专利名称:一种利用宇佐美曲霉生产壳聚糖酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用宇佐美曲霉生产壳聚糖酶(Chitosanase)的方法，具体而言是指利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株固态发酵生产壳聚糖酶的新工艺，属于生物工程技术领域：
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背景技术：
壳聚糖是几丁质的脱乙酰基产物，是一种高分子阳离子絮凝剂。壳聚糖经部分水解得到的壳寡糖具有良好的水溶性，无毒、无热源、无变异性，易被生物机体吸收，并具有独特的生理活性，在医药、食品、农业等领域中有着广泛的应用前景。利用专一性高的生物催化剂壳聚糖酶水解壳聚糖，具有反应条件温和，反应过程易控制，对环境无污染，且壳寡糖产最高、质量稳定等特点，是一种理想的生产壳寡糖的方法。
壳聚糖酶分布较广泛，目前已在细菌(Bacillus、Myxobacter, Enterobacter)、放线菌(Streptomyces、Nocardioides)、霉菌(Aspergillus、Penicillium)、病毒(Chlorella virus PBCV-U CVK-2)及植物中检测到壳聚糖酶的存在，并已从微生物发酵液中纯化得到了壳聚糖酶。多数微生物壳聚糖酶属于诱导酶，在细胞的正常代谢活动中，微量合成或不合成，在适当的底物壳聚糖存在下，壳聚糖酶被诱导合成。陈小娥等报道了利用一株曲霉菌 (Aspergillus sp.)摇瓶发酵生产壳聚糖酶，其发酵液的壳聚糖酶活性为197U/mL ；同时研究了碳源对曲霉突变株CJ22-3^5产酶的影响，发现该突变株壳聚糖酶是一种典型的诱导酶，它的合成与分泌都需要有壳聚糖的存在，2%的壳聚糖(w/v)起到最佳的诱导效果。孙玉英等报道的Microbacterium sp. OUOl菌株产壳聚糖酶活性达118U/mL。余蓉等在发明专利(《壳聚糖酶制备新工艺》，公开号CN1810963A)中报道了利用贵州绿僵菌固态发酵生产壳聚糖酶的新技术，但壳聚糖酶活性平均仅为83. lU/g干培养基。综上所述，无论是液体发酵或固态发酵，目前微生物产壳聚糖酶活性均较低，导致了壳聚糖酶的生产和应用成本高， 从而限制了该酶的广泛应用；且未见有利用宇佐美曲霉固态发酵生产壳聚糖酶的文献或专利报道。微生物固态发酵具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低以及对环境友好等优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用麸皮、豆饼粉和菜籽饼粉等农副产品为固态发酵基料，并添加适量的无机氮源、壳聚糖、无机盐、表面活性剂等，在实验室小试规模上，利用宇佐美曲霉EOOl固态发酵生产壳聚糖酶的方法。本发明所述固态发酵的技术方案和内容如下
1.菌株宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株，由江南大学筛选和保藏， 该菌株已于2008年在《生物加工过程》杂志的Vol. 6 No. 2 Pg. 38公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。
2.斜面种子培养去皮马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L, pH 6. 0 ； 121°C灭菌20min，放置试管斜面；冷却后接种EOOl菌株，30°C培养96h。此斜面培养基可用于菌种的活化、保藏和斜面种子等，每3个月转接1次。
3.麸曲种子制备:250mL三角瓶装IOg基料(麸皮IOg)，(NH4)2SO4 IOOmg,自来水 12mL, pH 6. 0 ；充分混勻，121°C灭菌40min ；冷却后接种EOOl试管斜面种子，30°C静置培养 96h，期间分别于24h和44h各翻曲一次。
4.固态发酵250mL三角瓶装IOg基料(麸皮8 10g，豆饼粉0 2g，菜籽饼粉 0 Ig)，(NH4)2SO4 50 lOOmg，壳聚糖 0 0. 2g, MgSO4 5 IOmgjCaCl2 5 IOmgjKH2PO4 30 50mg,Tween-80 40mg,自来水 12 15mL，pH 6. 0 ；培养基 121°C灭菌 40min ；冷却后接种一菌耳EOOl麸曲种子，30 ;34°C培养72 96h，期间分别于16 20h和36 40h各翻
曲一次。
5.粗酶液提取固态发酵结束后称取发酵曲料lg，加入9mL的pH 5. 0,0. 05mol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，室温浸泡lh，滤纸过滤，所得滤液即为壳聚糖粗酶液。
6.分析方法
壳聚糖酶活性测定于25mL具塞试管A和B中，分别加入用pH 5. 0、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制的质量浓度为1. 0%的壳聚糖溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中加入0. ImL适当稀释的酶液，50°C准确反应20min;立即各加入2. 5mL 3'，5' -二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷却后各加去离子水 5mL,混勻；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从盐酸氨基葡萄糖标准曲线上查出相应的还原糖(以氨基葡萄糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义为在本测定条件下，以每分钟产生1 μ g还原糖所需的酶量定义为1个壳聚糖酶活性单位(U)。
还原糖测定采用DNS法，以盐酸氨基葡萄糖为标准。
曲料水分测定称取一定量的固态发酵培养物(曲料)，105°C烘干至恒重。
本发明的有益效果本发明利用宇佐美曲霉EOOl菌株，采用固态发酵生产壳聚糖酶，实验室小试产壳聚糖酶活性可达1942 2461U/g干曲。本发明突出的优点有①采用优化的培养基配方和发酵条件，充分挖掘了 EOOl菌株产壳聚糖酶的潜力；②采用较廉价的农副产品如麸皮、豆饼粉和菜籽饼粉等作为固态发酵的主原料，充分地利用了自然界的可再生资源；③固态发酵法对环境友好，是一种绿色环保的生产方式；④与利用微生物液体发酵法相比较，固态发酵法生产壳聚糖酶具有设备简单、投资少、生产成本低等优势。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明，但不应将此理解为本发明上述内容的范围仅局限于下述实施例。
实施例1
菌株宇佐美曲霉(Aspergillususamii)EOOl 菌株。
固态发酵培养基250mL三角瓶装IOg基料(麸皮9g+豆饼粉Ig)，(NH4)2SO4 lOOmg, MgSO4 IOmg, CaCl2 IOmg, KH2PO4 50mg,自来水 12mL, pH 6. 0。
固态发酵条件培养基121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳EOOl麸曲种子，30°C 静置培养84h，期间分别于20h和40h各翻曲一次。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，EOOl成熟固态发酵曲料的壳聚糖酶产均酶活性达到1942U/g干曲。
实施例2
菌株宇佐美曲霉(Aspergillususamii)EOOl 菌株。
固态发酵培养基250mL三角瓶装IOg基料(麸皮8g，豆饼粉lg，菜籽饼粉Ig)，壳聚糖 0.2g，(NH4)2SO4 lOOmg，Tween-80 40mg, MgSO4 IOmg, CaCl2 1 Omg，KH2PO4 50mg，自来水 14mL,pH 6· O。
固态发酵条件培养基121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳EOOl麸曲种子，30°C 静置培养96h，期间分别于20h和40h各翻曲一次。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，EOOl成熟固态发酵曲料的壳聚糖酶平均酶活性达到2274U/g干曲。
实施例3
为了有利于菌体的生长，达到缩短发酵周期和控制杂菌污染的目的，本实施例采用固态发酵温度前高后低的变温控制模式，其发酵菌株和培养基配方同实施例2。
固态发酵培养基经灭菌、冷却、接种后，34°C培养至16h，第1次翻曲；随后32°C培养至36h，第2次翻曲；最后30°C培养至72h。
重复3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶实验结果表明，EOOl成熟固态发酵曲料的壳聚糖酶平均酶活性达到2461U/g干曲。
权利要求
1.一种实验室小试规模生产壳聚糖酶的新方法，其特征在于以麸皮、豆饼粉和菜籽饼粉等农副产品为固态发酵培养基的基料，并添加适量的壳聚糖、无机盐、表面活性剂等， 在250mL三角瓶中，利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株固态发酵生产壳聚糖酶。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于使用的菌种是宇佐美曲霉EOOl菌株。
3.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于采用的发酵工艺是固态发酵。
4.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于使用的固态发酵培养基配方为250mL三角瓶装IOg基料(麸皮8 10g，豆饼粉0 2g，菜籽饼粉0 Ig)，(NH4) 2S04 50 lOOmg，壳聚糖 0 0. 2g, MgSO4 5 IOmg, CaCl2 5 IOmg, KH2PO4 30 50mg, Tween-80 40mg,自来 7jC 12 15mL，pH 6· 0。
5.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于采用的固态发酵培养条件为发酵培养基 121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳宇佐美曲霉EOOl麸曲种子，34 30°C培养72 96h， 期间分别于16 20h和36 40h各翻曲一次。
专利摘要
一种利用宇佐美曲霉生产壳聚糖酶的方法，属于生物工程技术领域：
。本发明以麸皮、豆饼粉和菜籽饼粉等农副产品为发酵基料，并添加适量的无机氮源、壳聚糖、无机盐和表面活性剂等，利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株固态发酵生产壳聚糖酶。本发明提供了宇佐美曲霉E001菌株实验室小试生产壳聚糖酶的固态发酵培养基配方和培养条件，其成熟发酵曲料的壳聚糖酶活性达到1942～2461U/g干曲。本发明具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低廉、对环境友好以及壳聚糖酶发酵酶活性较高等特点，有利于壳聚糖酶的开发和利用，具有较高的经济和实用价值。
文档编号C12N9/42GKCN102154240SQ201010550873
公开日2011年8月17日 申请日期2010年11月19日
发明者史红玲, 吴静, 唐存多, 李剑芳, 邬敏辰, 陈伟 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan