专利名称:卷烟全烟气染毒的细胞毒性测试方法
技术领域：
本发明涉及卷烟烟气体外毒理学评价研究领域，具体说是一种卷烟全烟气染毒的细胞毒性测试方法。
背景技术：
卷烟烟气的体外毒理学研究已经成为评价吸烟对健康危害的重要手段之一。卷烟烟气是一种由几千种化学物质组成的复杂的气溶胶，烟气成分分布于烟气气溶胶的粒相和气相之中。烟气粒相中的主要有害成分有烟碱、芳香胺类、酚类、烟草特有亚硝胺、多环芳烃类化合物等；co、氮氧化物及挥发性有机化合物等有害成分分布于气相中；醛、酮类羰基化合物，氢氰酸、氨等有害成分于气、粒相中均有分布。同时，随着烟气的陈化时间，烟气成分在气相和粒相之间的分配会有所改变。以往研究中，有关卷烟烟气的体外毒理学研究大多集中于烟气总粒相物的细胞毒性和基因毒性方面，仅研究其中烟气总粒相物的毒性影·响不能够全面真实地反映烟气混合物体系的生物学效应。近年来，对于卷烟烟气中气相组分的收集和体外毒性的测试方法也发展建立起来。加拿大卫生部推荐了进行卷烟烟气总粒相物和气相组分的体外毒性测试方法(Health Canada Official Method T-501 ;T_502 ；Τ-503 )，但是这些方法均是对卷烟烟气中部分组分的毒性效应进行评价。
目前，有关卷烟烟气体外染毒方法国内已有专利公开。专利(公开号CN101671733)是一种改进的卷烟烟气体外染毒方法，该方法通过将烟气粒相部分提取液和气相部分提取液混合后，进行细胞染毒。该方法中，细胞没有处于真实的烟气环境下直接、实时地感受新鲜的卷烟主流烟气，测试结果不能直接反映卷烟烟气实际暴露下的毒性效应。专利(公开号CN101393190)是一种卷烟主流烟气细胞毒性测定方法，该方法是将烟气导入细胞培养瓶中进行染毒，细胞与溶于培养液中的烟气成分间接接触，而对于不溶于培养液的烟气成分无法与细胞接触，使得测试结果不能全面地反映卷烟烟气的细胞毒性。以上两种方法的不足之处在于，无法使培养的细胞与卷烟烟气进行直接且全面、充分地接触。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的不足之处，并基于中性红细胞毒性试验的原理，而建立的一种卷烟全烟气染毒的细胞毒性测试方法。本方法在进行卷烟全烟气暴露时，使用插入式细胞培养皿，从而使培养的细胞处于烟气和培养液的气-液交界面，以到达细胞与卷烟烟气直接、充分接触的目的，可以全面地反映细胞对卷烟烟气的感受，该方法灵敏度高，结果可以较为真实地反映卷烟烟气的细胞毒性。
本发明的目的可通过下述技术措施来实现
本发明的方法包括以下步骤
a、配制实验试剂
⑴生长培养液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml链霉素；[0009](2)0.01 M 磷酸缓冲盐溶液(PBS) :0. 2 g KCl, O. 2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2. 9 gNa2HPO4 · 12H20，加双蒸水至I L，pH 7. 2 7. 4，高压灭菌；
⑶暴露培养液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml 链霉素；
⑷中性红储存液0. 2 g中性红，加双蒸水至100 ml，过滤除菌；
(5)中性红工作液用RPMI-1640稀释至50 μ g/ml ；
(6)中性红提取液50%乙醇，1%冰醋酸，49%双蒸水，现用现配；
b、细胞接种培养
扩增培养的处于指数生长期的中国仓鼠卵巢细胞系CHO细胞经胰酶消化，制备细胞悬液，接种于12 mm插入式细胞培养皿中——Transwell小室，细胞密度为3. 5X IO4个/ Transwell小室，于37°C >5% CO2条件下培养24 h ；
C、卷烟全烟气染毒
细胞培养24 h后，将Transwell小室转移至烟气暴露装置中，吸烟机抽吸卷烟产生的主流烟气，与不同流速的洁净空气混合后排入到烟气暴露装置中，Transwell小室微孔膜上层为烟气环境，下层为暴露培养液，生长在微孔膜上的细胞处于气-液交界面处，于不同稀释比例的卷烟主流烟气中暴露培养；设置4个不同稀释比例的卷烟烟气剂量，每个卷烟烟气剂量组抽吸4支卷烟，对照组细胞暴露于洁净空气中；
烟气剂量以卷烟烟气稀释因子表示，即DF = (TS+Air) /TS
注DF(DilutionFactor),稀释因子；TS(Tobacco Smoke),卷烟烟气(流速);Air,洁净空气(流速)
d、中性红细胞毒性试验，
中性红细胞毒性试验
全烟气暴露结束后，将Transwell小室转入12孔板中，细胞于37°C、5% CO2条件下继续培养24 h，吸去培养液，每孔加入2 ml预热的PBS洗一次，加入2 ml中性红染液，于37°C、5% CO2条件下培养3 h，吸去中性红染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性红提取液，室温下快速振荡2(T30 min,将中性红提取液转入96孔板中(150 μ I/孔)，使用酶标仪检测96孔板上中性红提取液在540 nm波长处的吸光值(A(raw))。计算相对吸光值，
相对吸光值代表细胞存活率；
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e、结果与分析
分析单支卷烟的总粒相物(TPM)的释放量，可以将以稀释因子表示的烟气剂量转换为细胞所感受的TPM总量；绘制卷烟全烟气暴露下细胞毒性的剂量-效应关系曲线。
本发明的有益效果如下[0027]本发明为了使卷烟主流烟气中的粒相部分与气相部分与培养的细胞直接且充分接触，使用了插入式细胞培养皿，当进行卷烟全烟气暴露时，贴壁生长在微孔膜上的细胞处于卷烟烟气与暴露培养液的气-液交界面处，从而解决了以往实验中细胞不能全面感受卷烟全烟气的不足之处；同时，本发明减少了甲醛固定液的固定步骤，使得实验过程更加简便。本发明相比现有技术具有操作简便、灵敏性更高、结果更全面可靠的优点。
图I为实施例I的卷烟的全烟气细胞毒性曲线图。
图2为实施例2的卷烟的全烟气细胞毒性曲线图。
图3为实施例3的卷烟的全烟气细胞毒性曲线图。
具体实施方式
本发明以下将结合实施例作进一步描述
本发明的方法包括以下步骤
a、配制实验试剂
⑴生长培养液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml链霉素；
(2)0.01 M 磷酸缓冲盐溶液(PBS) :0. 2 g KCl, O. 2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2. 9 gNa2HPO4 · 12H20，加双蒸水至I L，pH 7. 2 7. 4，高压灭菌；
⑶暴露培养液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml 链霉素；
⑷中性红储存液0. 2 g中性红，加双蒸水至100 ml，过滤除菌；
(5)中性红工作液用RPMI-1640稀释至50 μ g/ml ；
(6)中性红提取液50%乙醇，1%冰醋酸，49%双蒸水，现用现配；
b、细胞接种培养
扩增培养的处于指数生长期的中国仓鼠卵巢细胞系CHO细胞经胰酶消化，制备细胞悬液，接种于12 mm插入式细胞培养皿中——Transwell小室，细胞密度为3. 5X IO4个/Transwell小室，于37°C >5% CO2条件下培养24 h ；
C、卷烟全烟气染毒
细胞培养24 h后，将Transwell小室转移至烟气暴露装置中，吸烟机抽吸卷烟产生的主流烟气，与不同流速的洁净空气混合后排入到烟气暴露装置中，Transwell小室微孔膜上层为烟气环境，下层为暴露培养液，生长在微孔膜上的细胞处于气-液交界面处，于不同稀释比例的卷烟主流烟气中暴露培养；设置4个不同稀释比例的卷烟烟气剂量，每个卷烟烟气剂量组抽吸4支卷烟，对照组细胞暴露于洁净空气中；
烟气剂量以卷烟烟气稀释因子表示，即DF = (TS+Air) /TS
注DF(DilutionFactor),稀释因子；TS(Tobacco Smoke),卷烟烟气(流速);Air,洁净空气(流速)
d、中性红细胞毒性试验，
中性红细胞毒性试验[0048]全烟气暴露结束后，将Transwell小室转入12孔板中，细胞于37°C、5% CO2条件下继续培养24 h，吸去培养液，每孔加入2 ml预热的PBS洗一次，加入2 ml中性红染液，于37°C、5% CO2条件下培养3 h，吸去中性红染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性红提取液，室温下快速振荡2(T30 min,将中性红提取液转入96孔板中(150 μ I/孔)，使用酶标仪检测96孔板上中性红提取液在540 nm波长处的吸光值(A(raw))。计算相对吸光值，
相对吸光值代表细胞存活率；
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e、结果与分析
分析单支卷烟的总粒相物(TPM)的释放量，可以将以稀释因子表示的烟气剂量转换为细胞所感受的TPM总量；绘制卷烟全烟气暴露下细胞毒性的剂量-效应关系曲线。
具体实施例如下
实施例I某一国产卷烟的全烟气染毒细胞毒性试验。
首先按照上述步骤a配制实验试剂，之后按照上述步骤b进行细胞接种培养，将培养的CHO细胞接种于12mm插入式细胞培养皿中(Transwell小室)，细胞密度为3. 5 X IO4个/ Transwell小室，于37°C、5% CO2条件下培养24 h ;再按照上述步骤c进行卷烟全烟气染毒，即将Transwell小室转入烟气暴露装置中，卷烟样品在深度抽吸条件下抽吸，产生的卷烟主流烟气经洁净空气稀释后导入烟气暴露装置，设置4个不同稀释比例的卷烟烟气剂量(卷烟烟气每口抽吸容量55 ml，每口排出时间2.8 s ;洁净空气流速分别设置为6 L/min、3.5 L/min、I. 25 L/min,O L/min)，每个卷烟烟气剂量组抽吸4支卷烟，对照组细胞暴露于洁净空气中；暴露结束后，按照上述步骤d将Transwell小室转入12孔板中，细胞于37°C、5% CO2条件下继续培养24 h，吸去培养液，每孔加入2 ml预热的PBS洗一次，加入2 ml中性红染液，于37°C、5% CO2条件下培养3 h，吸去中性红染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性红提取液，室温下快速振荡2(T30 min,将中性红提取液转入96孔板中(150μ I/孔)，使用酶标仪检测96孔板上中性红提取液在540 nm波长处的吸光值，计算细胞存活率。单支卷烟的TPM释放量为48. 19 mg/支。
卷烟全烟气的细胞毒性
权利要求
1.一种卷烟全烟气染毒的细胞毒性测试方法，其特征在于所述方法包括以下步骤 a、配制实验试剂 ⑴生长培养液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+.100 u g/ml链霉素； (2)0.01 M 磷酸缓冲盐溶液(PBS) :0. 2 g KCl, 0. 2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2. 9 gNa2HPO4 12H20，加双蒸水至I L，pH 7. 2 7. 4，高压灭菌； ⑶暴露培养液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+.100 u g/ml链霉素； ⑷中性红储存液0. 2 g中性红，加双蒸水至100 ml，过滤除菌； (5)中性红工作液用RPMI-1640稀释至50u g/ml ； (6)中性红提取液50%こ醇，1%冰醋酸，49%双蒸水，现用现配； b、细胞接种培养 扩增培养的处于指数生长期的中国仓鼠卵巢细胞系CHO细胞经胰酶消化，制备细胞悬液，接种于12 mm插入式细胞培养皿中——Transwell小室，细胞密度为3. 5 X IO4个/Transwell小室，于37°C >5% CO2条件下培养24 h ； C、卷烟全烟气染毒 细胞培养24 h后，将Transwell小室转移至烟气暴露装置中，吸烟机抽吸卷烟产生的主流烟气，与不同流速的洁净空气混合后排入到烟气暴露装置中，Transwell小室微孔膜上层为烟气环境，下层为暴露培养液，生长在微孔膜上的细胞处于气-液交界面处，于不同稀释比例的卷烟主流烟气中暴露培养；设置4个不同稀释比例的卷烟烟气剂量，每个卷烟烟气剂量组抽吸4支卷烟，对照组细胞暴露于洁净空气中； d、中性红细胞毒性试验， 中性红细胞毒性试验 全烟气暴露结束后，将TranswelI小室转入12孔板中，细胞于37°C、5% CO2条件下继续培养24 h，吸去培养液，每孔加入2 ml预热的PBS洗一次，加入2 ml中性红染液，于37°C、.5% CO2条件下培养3 h，吸去中性红染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性红提取液，室温下快速振荡2(T30 min,将中性红提取液转入96孔板中，使用酶标仪检测96孔板上中性红提取液在540 nm波长处的吸光值；计算相对吸光值，相对吸光值代表细胞存活率； e、结果与分析 分析单支卷烟的总粒相物(TPM)的释放量，可以将以稀释因子表示的烟气剂量转换为细胞所感受的TPM总量；绘制卷烟全烟气暴露下细胞毒性的剂量-效应关系曲线。
专利摘要
一种卷烟全烟气染毒的细胞毒性测试方法，所述方法在进行卷烟全烟气暴露时，使用插入式细胞培养皿，从而使培养的细胞处于烟气和培养液的气-液交界面，以到达细胞与卷烟烟气直接、充分接触的目的，可以全面地反映细胞对卷烟烟气的感受，该方法灵敏度高，结果可以较为真实地反映卷烟烟气的细胞毒性。本发明为了使卷烟主流烟气中的粒相部分与气相部分与培养的细胞直接且充分接触，使用了插入式细胞培养皿，当进行卷烟全烟气暴露时，贴壁生长在微孔膜上的细胞处于卷烟烟气与暴露培养液的气-液交界面处，从而解决了以往实验中细胞不能全面感受卷烟全烟气的不足之处；同时，本发明减少了甲醛固定液的固定步骤，使得实验过程更加简便。
文档编号C12Q1/02GKCN102140489 B发布类型授权 专利申请号CN 201110025480
公开日2012年12月5日 申请日期2011年1月24日
发明者李翔, 尚平平, 聂聪, 杨松, 王宜鹏, 刘惠民, 谢剑平 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (1),