专利名称:驴或驴源性成分实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域：
，具体涉及一种驴或驴源性成分的检测方法；尤其涉及一种驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法；此外，本发明还涉及检测驴或驴源性成分的引物和探针。
背景技术：
目前畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别检测已涉及到肉食品的工业、进出口贸易、市场及餐饮业等领域。国内外肉食品及饲料贸易市场中的检验检疫工作对高新技术的需求也越来越迫切。同时，各类人畜共患病也困扰着人类的生存健康。因此，研究出一种准确、快速、可靠的鉴别畜禽类动物源性成分的方法，就非常有必要。
目前，为了确定食物及饲料的真实成分，已经开发了很多对动物源性成分鉴别的方法，有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法。
在分子生物学方法中，分子标记技术以其快速、准确、稳定、高效等优点显示出巨大的开发潜力和广阔的应用前景。目前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主要包括核DNA、RNA、线粒体DNA(mtDNA) 、和蛋白质分子标记等。PCR分子标记鉴别检测技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低(几乎所有的样本都可以作为PCR的材料，它只要求样本中有完整的靶序列核酸)，因此，无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧样本，都可以用于PCR扩增。
哺乳动物mtDNA在遗传上相对独立，是双链的超螺旋环状分子，具有基因组小(约16kb)、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒体基因组(哺乳动物约1000 2300个拷贝)等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别畜禽肉食品及饲料动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定易操作等优势。基于动物mtDNA的PCR分子标记技术的上述特点，加之实时荧光PCR的快速、灵敏等特点，因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广阔的前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法。
本发明的目的在于提供一种驴或驴源性成分的扩增引物和探针。
本发明的另一目的是提供一种驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法的扩增条件。
以解决准确、快速、可靠的用实时荧光PCR技术鉴定驴或驴源性成分。
本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现:
(I)设计引物:一种用于实时荧光PCR检测驴或驴源性成分的特异性引物和探针，其主要特点是上下游长度分别为25bp和26bp的核苷酸；探针长度为25bp的核苷酸，并在5’端标记上FAM荧光基因，3’端标记上ECLIPSE淬灭基因，序列如下:
上游引物F: 5 ’ -AATAGCTCTAGCCGTACGGCTAACT-3 ’
下游引物R: 5 ’ -CAGGATAATGAATGTAATAAGGGCTG-3，
探针序列P:5’(FAM)-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-3’ (ECLIPSE)
⑵提取样品DNA。
(3)采用步骤⑴设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。
步骤⑵具体为:按DNA提取试剂盒说明提取样品DNA。
步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为20yL，包括IOyL 2 X realtime PCR Buffer (包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等)，步骤⑴设计的上下游引物F/R各0.4 μ L (终浓度为0.2 μ Μ)，TaqMan探针P 0.4 μ L (终浓度为0.2 μ Μ)，DNA模板2 μ L，超纯水补至20 μ L0
步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为:预变性95°C 30seC ;然后95°C 15sec，60°C 34sec 循环 40 次。
与现有技术相比，本发明的有益效 果在于:近年来随着人们对身体保健需求的日益增强，餐桌上的驴肉，以及阿胶等食品药品的需求不断增大，商家出于经济利益驱使投放大量非驴源性成分制成的商品，导致各类产品真假难辨。因此，研究出准确、快速、可靠的鉴定驴或驴源性成分的方法和技术，对于有效抵御假冒驴源性成分产品，使损害消费者利益的事件得到遏制，同时进一步完善了食品和药品检测体系，加大了对消费者利益的保护力度。同时对于经驴传播的某些疾病也可通过该方法鉴定其成分，从而控制其进出境，来控制这些疾病病原的传播与蔓延。本发明与现有技术相比，其检测的灵敏度也大大提高。
图1为驴或驴源性成分实时荧光PCR检测方法特异性实验图。
图中:A4为驴；B4为马；C4为鸡；D4为鸭；E4为鹌鹑；F4火鸡；G4鸽；H4 ;鸵鸟；A5鹧鸪；B5牛；C5绵羊；D5山羊；E5猪；F5兔；G5鱼；H5鹿；A6鹅；B6狗；C6空白对照。
图2为驴或驴源性成分实时荧光PCR检测方法灵敏性实验图
图中:A8为纯驴肉样品；B8为用猪肉DNAlO倍稀释A8的样品；C8为用猪肉DNAlO倍稀释B8的样品；D8为用猪肉DNAlO倍稀释C8的样品；E8为用猪肉DNAlO倍稀释D8的样品；F8为用猪肉DNAlO倍稀释E8的样品；G8为用猪肉DNAlO倍稀释F8的样品；H8为猪肉DNA样品。
具体实施方式
:
以下对据所示最佳实施例对本发明作进一步详述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1:对驴、马肩、鸭、鹤鹁、火鸡、鴻、能鸟、鹤聘、牛、绵羊、山羊、猪、兔、鱼、鹿、鹅、狗等动物的检测验证实验。
(I)总DNA的提取
采用氯仿抽提法或商业DNA提取试剂盒，提取驴、马、鸡、鸭、鹌鹑、火鸡、鸽、鸵鸟、鹧鸪、牛、绵羊、山羊、猪、兔、鱼、鹿、鹅、狗动物的基因组DNA，提取基因组DNA均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD26(i/OD28(i值均为1.8左右，说明DNA纯度较高符合PCR扩增要求。
(2)实时荧光PCR检测方法特异性引物的设计
比较GenBank中公布的各种动物线粒体基因序列，依据其物种保守序列设计出鉴别检测驴源性成分的荧光PCR特异性引物和探针(只能扩增出驴DNA限制性片段，而扩增不出其它动物DNA限制性片段)，引物和探针分别如下:
上游引物 F: 5 ’ -AATAGCTCTAGCCGTACGGCTAACT-3 ’
下游引物R: 5，-CAGGATAATGAATGTAATAAGGGCTG-3，
探针序列P:5’(FAM)-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-3’ (ECLIPSE)
(3)驴或驴源性成 分实时荧光PCR检测
利用设计的特异性引物和探针，以驴DNA为模板进行PCR扩增。
(3.1)实时荧光PCR反应体系为 20 μ L，包括 10 μ L 2 X real time PCR Buffer (包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等)，可采用商业化的实时荧光PCR反应母液。
(3.2)PCR 反应程序为:预变性 ％°C 3Osec ;然后 ％°C 15sec,60°C 34sec 循环 40次。
进行PCR反应，反应结束后保存文件，打开分析软件，分析实验结果，给出Λ Rn (第η个循环时的荧光增加值)与循环数图像。
(4)引物与探针的特异性验证
利用所设计鉴别检测驴源性成分的特异性引物与探针，分别以驴、马、鸡、鸭、鹌鹑、火鸡、鸽、鸵鸟、鹧鸪、牛、绵羊、山羊、猪、兔、鱼、鹿、鹅、狗等动物的总DNA为模板，进行实时荧光PCR，验证引物的特异性。检测结果如图1所示，Α4出现阳性扩增曲线，其它样品没有驴源性成分DNA，则没有信号，显示上述引物和探针有良好的特异性。
(5)实时荧光PCR的灵敏度验证
用裂解完全的猪肉样对裂解完全的纯驴肉样进行10倍梯度混合，直至10_7，然后按试剂盒说明提取DNA模板，按上述(3)进行实时荧光PCR，结果如图2。可知其检测低限至少可达10_6纯驴肉样DNA浓度，即该引物的灵敏度是10_6纯驴肉样品。
权利要求
1.一种驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)设计引物和探针；
上游引物 F:5’ -AATAGCTCTAGCCGTACGGCTAACT-3’
下游引物 R:5’ -CAGGATAATGAATGTAATAAGGGCTG-3’
探针:5’ -FAM-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-ECLIPSE-3’ (2)提取驴或驴源性产品DNA； (3)采用步骤(I)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。
2.如权利要求
1所述的驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)具体为:按DNA提取试剂盒说明提取样品DNA。
3.如权利要求
1所述的驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为20μ L，包括IOyL含有dNTP，Mg2+以及Taq酶的2Xreal time PCR Buffer，步骤(I)设计的终浓度各为0.2 μ M的上下游引物，终浓度为.0.2 μ M的探针，DNA模板2 μ L，超纯水补至20 μ L0
4.如权利要求
1或3所述的驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为:预变性95°C 30seC;然后95°C 15sec,60 °C 34sec 循环 40 次。
5.一种用于检测驴或驴源性成分的上下游引物和探针的组合产品，其特征在于:
上游引物 F: 5 ’ -AATAGCTCTAGCCGTACGGCTAACT-3，
下游引物 R:5’ -CAGGATAATGAATGTAATAAGGGCTG-3’
探针:5’ -FAM-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-ECLIPSE-3’。
专利摘要
本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域：
，具体涉及一种驴或驴源性成分的检测方法；尤其涉及一种驴或驴源性成分的实时荧光PCR检测方法。本发明旨在鉴别如阿胶等保健品和食品中是否含有驴源性成分。通过设计特异性扩增引物和探针，检测遗传上相对独立，没有重复序列，生物个体内无组织特异性的线粒体DNA，建立了驴或驴源性成分实时荧光PCR检测方法，以达到快速准确检测鉴定驴或驴源性成分的目的。
文档编号C12Q1/68GKCN102311999 B发布类型授权 专利申请号CN 201110255683
公开日2013年7月24日 申请日期2011年8月31日
发明者曹琛福, 宗卉, 张彩虹, 陶虹, 花群义, 秦智锋, 吕建强, 杨俊兴, 阮周曦, 刘建利 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),