专利名称:抗乙型肝炎病毒尼古丁药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，尤其是涉及一种用尼古丁处理树突状细胞的方法，以及用HBV抗原HBe、HBx负载尼古丁处理后树突状细胞的方法。
背景技术：
乙型肝炎病毒(Hepatisis B virus,HBV)引起的病毒性肝炎是严重威胁人类健康的常见病和多发病，目前，全世界有乙型肝炎病毒(HBV)感染者约3.5亿，中国占1/3以上，约为1.2亿，其中有1/4约3000万为慢性乙型肝炎患者。因此，研究慢性乙型肝炎预防和治疗的措施已成为生命科学与医学研究领域的重点和热点。
RongQ等人以分子生物学手段对HBV在肝外组织的存在状态进行研究发现，HBV不仅可在肝细胞中增殖，而且可在包括淋巴细胞、心肌细胞、肾实质细胞等多种细胞中增殖和潜伏。肝外组织中HBV的潜伏可逃避以肝细胞特异性受体为特异靶点的免疫治疗的打击，成为HBV慢性化的根源之一。Agostini C等的研究发现，HBV在淋巴细胞中的存在可影响淋巴细胞的增殖分化与功能，肝脏内HBV特异性CTL (杀伤性T细胞)的失能以及机体对HBV抗原的免疫耐受是HBV感染慢性化的关键。
病毒感染细胞的清除主要依靠适应性免疫应答产生的病毒抗原特异性CTL，以及适应性免疫应答和固有免疫应答过程中分泌的IFN-Y等细胞因子。树突状细胞作为适应性免疫应答的启动者，是目前所知抗原提呈功能最强的抗原提呈细胞(antigenpresenting cell，APC)，而且是连接适应性免疫和固有免疫的桥梁。对树突状细胞的研究有助于深入了解机体免疫应答的产生和调控机制。通过人为干预树突状细胞的功能来调控机体的免疫应答，以达到对HBV病毒感染的治疗作用，对乙型肝炎的防治具有重要的实际意义。[0005]随着对HBV慢性化进程中免疫细胞失能和免疫逃逸机制的深入研究，以HBV抗原特异性CTL过继免疫和固有分子TRM22抗HBV研究也逐步开展。蔡大川等以人HBsAg负载的人脐血来源的树突状细胞与同源靶细胞进行进行混合培养，发现树突状细胞可在体外特异性杀伤HBsAg负载的靶细胞。HBV抗原负载的树突状细胞虽然可在HBV转基因鼠体内成功打破已有的免疫耐受，诱导产生针对抗原的特异性免疫应答，但此类树突状细胞在体内产生免疫应答的效率有待于进一步提高。经细胞因子IL-15、IL-4、IL-18、IFN-Y刺激或其基因转染，联合抗原负载以增强树突状细胞诱导效率的研究方兴未艾，但上述方法有操作复杂、价格昂贵、活性不稳定的缺点而限制其在临床的广泛应用。
乙酰胆碱烟碱样受体(nicotineacetylcholine receptor, nAchR)在神经系统和非神经细胞(如免疫细胞、内皮细胞和上皮细胞)中有广泛的表达。nAchR配体——尼古丁，是由芳族六元环(吡啶)和脂族五元环(吡咯烷)通过单键连接而形成的天然化合物。提纯后的尼古丁是一种味苦、无色透明的油质液体，挥发性强，在空气中极易氧化成暗灰色，能迅速溶于水及酒精中，通过口鼻支气管粘膜很容易被机体吸收，粘在皮肤表面的尼古丁亦可被吸收渗入体内。它具有性质稳定、易于获得和价廉的优点。[0007]尼古丁的英文通用名称为nicotine，中文化学名称为(S)_3_(1-甲基_2_吡咯烧基)卩比唳，英文化学名称为(S)-3-(l-Methyl-2-pyrrolidinyl)pyridine,国际编号为61868，CAS编码为54-11-5，其结构式为:
权利要求
1.一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于，所述抗乙型肝炎树突状细胞为抗乙型肝炎树突状细胞表面⑶80、⑶86、⑶40、CCR7表面分子的表达量显著增加，表明细胞处于活化状态，激活乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒X抗原特异性T细胞的能力显著增强；MHC I类分子表达增加，表明此细胞具有更强的提呈乙型肝炎病毒e抗原和乙型肝炎病毒X抗原的能力； 所述制备方法包括以下步骤: 1)将未成熟的树突状细胞在培养液中培养，所述培养液为RPMIMedium 1640培养液，在RPMI Medium 1640培养液中含有摩尔浓度为I X 1(Γ8 I X l(T6mol/L的尼古丁 ； 2)使乙型肝炎病毒e抗原，或/和 乙型肝炎病毒X抗原，与 步骤I)中经尼古丁处理的树突状细胞接触； 3)收集树突状细胞，即得到抗乙型肝炎树突状细胞。
2.按权利要求
1所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述未成熟的树突状细胞为获自哺乳动物的未成熟树突状细胞。
3.按权利要求
1所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述尼古丁的摩尔浓度为I X l(T7mol/L。
4.按权利要求
1或3所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述尼古丁的来源为化学合成或提取自天然植物，所述天然植物选自烟草、番茄或枸杞子 。
5.按权利要求
1所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述尼古丁为尼古丁水溶液。
6.按权利要求
1所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述培养的时间为12 16h。
7.按权利要求
6所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于所述培养的时间为12 14h。
8.按权利要求
7所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于所述培养的时间为12h。
9.按权利要求
1所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所用HBe、HBx抗原浓度为I 10 μ g/ml,所述HBV的抗原HBeAg、HbxAg来自重组工程菌所表达的蛋白；所述接触的时间为4 6h。
10.按权利要求
9所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原浓度为I 5 μ g/ml，所述接触的时间为6h。
11.按权利要求
10所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原浓度为I 2 μ g/ml。
12.按权利要求
11所述的一种抗乙型肝炎树突状细胞的制备方法，其特征在于所用HBe、HBx抗原浓度为I μ g/ml。
专利摘要
抗乙型肝炎病毒尼古丁药物组合物，涉及一种组合物。提供一种抗乙型肝炎树突状细胞及其制备方法，以及抗乙型肝炎树突状细胞在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎药物中的应用。将未成熟的树突状细胞在培养液中培养，所述培养液为RPMI Medium 1640培养液，在RPMI Medium 1640培养液中含有尼古丁；使乙型肝炎病毒e抗原，或/和乙型肝炎病毒x抗原，与经尼古丁处理的树突状细胞接触；收集树突状细胞，即得到抗乙型肝炎树突状细胞。所述抗乙型肝炎树突状细胞可应用于制备用于预防和/或治疗乙型肝炎药物。用于预防和/或治疗乙型肝炎药物包括抗乙型肝炎树突状细胞和药学上可接受的载体。
文档编号C12N5/0784GKCN101693885 B发布类型授权 专利申请号CN 200910112670
公开日2013年5月8日 申请日期2009年10月16日
发明者李海涛, 高丰光, 倪晓妍 申请人:厦门大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),