I型马立克病毒的CEF细胞上，37°C 5% C02培养箱5 8小时，吸弃转染液，加入含5%牛血清的DMEM培养液，37。C培养至72h出现典型的细胞病变，于荧光显微镜下观察荧光(附图6)。出现80%的细胞出现细胞病变后收获病毒。
5. 重组马立克病毒的筛选、纯化
将部分收获的重组马立克病毒继续感染用含0.4mg/mlG418培养液(Sigma)筛选重组病毒，重组病毒可表达抗G418的酶因此可以良好增殖，而母源病毒CVI988-1的生长被G418抑制而无法增殖，这样经过4轮的筛选获得纯化的重组马立克病病毒，命名为马立克病病毒CVI988-26株。
具体的筛选、纯化方法如下
以常规方法使用SPF鸡胚制备原代鸡胚成纤维细胞(CEF) ,37'C培养24h后胰酶消化传代，细胞接入六孔细胞培养板，每孔接入6X106CEF细胞，37'C继续培养细胞长满至80。/。 90%，接入0.4mg/mlG418， 12h后接入收获的重组马立克病毒，37。C继续培养，每24h更换50。/。的培养液维持G418筛选压力(浓度为0.4mg/ml)不变，于第5天将感染的细胞消化下来,再接种于新鲜的细胞上，如此重复4次，筛选到重组病毒(见图6)。
10序列表
<110>青岛易邦生物工程有限公司
<120>禽I型马立克病病毒疫苗株基因工程通用载体
<130>
<160> 11
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 2422
<212> DNA<213>人工序列
<220><223>因基因<400>
对人工序列的描述禽I型马立克病病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选基
11720780
90096010201080114012001260AGTTGTGGTT TGTCCAAACT CA 2422
<210> 2
<211> 28
<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述:扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选
基因基因的引物G1:
<400> 2
GTGGGTCGAC TAGTTATTAA TAGTAATC 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述:扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选
基因基因的引物G2:
<400> 3
TGAGATCTAC GCGTTAAGAT ACATTG 26<210> 4<211> 18<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选
基因基因的引物Nl-
<400> 4
ATGATTGAAC AAGATGGA
18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的报告和筛选
基因基因的引物N2:
<400> 5
TCAGAAGAAC TCGTCAAG 20
<210> 6
<211> 2730
<212> DNA<213>人工序列
<220><formula>formula see original document page 15</formula>GTTGTGGTTT GTCCAAACTC A
1560
1680 1740 1800
1860 1920
1980
2160 2220 2280 2340 2400 2421
<210> 7
<211> 17
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的同源臂(T-U)
的引物Ml:
<400> 7
GAGTATTGTGAAGCACT 17
16<210> 8
<211> 17
<212> DNA <213>人工序列
<220〉
<223>对人工序列的描述扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的同源臂
(T-U)的引物M2:
<400> 8
GAAACTGGTCAGTGGAG 17
<210> 9
<211> 1529
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的表达盒基因 <400> 9GCATGCTGGG GATGCGGTGG GCTCTATGG
1529
<210> 10
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述:扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的表达盒基因
18的引物C1:
<400> 10
GACGGATCGG GAGATCTCCC G
21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述扩增禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的表达盒基因 的引物C2:
<400> 11
CCATAGAGCC CACCGCATCC CC 22
19
权利要求
1.一种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us，其特征在于该通用载体含有
1)如序列1所示的核苷酸序列的报告和筛选基因S-g-n；
2)如序列6所示的核苷酸序列的同源臂U；
3)如序列9所示的核苷酸序列的表达盒基因C-M-A。
2. —种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us的构建方法，其特征在于构建方法包括以下步骤1) 由设计合成的序列2， 3和序列4， 5所示的两对引物经扩增后获得具有序列1所示的报告和筛选基因核苷酸序列；2) 由设计合成的序列7， 8所示的一对引物经扩增后获得具有序列6所示的同源臂基因U的核苷酸序列，连入pMD18-T质粒中，构建通用载体同源臂质粒T-U;3) 由设计合成的序列IO， 11所示的一对引物经扩增后获得具有序列9所示的表达盒核苷酸序列；4) 将以上元件的核苷酸序列在体外连接后，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，构建成通用载体T-Us。
3. —种高效的禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us的应用，其特征在于是将通用载体T-Us与禽I型马立克病病毒共转染，获得重组MDV CVI988-26株，2009年06月18日已将本病毒株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 3132。
4. 如权利要求
3所述的一种高效的禽1型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体丁- Us的应用，其特征在于提供了一种重组禽I型马立克病毒的筛选方法是用含0.4mg/mlG418培养液加压24h的CEF细胞，接种重组病毒，37。C继续培养，每24h更换50%的培养液维持G418筛选压力不变，于第5天将感染的细胞消化下来，再接种于新鲜的细胞上，如此重复4次，筛选到重组病毒，同时，结合荧光观察重组病毒的含量和纯度。
5. 如权利要求
3所述的一种高效的禽1型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体1- Us的应用，其特征在于所得到的重组禽I型马立克病病毒CGMCC No. 3132病毒携带有禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体T-Us，用该病毒免疫动物可不受母源抗体影响，刺激机体产生对多种病毒的抗体，且能有效保护禽类免遭禽马立克病毒的攻击。
专利摘要
本发明涉及一种禽I型马立克病毒疫苗株基因工程通用载体的构建方法及其应用。包括该通用载体(T-Us)的构建主要包括设计合成了绿色荧光和新霉素基因(S-g-n)，在SV40早期启动子调控下高效融合表达作为通用载体的报告和筛选基因；选择了MDV复制非必须区US10作为外源基因插入位点，同时筛选了通用载体同源臂(U)的最适长度，左、右长度分别为1000-2000bp之间；新合成改造了多克隆位点，并引入合适的间隔子，构建表达盒(C-M-A)，以上元件连接后构建通用载体(T-Us)。应用该通用载体与禽I型马立克病毒共转染，获得了一株重组禽I型马立克病病毒CVI988-26株，为新型马立克病疫苗的研制奠定了坚实的基础。
文档编号C12N15/85GKCN101659966SQ200910087701
公开日2010年3月3日 申请日期2009年6月24日
发明者刘新文, 李明义, 范根成 申请人:青岛易邦生物工程有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan