专利名称:从酵母菌中提取虾青素和谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，特别涉及酵母菌代谢产物提取。
背景技术：
红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)可合成虾青素，红法夫酵母野生株系中虾青素积累量达细胞干重的O. 05%左右，某些突变株系中最多可达0.3%，并且所合成的类胡萝
卜素中虾青素是主要成分，因而是目前微生物发酵生产虾青素普遍采用的菌株。
谷胱甘肽是发现最早、功能最强和研究最深入的天然小分子肽之一。谷胱甘肽是存在于生物体内的重要肽类物质，有着重要的生理活性，通常是从动物肝脏和酵母中提取 得到。由于特殊的酵母菌种在培养过程中会积累一定浓度的谷胱甘肽，所以酵母细胞就成了提取谷胱甘肽的主要来源。
浙江工业大学的专利申请红发夫酵母中虾青素的提取方法，公开号为CN1548420，2004年11月24日公开。该专利中采用含抗氧化剂的有机酸或酸性有机溶剂提取虾青素。
山东农业大学申请的名称为微波辅助二甲基亚砜法虾青素制备技术中，专利申请号为CN200910017325.X，该发明提供了一种微波辅助二甲基亚砜法虾青素制备技术，红法夫酵母发酵液离心后加入二甲基亚砜，置于微波下辅助破壁，再加入有机溶剂，保温浸提，使虾青素自细胞内转到细胞外并溶于有机溶剂中，混合溶液离心后经过低温真空浓缩得到虾青素浓缩液。该发明将微波破壁技术与二甲基亚砜破壁成功结合，降低了成本，提高了效率，节约了提取时间，可有效防止虾青素结构不被破坏，提高红法夫酵母中虾青素的提取效果O
由于红发夫酵母的细胞壁异常坚硬，因此酵母的破壁情况对虾青素的提取效果起到了很大的影响。目前已有对虾青素的破壁提取主要利用超声波法、酸热法、二甲基亚砜法、碱法破壁然后通过有机溶剂浸提得到虾青素。上述提取工艺均存在工艺复杂，成本较高的问题。
尚无文章报道利用同一酵母菌种同时高效生产虾青素和谷胱甘肽及有效的从酵母中提取虾青素和谷胱甘肽的工艺。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种从酵母菌中提取虾青素和谷胱甘肽的方法。
本发明技术方案如下
产虾青素和谷胱甘肽的酵母在发酵培养基中进行发酵培养，将发酵获得酵母发酵液离心洗涤后获得酵母细胞，热水浸提酵母细胞获得谷胱甘肽浸出液；谷胱甘肽浸出液经膜过滤除去大分子物质，减压浓缩后进行等电结晶或喷雾干燥制备粉末制剂；酵母细胞经干燥获得酵母粉，酒精萃取酵母粉，浓缩萃取液获得虾青素；所述酵母为红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)CGMCC No 3788。
上述热水浸提操作中热水温度为80-100°C，浸提2-4次，每次浸提5_10分钟；[0012]上述膜的截流分子量在500_1000Da的纳滤膜。
上述酒精萃取工艺中，酵母粉与酒精的料液比为I : 7-12 ;所述酒精为85-100%的乙醇溶液。
虾青素提取过程中，浓缩采用蒸馏浓缩方法。
本发明发酵产虾青素和谷胱甘肽的一个实施方案中，发酵培养基中碳源为葡萄糖，葡萄糖的浓度为25-40g/L ；
本发明发酵产虾青素和谷胱甘肽的一个实施方案中，所述的发酵培养基中碳源为葡萄糖，氮源主要为玉米浆及少量无机氮源，如O. 2-3. 5g/L的玉米浆以及无机氮源，无机氮源可选择O. 03-lg/L的硫酸铵和尿素；以及其他营养盐，如O. 1-0. 3g/L的KH2PO4,, 0-0. 2g/L 的 MgSO4 · 7H20。
本发明发酵产虾青素和谷胱甘肽的一个实施方案中，发酵培养条件如下搅拌转速120-180rpm，温度15_26°C，溶氧O. 5%以上；发酵时间56-102小时。
本发明发酵产虾青素和谷胱甘肽的一个实施方案中，发酵过程中流加葡萄糖和氮源，发酵液中葡萄糖浓度控制在I. 5%及以下，流加氮源为玉米浆及少量无机氮源，呼吸商在O. 8-1. 5 ;发酵培养16小时后I次或多次降低发酵液中葡萄糖浓度到O. 02-0. 5g/L。
本发明红发夫酵母菌株已经于2010年4月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，(邮编100101)，中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No 3788。
有益效果
本发明利用中性醇溶液进行高效虾青素萃取的工艺路线，避免了以往传统酸化破壁对产品质量和用途造成的不良影响；试验表明，本发明的提取工艺使虾青素的提取率可以达到85%以上，谷胱甘肽的提取率达到90%以上。
本发明采用选育的单一菌种进行虾青素和谷胱甘肽的联合生产，通过使用在发酵稳定期降低葡萄糖浓度的“饥饿培养方法”等技术有效提高了虾青素的产量，在单一生产流程中同时高效生产脂溶性的抗氧化剂和水溶性的抗氧化剂。酵母细胞的虾青素含量达到2500微克/克干细胞以上的同时，细胞的谷胱甘肽的含量也达到了 10000 μ g/g以上的水平，具有良好的综合利用价值。 具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明中酵母菌株发酵生产虾青素和谷胱甘肽的提取工艺。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求
书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明诱变选育的产奸青素和谷胱甘肽的红发夫酵母(Phaffia rhodozyma),已经于2010年4月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，(邮编100101)，中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No 3788。
采用编号为JCM-9680红发夫酵母定向诱变产生高产虾青素和谷胱甘肽的菌株，本发明中定向诱变指将一定浓度的酵母细胞悬浮液用化学和物理诱变剂反复处理，包括采用100-200微克/毫升亚硝基胍在20-25°C处理20-40分钟，并用Co60辐射源进行辐照。选育获得红发夫酵母(Phaffia rhodozyma),该酵母菌株已经于2010年4月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No 3788。
本发明中虾青素的测定方法如下
I. IOml发酵液3000r/min离心15min洗漆两次,去掉上清液。
2.用2. 5ml的二甲基亚砜破壁,搅拌然后用3000r/min离心15min两次至沉淀物
无色，上清液用丙酮萃取。
3.加蒸馏水洗涤丙酮萃取液至澄清透明，定容至25ml，测定波长在474nm时的吸光度。
细胞总奸青素质量浓度(yg/ml) = (A*Va)/(E*Vf)
式中A-光密度
Va-萃取液体积，ml
E-消光系数，为O. 21
Vf-取样发酵液体积，ml
本发明中谷胱甘肽的含量测定方法如下
A、半定量方法
B、HPLC定量测定方法
色谱柱岛津Vp-ODS 4. 6 X 250mm ;
流动相磷酸二氢钠和庚烷磺酸钠混合溶液(磷酸二氢钠3. Og,庚烷磺酸钠I. Og,加水溶解并定容至500ml)乙腈=96 4(v v),用磷酸调节pH为3. O。
检测器岛津SPD-M20A型DAD检测器。
流速lml/min;柱温45°C ;进样量20 μ I。
实施例I
将出发菌株JCM-9680红发夫酵母的平板分离单菌落培养物转接到含葡萄糖5%的YMPD液体培养基中，于22°C下培养18 24小时。取旺盛生长的培养物5毫升，于4000rpm下离心15分钟，倾倒掉上清液，用生理盐水洗涤沉淀细胞2 3次后，用50mM的PH7. O的磷酸缓冲溶液悬浮酵母沉淀，稀释至约IO7细胞/毫升，备用。
向装有上液的试管中加入亚硝基胍丙酮溶液，使最终浓度达到200微克/毫升，混合均匀后在22°C下保温30分钟，离心，除去上清液，用相同的磷酸缓冲溶液洗涤2 3次，洗涤后的细胞悬液适当稀释后涂布于YMPD平板上，于22°C培养箱中培养72小时后，挑取菌落颜色鲜艳者进行发酵试验。试验采用的液体培养基的组成为(g/L)葡萄糖30 ;酵母膏3 ;蛋白胨10 ;麦芽汁3 ;PH 5.0。在22°C下，250rpm的转速下摇瓶48小时，分析变异株同出发株的产物产量为
权利要求
1.一种酵母菌发酵法提取虾青素和谷胱甘肽的工艺，包括如下步骤联产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母发酵培养，用温度为80-100°C的热水浸提酵母细胞2-4次，每次浸提5-10分钟，获得谷胱甘肽浸出液；谷胱甘肽浸出液经膜过滤除去大分子物质，减压浓缩后进行等电结晶或喷雾干燥制备粉末制剂；酵母细胞经干燥获得酵母粉，酒精萃取酵母粉，浓缩萃取液获得奸青素。
2.根据权利要求
I所述酵母菌发酵法提取虾青素和谷胱甘肽的工艺，其特征在于所述膜的截流分子量在500-1000D a。
3.根据权利要求
I所述酵母菌发酵法提取虾青素和谷胱甘肽的工艺，其特征在于所述酵母粉与酒精的料液比为I : 7-12。
4.根据权利要求
I或4所述酵母菌发酵法提取虾青素和谷胱甘肽的工艺，其特征在于所述所述酒精为85-100%的乙醇溶液。
5.根据权利要求
I所述酵母菌发酵法提取虾青素和谷胱甘肽的工艺，其特征在于所述红发夫酵母发酵培养基中碳源为葡萄糖，葡萄糖的浓度为25-40g/L ;氮源为玉米浆及少量无机氮源，发酵过程中流加葡萄糖和氮源，发酵液中葡萄糖浓度控制在I. 5 %以下，发酵生长的稳定期I次或多次降低发酵液中葡萄糖浓度到O. 02-0. 5g/L。
专利摘要
本发明公开了从酵母菌中提取虾青素和谷胱甘肽的方法，本发明属于微生物发酵领域，特别涉及酵母菌代谢产物提取。本发明发酵联产虾青素和谷胱甘肽的发酵培养基中碳源为葡萄糖，葡萄糖的浓度为25-40g/L；将发酵获得酵母发酵液离心洗涤后获得酵母细胞，热水浸提获得谷胱甘肽浸出液；谷胱甘肽浸出液经膜过滤除去大分子物质，减压浓缩后进行等电结晶或喷雾干燥制备粉末制剂；酵母细胞经干燥获得酵母粉，酒精萃取酵母粉，浓缩萃取液获得虾青素；克服了虾青素生产的经济性方面的制约。本发明对提高产品的附加值和减少环境污染都有着重要的示范意义。
文档编号C07K1/14GKCN101906454 B发布类型授权 专利申请号CN 201010268910
公开日2012年8月15日 申请日期2010年9月1日
发明者裴疆森, 黄玲 申请人:中国食品发酵工业研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (2),