专利名称:一种棘胸蛙微卫星dna标记ⅱ及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种棘胸蛙的DNA分子遗传标记及其用途。
技术背景
微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星侧翼序列相对保守，根据其侧翼序列设计引物，可用PCR 扩增出微卫星位点的序列。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列广泛存在于真核生物基因组中，而且随机分布，具有高度多态性，选择上中性，共显性等特点，是十分有效的遗传标记，被广泛应用于遗传图谱构建、基因定位、遗传关系分析、品种鉴定等领域。如用微卫星标记分析苎麻品种的亲缘关系 (Zhou 等，2005，Progress in Natural Science，15 137-142)、用微卫星 DNA 标记进行猪品种分类的专利申请“适于猪品种分类的猪微卫星DNA标记”(公开号CN1370834A)、用微卫星DNA标记进行家蚕分子连锁遗传分析的专利申请“家蚕的SSR标记及其应用”(公开号CN 1970792A)。
棘胸蛙(Paa spinosa David)，属两栖纲、无尾目、蛙科。棘胸蛙个体大，肉质细嫩洁白，味道鲜美，具有很高的营养价值和药用价值，素有“百蛙之王”的美称。由于人为捕杀和自然环境的恶化，野生棘胸蛙资源遭到严重破坏，开展棘胸蛙人工养殖既有助于保护野生资源，又能满足市场需求。现在，棘胸蛙是我国重要的养殖蛙类之一，但是由于其基础研究薄弱，要实现规模养殖还有许多亟待解决的问题，其中包括需要一套有效的分子标记对其进行遗传关系分析、种质资源调查、标记辅助育种等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种棘胸蛙微卫星DNA标记II，利用这些分子标记能对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种棘胸蛙微卫星DNA标记II，该微卫星DNA 标记II的核苷酸序列为SEQ ID NO :4，该微卫星编号为Ι^ρ19。
作为本发明的棘胸蛙微卫星DNA标记II的改进棘胸蛙微卫星DNA标记II引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5' -3'，
Psp 19 正向TCACAATCGACGTAATGG
反向ACACACAGAGGGTCACACT。
本发明还同时提供了棘胸蛙微卫星DNA标记II的用途，其特征是用于对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查或辅助育种。
实现上述发明的技术方案包括棘胸蛙(CA)n微卫星富集文库的构建、含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，确定了 8个多态性丰富的微卫星标记I^spie、Pspl7,Pspl8, Pspl9、Psp20、Psp21、Psp22、Psp23。
本发明旨在分离克隆微卫星DNA标记，建立棘胸蛙的微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。因此，本发明提供了 8个棘胸蛙微卫星位点的DNA序列及扩增上述8个棘胸蛙微卫星位点的引物序列和扩增方法，8个棘胸蛙微卫星位点用于棘胸蛙种质资源研究，遗传关系分析，标记辅助选种和标记辅助育种，重复性好，多态性高，是一种可靠有效的分子标记。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
图1是本发明涉及的13个棘胸蛙自然种群的structure聚类图(K = 3)。
具体实施方式
实施例1、棘胸蛙(CA)n微卫星富集文库的构建
依次进行以下步骤
1)、用经典的酚-氯仿抽提法提取棘胸蛙(广西龙胜)基因组DNA。用限制性内切酶Sau3AI酶切棘胸蛙基因组DNA，酶切产物在1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下 300-1000bp大小的DNA片段并用凝胶回收试剂盒纯化回收酶切产物。
2)、将碱基互补的寡核苷酸Sau3AI Oligo A :5' -GGCCAGAGACCCCMGCTTCG-3‘和 Oligo B 5' -pGATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3‘(上海生工合成，HPLC 级纯化，200pmol/ μ 1)各取10 μ 1轻轻蜗旋混勻，在PCR仪上80°C变性10分钟，然后在室温下使寡核普酸链缓慢退火复性约1小时，加入60 μ 1高纯水制备成浓度为25ρπι01/μ 1带有Sau3AI酶切识别位点的接头。
3)、将上述步骤1)所得的酶切产物和步骤2)所得的接头用T4DNA连接酶连接，将所得的连接液用维特洁公司的清洁试剂盒纯化，去除盐离子、蛋白和多余的接头片段，溶解于50 μ 1 TE缓冲液中；得连接产物。
4)、用生物素标记的寡核苷酸探针(CA)15与步骤幻所得的连接产物DNA片段杂交。具体操作为在总体积100 μ 1杂交液(6 X SSC, 0. 1% SDS)中加入500ng连接产物和 IOOpmol生物素标记的寡核苷酸探针，并在95°C下变性10min，60°C杂交1小时。
5)、在步骤 4)所得物中加入 100 μ 1(10 μ g/μ 1)磁珠(Dynabeads Μ480，购自 Dynal Biotech公司)，并在室温放置30分钟。
6)、在磁力架上吸附磁珠，弃上清。磁珠用400 μ 1洗涤缓冲液(6 X SSC, 0. 1 % SDS) 在60°C下洗涤15分钟，然后在室温下分别用2XSSC和IXSSC溶液洗涤两次，并弃上清。
7)、在步骤6)所得物中加入50 μ 1无菌水，在90°C下保温10分钟，小心吸取上清， 上清液即为含有(CA)n重复序列的单链DNA片段。以OligoA为引物，以单链DNA片段为模板进行PCR扩增获得双链目的片段。
25 μ IPCR 反应体系包含大约 IOOng 单链 DNA 片段，20mm Tris-HCI (pH8. 3)， IOOmmKCI, 3mm MgCl2, dNTP # 1000 ym,3pmol Oligo A, 0. 8units Taq polymerase (Shanghaipromega)0[0025]PCR循环程序设置为95°C预变性3分钟，接着5个循环包括95°C变性30s，60°C 退火30s，72°C延伸45s，然后进行另外30个循环的92°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 55s，最后于72°C下延伸10分钟。检测PCR产物并使用维特洁公司的纯化试剂盒纯化，产物溶解于30 μ 1 TE缓冲液中。
8)、将步骤7)所得的扩增产物纯化后连接到PMD18-T载体上，然后将连接产物转化至大肠杆菌感受细胞，转化菌液涂布在含有IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选。
实施例2、含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物设计
依次进行以下步骤
1)、挑取实施例1所得的白色菌落并接种到:3ml LB培养液中，37°C培养过夜，然后提取质粒。
2)、以质粒 DNA 为模板，采取三引物法(Gardner 等，1999，Journal of Heredity, 90,301-304)筛选含有(CA)n微卫星序列的阳性克隆。
3)、将阳性克隆测序，分析是否含有(CA)n重复序列，以及是否有足够的侧翼序列用于引物设计。
4)、根据微卫星重复序列两侧的保守序列，用primer premier5. 0软件设计引物， 引物长度一般在16-22碱基之间，选择扩增的目标片段在150-350bp之间。
实施例3、棘胸蛙微卫星DNA标记稳定性和多态性检测
用上述实施例2所得的微卫星标记扩增32个来自同一自然种群的棘胸蛙个体 (浙江)，确定了 8个多态性丰富，适于棘胸蛙遗传多样性检测的微卫星标记(表1)。具体操作过程如下
1)、用经典的酚-氯仿法抽提32个棘胸蛙个体的DNA作为模板。
2)、设计的引物合成后对引物正确性和可行性进行实验验证，用温度梯度PCR扩增多个模板。15 μ 1的PCR反应体系中含大约50ng基因组DNA，IOmm Tris-HCI (pH8. 3), 50mm KCI, 1. 5mm MgCl2, dNTP # 500 μ m，lpmol弓|_，0. 5units Taq polymerase (Shanghai promega)。根据实验结果确定哪些引物能够扩增出稳定的目的条带，以及确定最佳退火温度(见表一)。最终筛选出8个位点，分别命名为Ι^ρ16、Ι^ρ17、Ι^ρ18、Ι^ρ19、Ι^ρ20、 Psp21、Psp22、Psp23。
3)、分别用上述8个位点的8对引物(引物序列见表1)扩增这若干个棘胸蛙个体的DNA。其中任意一条SSR引物的5’端被加上一段没有远红外荧光标记的M13序列，而另一条IRDye标记的M13引物同时包含在这个反应体系中。按上述步骤2)的反应条件进行 PCR扩增。PCR产物在LI-C0R4300S遗传自动分析仪上进行基因分型，配合使用内置STR分子量标准(STR Marker，LI-COR Bioseienee)和软件SAGAct自动判读条带，辅以人工校正。
4)、使用软件CERVUS 2. 0统计等位基因数目，多态信息含量(PIC)，观测杂合度 (Observed heterozygosities, Ho)禾口期望杂合度(Expected heterozygosities, He)。哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)偏离测试和位点间的连锁不平衡检验(Linkagedisequilibrium, LD)使用 GENEP0P 软件 version3. 4 完成，之后辅以连续的 Bonefermni校正。使用MICR0-CHEKER软件估算每个位点的无效等位基因情况。
最终确定了以下8个棘胸蛙微卫星DNA标记，分别是[0040]编号为I^pl6的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQIDNO 1所示
编号为Ι^ρ17的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQIDNO 2所示
编号为I^pl8的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQIDNO 3所示
编号为I^pl9的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQIDNO 4所示
编号为Psp20的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQIDNO 5所示
编号为Psp21的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQIDNO 6所示
编号为Psp22的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQIDNO 7所示
编号为Psp23的微卫星DNA标记，其核苷酸序列如SEQIDNO 8所示。
表1、引物特性表引物序列，退火温度，片段大小
权利要求
1.一种棘胸蛙微卫星DNA标记II，其特征是该微卫星DNA标记II的核苷酸序列为 SEQ ID N0:4，该微卫星编号为Pspl9。
2.根据权利要求
1所述的棘胸蛙微卫星DNA标记II，其特征是扩增所述棘胸蛙微卫星DNA标记II的引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5' -3'，Pspl9 正向TCACAATCGACGTAATGG 反向ACACACAGAGGGTCACACT。
3.根据权利要求
1或2所述的棘胸蛙微卫星DNA标记II的用途，其特征是用于对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查或辅助育种。
专利摘要
本发明公开了一种棘胸蛙微卫星DNA标记II，该微卫星DNA标记II的核苷酸序列为SEQ ID NO4，该微卫星编号为Psp19。本发明还同时提供了该棘胸蛙微卫星DNA标记II的用途用于对棘胸蛙进行遗传分析、种质资源调查和辅助育种。
文档编号C12N15/11GKCN101805734 B发布类型授权 专利申请号CN 201010162348
公开日2012年2月1日 申请日期2008年10月23日
发明者叶容晖, 成斌, 杨光, 郑荣泉 申请人:浙江师范大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),