通过二硫化物交联进行体外蛋白质合成的方法

专利名称:通过二硫化物交联进行体外蛋白质合成的方法
技术领域：
本发明涉及通过体外转录/翻译系统进行蛋白质合成的方法。更具体而言，本发明涉及通过体外转录/翻译系统高效合成具有分子内或分子间二硫键的蛋白质的方法。
背景技术：
人们试图通过基因重组技术来生产可用作药物或试剂的蛋白质。优选地，考虑到操作的简便性和效率，人们已将诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，霉菌和酵母这样的微生物，诸如蚕这样昆虫，诸如牛这样哺乳动物，以及可栽培植物、昆虫和动物细胞，目前已用于基因重组技术中。通过基因重组技术生产蛋白质的方法已被广泛应用。不过，使用这种方法可能导致，譬如目的蛋白的表达水平低、表达无活性的蛋白及形成聚集物这些问题。因此，需要反复进行诸如检查培养条件、生长条件或诱导条件，或试验多种表达系统这样的试误(trial-and-error)过程。已报道许多蛋白甚至在考察这些条件后，也很难被合成。
与此同时，已知一种不使用这些生物或细胞的蛋白质合成方法，其也被称为“无细胞蛋白质合成”。这种无细胞蛋白质合成系统也描述为“体外转录/翻译系统”。通过该系统，用从大肠杆菌、兔网织红细胞、麦胚细胞或其它类似细胞中所制备的提取物或天然成分对模板基因进行转录/翻译，从而合成蛋白质。无细胞蛋白质合成系统的特征在于可克服使用生物或细胞所遇到的限制。这是因为用该系统可合成干扰生物和细胞功能的蛋白质，可通过96孔板或384孔板的形式合成多种蛋白质，并可同时对多种合成条件进行测试。
但已知即使使用这种无细胞蛋白质合成系统，仍有一个问题，即合成的蛋白质形成了凝聚物而不形成为相应的天然结构。其原因可能是具有分子间和/或分子内二硫键的蛋白质的二硫键不能正确交联。有些蛋白质具有分子间和/或分子内二硫键，而有些没有。许多转运并分泌到细胞表面或细胞外环境的蛋白质具有二硫键。而这些蛋白质具有特别重要的应用价值。例如，诸如胰岛素、细胞因子和血细胞生长因子等绝大多数已商品化的蛋白质制品，其组分中都含有具有分子间二硫键的蛋白。
因此，为了高效生产这种具有分子间/分子内二硫键的蛋白质，对无细胞蛋白质合成系统进行了改进。例如，已进行了以下方法向细胞提取物中加入微粒体组分的方法(非专利文献1Biochem.J.254805-810(1988)，下文以现有技术1表示)；对细胞提取物进行透析的方法，添加氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的方法，凝胶过滤的方法，调节氧化-还原(redox)电势的方法(非专利文献2FEBS Lett.514290-4(2002)；非专利文献3Nature Biotech.1579-84(1997)；专利文献1JP Patent Publication(Kokai)No.2003-116590；专利文献2WO 03/072796 A1，下文以现有技术2表示)。
而且已知一种使用了可维持还原态的酶的缺失变异体来形成二硫键的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.9613703-13708(1999)，下文以现有技术3表示)。通过该方法，目的蛋白可用缺失硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的大肠杆菌进行表达。但通常缺失这种酶的细胞系生长非常缓慢，或者需要特殊的培养条件，这在工业实用性上是很大的障碍。这种方法利用可在大肠杆菌中导致基因重组的系统来表达蛋白。不过如上所述，对生物的直接使用存在多种限制。此外，许多生物除硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶外，还含有许多未被鉴定的可控制氧化-还原反应的酶和底物(非专利文献4Nature ReviewMolecular Cell Biology 3836-847(2002))。因此，即使外源蛋白可用这种缺失变异体进行表达，或用以缺失变异体的细胞提取物为无细胞蛋白合成系统来进行蛋白质合成，也很难形成稳定的二硫键。因此，报道了一种用碘乙酰胺处理细胞提取物以灭活这些酶和底物的方法(US 6,548,276 B2，下文以现有技术4表示)。根据该方法，不仅可灭活谷胱甘肽还原酶和氧还蛋白还原酶，而且也可以灭活多种控制细胞内氧化-还原反应的酶和底物。但由于碘乙酰胺以非特异形式修饰硫醇，因此它也可能修饰转录/翻译相关的因子和酶基团、核糖体蛋白及类似物质。从而产生的问题是体外蛋白合成反应的高效性和精确性被破坏。
同时，与已广泛使用的、用生物和细胞通过重组方式来合成蛋白的方法一样，化学合成的肽或通过无细胞蛋白合成系统合成的蛋白质也可用变性剂进行完全变性，然后对其进行再生(非专利文献5Biochemistry 263129-3134(1987)，下文以现有技术5表示)。在现有技术5中，由于蛋白质是化学合成的、或即使使用生物体也是以无活性的不可溶形式回收的，因此可生产例如毒素蛋白。当蛋白质再生时，不再使用细胞，试剂和盐可相互自由结合，从而在具有二硫键的蛋白质中正确地引入二硫键。但当使用该方法时也有一些问题，需要不同的步骤来进行蛋白质合成和蛋白质结构再生，而蛋白质结构再生是耗时的步骤(需要几天到一周的时间)。
另外，根据众所周知的测定催化促进和/或异构化二硫键的酶的活性的方法，用作底物的核糖核酸酶A(RNaseA)被还原而变性，RNaseA与某种测定了活性的酶一起再折叠并再生后测定其活性，所获得的核糖核酸酶活性可作为一个指标(非专利文献6Biochem J.1976159377-384)。
专利文献1JP Patent Publication(Kokai)No.2003-116590 A专利文献2WO 03/072796 A1专利文献3US 6,548,276 B2非专利文献1Biochem.J.254805-810(1988)非专利文献2FEBS Lett.514290-294(2002)非专利文献3Nature Biotech.1579-84(1997)非专利文献4Nature Review Molecular Cell Biology 3836-847(2002)非专利文献5Biochemistry 263129-3134(1987)非专利文献6Biochem J.159377-384(1976)
发明内容
[蛋白质合成]传统的无细胞蛋白质合成系统在生产具有分子内和/或分子间二硫键的蛋白时具有下列缺点。在现有技术1中，要考虑到必须从胰腺或者其它部位通过匀化和离心的方式来制备微粒体部分；微粒体部分是通过破坏被称作内质网——二硫键最初就是在这里形成的——的细胞器来获得的，这样微粒体部分中形成二硫键的效率要低于内质网；并且形成的二硫键与天然状态会有所差异，因此可能会观察不到蛋白活性——这是个问题。在现有技术2中，无需制备微粒体部分，可通过诸如添加氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽或者透析这样的简单方法来制备细胞提取物。不过，难以制备具有很好重复性的氧化-还原状态从而使得二硫键可以高效交联的反应液。这是因为通常用作无细胞蛋白质合成系统的细胞提取物含有多种类型的处于还原态的酶和底物，包括硫氧还蛋白还原酶[EC 1.6.4.5]和谷胱甘肽还原酶[EC 1.6.4.2](Nature Review Molecular Cell Biology 3836-847(2002))。因此，认为这些酶和底物的功能在调节氧化-还原态时会出现困难，即便经透析或添加谷胱甘肽也如此。当向无细胞蛋白质合成系统中加入诸如氧化型谷胱甘肽(GSSG)这样的氧化剂时，可使用GSSG和还原型谷胱甘肽(GSH)的氧还缓冲液。GSSG∶GSH的比例一般在1∶5到1∶10之间。该比例基于氧化剂浓度以及从多项研究中所获得的比例，在这些研究中，先将RnaseA或溶菌酶还原变性进行再折叠，由此检测结构与活性之间的相互关系(Biochemistry 1991 30613-619；Biochemistry 197095015-5023))。因此，该比例对于无细胞蛋白质合成系统而言并非一定合适。此外，术语“氧化-还原电位”指的是由于氧化型与还原型之间化学电位差异形成的电位，通过在可实现可逆电转移的平衡态中使用诸如铂电极这样的电极来测量。该电位只是基于参与溶液中氧化还原反应的多种有机/无机物(例如，氧、金属、半胱氨酸和亚铁血红素)在氧化还原平衡态时的电位的观察资料获得的。因此，它并不是一个能够表现硫醇和二硫化物之间平衡态的指标，并不反应蛋白质的氧化还原状态。所以，即便氧化-还原电位能够如现有技术2中所示那样轻易调节到给定水平，想要调控蛋白质中二硫键的形成也是非常困难的。
在现有技术1和2两个实例中，问题在于蛋白合成效率会降低。这是因为当细胞提取物经过诸如添加微粒体、透析或者添加氧化型谷胱甘肽及还原型谷胱甘肽等处理后，其细胞内环境与最初进行蛋白合成的细胞内环境相比已经发生了变化。因此，无细胞蛋白质合成系统在工业水平上的应用非常困难。
本发明人已经揭示了一种方法，其中构成体外DNA转录/翻译系统或者RNA翻译系统反应液中的部分或者全部蛋白组分，均用一对可彼此附着的物质中的一个来标记(JP Patent Publication(Kokai)No.2003-102495 A，即下文中的重构蛋白质合成系统(再構成タンパク質合成系)。该方法与传统无细胞系统及体外蛋白质合成系统(即下文中的无细胞蛋白质合成系统)完全不同。具体而言，该方法的特点在于在不使用细胞提取物的情况下纯化与蛋白合成相关的不同组分，通过重构合成蛋白质，由此可以合成或者快速纯化不具有分子内二硫键的蛋白(Nature Biotechnology 19732-734(2001))。但并没有关于具有分子内/分子间二硫键的蛋白，由不同组分以怎样的浓度重构可使得它们能具有原始结构和功能，并且可高效合成。
因此，期待出现一种更方便、且可有效生产具有分子内和/或分子间二硫键的蛋白质的方法。本发明的目的就是提供一种通过使用重构蛋白质合成系统，可方便、高效生产具有二硫键的蛋白质的方法。
上述传统方法的问题是需要将RNaseA进行暂时变性，而且再折叠的步骤比较耗时。
本发明的发明人为了达到上述目的进行了深入的研究，从而发现通过使用除去了影响氧化还原状态的酶和底物、并能够人工调节二硫键和硫醇之间的氧化还原平衡状态的重构蛋白质系统可高效合成具有原始结构和活性的、含有分子间/分子内二硫键的蛋白。该体系可代替细胞提取物或粗组分，所述细胞提取物或粗组分由于含有多种硫氧还蛋白还原酶[EC 1.6.4.5]和谷胱甘肽还原酶[EC 1.6.4.2]等维持还原状态的酶和底物而使氧化还原状态难以调节。
另外，本发明的发明人发现由纯度90％或以上的核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水所组成的重构蛋白质合成系统是特别优选的。从而完成了本发明。
一般来说，在细胞内的蛋白合成位点，氧化还原状态接近于还原态，因此细胞中合成的蛋白是还原态的。在无细胞蛋白合成系统中，再现了这种细胞内的状态，因此在体系中通常含有DTT和其它还原剂。不过也报道当不含有还原剂时，则不利于提取物的保存或降低翻译效率(Eur.J Biochem.2704780-4786(2003))同时，与硫醇形成二硫键也不需要还原态。因此，希望除去体外转录/翻译体系中作为还原剂的DDT，或降低加入到该体系中的DTT的量，以在蛋白中形成二硫键。但如上所述，其得到的效果有限。
另一方面，根据本发明的方法，既然在重构蛋白质合成系统中影响二硫键和硫醇平衡状态的组分的量是可以确定的，因此可加入几μM到1mM的量DTT。另外，也可以不加入DTT。
另外，一般认为使用不含DTT的无细胞蛋白质合成系统的传统方法，即使在蛋白质可形成二硫键的条件下，合成的蛋白质量也会降低，而且合成有活性的目标蛋白的效率被削弱。但令人惊讶的是，当使用本发明所述的重构蛋白质合成系统时，合成的蛋白质量不发生改变，甚或会增加，从而可高效合成蛋白质。
换句话说，与传统方法不同，本发明提供了一种高效合成具有二硫键的蛋白质的方法，其中蛋白质合成试剂包含特定存在量和纯度、且不含影响氧化还原状态的杂质的核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水再生的，不使用无细胞提取物；而且重构蛋白质合成系统质的二硫键和硫醇间的氧化还原平衡是可人工调节的。
另外，优选地，经重构的上述蛋白质合成基本试剂，使其含有特定量的、高度纯化的且纯度为90％或以上的核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。蛋白质合成基本试剂例如可以使用除去了DTT的Pure system(PostGenome Institute Co.，Ltd.)。根据上述的蛋白质合成方法，可通过向上述蛋白质合成试剂中加入(i)调节氧化还原状态的试剂和/或(ii)催化氧化还原反应的酶而人工调节二硫键和硫醇间的氧化还原平衡。可在反应起始前、反应中或反应后加入这些物质。
更具体而言，(i)作为调节氧化还原状态的试剂，包括例如DTT和氧化型谷胱甘肽。另外，(ii)作为催化氧化还原反应的酶的实例，包括蛋白质二硫键异构酶和二硫键交换蛋白。
此外，本发明的蛋白质合成方法可用作生产蛋白质的方法。
进一步，本发明提供了一种检测方法，包括测定生产的蛋白质的活性、加入的催化氧化还原反应的氧化还原酶试剂添加量和加入的氧化还原试剂的添加量之间的关系。蛋白质合成试剂是由预定的、特定存在量和纯度的核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水重构的。优选地，可以变更蛋白质合成试剂中可催化氧化还原反应的氧化还原酶试剂和氧化还原试剂的量。如上所述，通过向重构蛋白质合成系统中加入可改变氧化还原平衡状态的试剂至所需的终浓度，则可以在生产的蛋白质中形成或不形成二硫键交联。
换句话说，根据本发明通过重构蛋白质合成系统正确地了解所生产的蛋白质形成所需的二硫键交联的条件。因此得到的信息可作为上述蛋白质合成条件。
可在反应起始前、反应中或反应终止后加入氧化还原酶试剂和氧化还原试剂。
氧化还原酶试剂的实例包括DTT和GSSG。氧化还原试剂的实例包括蛋白质二硫键异构酶和二硫键交换蛋白。
可提前制备不同浓度的试剂，并在反应起始前(加入模板核酸前)、反应中或反应终止后加到各反应体系中。
具体而言，可以使用前述蛋白质合成系统通过上述方法来进行活性测定，但要在翻译时或翻译后加入已测定活性的催化促进和/或异构化二硫键的酶。作为底物的蛋白质是以编码该蛋白质的模板DNAs或RNA加入的。用作底物的蛋白质类型没有特别限定。优选地，这种蛋白质具有已知的结构，更优选地，它们是酶类。这种底物的实例包括溶菌酶和碱性磷酸酶。另外，根据本方法，可测定促进二硫键形成和/或催化二硫键异构化的酶活性，而另一方面，可筛选抑制所述活性的底物。对于筛选而言，可使用催化促进二硫键形成或催化二硫键异构化的酶与检测底物进行筛选。
进一步，本发明包括由以下(1)a)和b)、(2)a)和c)或(3)a)，b)和c)所组成的试剂盒a)包含具有特定的存在量和纯度的多种组分的、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成反应基本试剂；b)至少一种具有特定的存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；及c)至少一种具有特定的存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂。
具体而言，根据本发明，提供一种包含以下a)到c)的试剂盒a)包含具有特定的存在量和纯度的核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水的蛋白质合成反应基本试剂，而且在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质；b)至少一种具有特定的存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；及c)至少一种具有特定的存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂。
本发明描述包括作为本申请优先权基础的日本专利申请No.2004-136520的说明书和/或附图等处所述的部分或全部内容。
附图简要描述图1所示的是核糖体粗提取物的6％到36％蔗糖密度梯度组分。
图2所示的是经12％SDS-PAGE/考马斯亮兰染色的His标记的丙氨酰-tRNA合成酶(AlaRS)、精氨酸tRNA合成酶(ArgRS)、天冬酰氨tRNA合成酶(AsnRS)、天冬氨酸tRNA合成酶(AspRS)、半胱氨酸tRNA合成酶(CysRS)、谷氨酰胺tRNA合成酶(GlnRS)和谷氨酸tRNA合成酶(GluRS)的照片。
图3所示的是合成的人溶菌酶的电泳照片(键头指示合成的人溶菌酶)。
图4所示的是合成的人溶菌酶的比活性。
图5所示的是合成的mIL6蛋白质的量。
图6所示的是合成的DHFR蛋白质的量。
图7所示的是合成的人溶菌酶的比活性(PDI浓度的影响)。
图8所示的是合成的人溶菌酶的比活性(存在0.13μM PDI时DTT浓度的影响)。
图9所示的是合成的碱性磷酸酶的活性(存在0.13μM PDI和1mMDTT时GSSG浓度的影响)。
图10所示的是合成的碱性磷酸酶的活性(存在PDI时DTT浓度变化的影响)。
图11所示的是合成的溶菌酶的活性(加入或不加DsbC的影响)。
图12所示的是合成的碱性磷酸酶的活性(本发明的方法与使用细胞提取物的方法的比较)。
图13所示的是EF-Tu洗脱组分的电泳照片。
图14所示的是纯化的DsbA(泳道1)和DsbC(泳道2)的电泳照片。
发明的优选实施方案以下对本发明的优选实施方案进行详细描述，但本发明不限于以下的优选实施方案。另外，所有修改和变化都在本发明的范围内。
本发明的体外DNA转录/翻译体系或RNA翻译体系包括加入诸如mRNA、cDNA等可编码目标蛋白的模板的蛋白质合成的基本组分的蛋白质合成试剂、和(i)用来人工调节二硫键和硫醇间的氧化还原平衡的调节氧化还原状态的试剂、和/或(ii)催化氧化还原的酶。
本发明的方法包括合成具有分子内或分子间二硫键的蛋白质的方法，包括用(1)包含以下a)和b)的反应体系，(2)包含以下a)，b)和c)的反应体系，(3)包含以下a)，b)和d)的反应体系，(4)包含以下a)，b)，c)和d)的反应体系a)至少一个编码目标蛋白的模板核酸；b)蛋白质合成反应的基本试剂，其包含具有特定存在量和纯度的多种成分，在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质；c)至少一种具有特定存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；及d)至少一种具有特定存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂。
蛋白质合成基本试剂，特征在于其组分包括具有特定存在量和纯度的核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。但不必包括以上所有组分，可以根据需要选择性地包含上述组分。
用于构建体系的组分不必包括细胞提取物或细胞提取物的粗成分。另外，期望能够计算影响蛋白质二硫键形成的物质的浓度。
在本发明的重构蛋白质合成系统中，构建体系的所有组分都是重构的。因此很容易确定这些组分并计算其含量。
本发明的蛋白质合成基本反应试剂可用于进行DNA转录/翻译或RNA翻译等用于蛋白质合成的反应系统。在本发明中，术语“蛋白质”是指两个或多个氨基酸通过肽键相互连接，包括肽、寡肽和多肽。术语“RNA”包括化学合成的RNA和mRNA。术语“DNA”包括合成的DNA、DNA载体、基因组DNA、PCR产物和cDNA。
本发明的蛋白质合成基本反应试剂，包括具有特定存在量和纯度的组分，各组分指分别进行纯化、其浓度可测定且可以定量的组分。在本发明中，具有特定存在量和纯度的多种组分，是那些通过诸如盐析、色谱、电泳、溶解度差异、重结晶和离心等纯化物质的方法分别进行纯化的物质。这些通过色谱、电泳、质量分析、离心等类似分析方法所获得的物质的纯度均在约80％或以上，更优选地在90％或以上。例如，对蛋白质而言，主要通过色谱进行纯化，其纯度通过SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)进行测定。对核糖体而言，主要通过超离心纯化，其纯度通过超离心沉降分析而测定。核糖体是一种聚合的分子，分子量为几百万，包括大量RNA分子(原核生物中有3种RNA分子23S、5S和16S；真核生物中有4种RNA分子28S、5.8S、5S和18S)和大量核糖体蛋白(原核生物中约50种，真核生物中约80种)。由于是聚合的分子，故可通过沉降分析来鉴定并测定其纯度。另外，tRNAs通常是包含74到94个核苷酸并具有多种核苷酸序列的分子，可通过电泳来分离鉴定分子，并测定260nm和280nm处吸光度而测定其纯度。另外，低分子量物质例如氨基酸和盐可通过常规方法例如色谱、融点测定、元素分析和质量分析进行鉴定，并测定其纯度。
作为蛋白质合成基本试剂的用于转录/翻译的因子和酶的实例，不仅包括来源于大肠杆菌等原核细胞中的物质，而且也包括来源于真核细胞的物质(1)对基于RNA的翻译而言，包括核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、tRNAs、三磷酸腺苷(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、氨基酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水，对于来源于大肠杆菌等原核细胞的反应体系进一步包括甲硫氨酰tRNA转移酶；及(2)对基于DNA的转录/翻译而言，除了(1)，还包括尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)和诸如T7 RNA聚合酶之类的RNA聚合酶。
构建本发明的反应体系的各种类型的因子和酶在大肠杆菌、霉菌、酵母和培养细胞等生物体内均存在。因此，可分别高效纯化这些物质作为组分。但优选地是使用重组产物，因为这可以大规模地获得各种蛋白质，而且会减少未知的、不必要的或抑制性组分被引入反应体系的可能性。
具体而言，将编码起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶或RNA聚合酶的基因连接到合适的载体上，然后转化大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、霉菌、酵母或类似系统进行表达诱导。 然后纯化蛋白质，获得构建本发明的反应体系的组分。当用转化子产生各种类型的因子和酶时，蛋白质可完整表达或以融合蛋白的形式表达。融合蛋白的实例包括组氨酸标签(以下以His-Tag表示)、strept-Tag、GST-Tag和FLAG-Tag(Appl Microbiol Biotechnol.60(5)523-533(2003))。
根据需要可从多种方法中选择使用已知的His-Tag和镍柱来纯化His标记的蛋白质组分。作为实例，这种方法简要描述如下1.通过基因工程技术获得目标蛋白N末端结合了His-Tag(含6个His)的融合蛋白；2.在冰上超声破碎表达His标记蛋白的细胞，并将细胞悬浮于上样缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH 8.0)中；3.将细胞裂解液进行离心(30,000g，4℃，30分钟)分离；4.向上述获得的上清中加入用冰冷上样缓冲液平衡的50％Ni2+-NTA浆(Qiagen公司制)，4℃搅拌1小时；
5.将树脂上样到柱上，然后用20倍柱体积的上样缓冲液在4℃洗涤柱；6.用20倍柱体积的上样缓冲液(含10mM咪唑，pH 8.0)在4℃洗涤柱；及7.用20倍柱体积的上样缓冲液使目标蛋白从柱上洗脱下来，收集组分(每份1ml)，并通过SDS-PAGE确定目标蛋白，其中，所述缓冲液中咪唑浓度梯度设定为从10到250mM。
更优选地，在上述蛋白质纯化后，向本发明的反应体系中加入以下不直接参与蛋白质合成反应的、构建反应体系的各种因子和酶如肌酸激酶、肌激酶和核苷二磷酸激酶等与能量再生相关的酶；及诸如无机焦磷酸酶这样的降解转录/翻译反应所产生的无机焦磷酸的酶。
此处，盐必须含有转录/翻译所需的阳离子和阴离子。通常使用包括谷氨酸钾、氯化铵、醋酸镁和氯化钙等。除了上述盐类，也可以选择使用其他合适的盐。水包括不含离子、微生物、酶的水，例如用Milli-Qsystem(Millipore)生产的水制备装置制备的水及商品化的纯水。
核糖体是肽合成的场所。当其与mRNA结合时，氨酰tRNA位于核糖体A位点，而甲酰甲硫氨酰tRNA或肽酰tRNA位于P位点，从而形成肽键(Science 289920-930(2000))。在本发明中，只要是具有这种功能的核糖体即可，与其来源无关。可用的实例包括来源于大肠杆菌的核糖体和来源于真核细胞的核糖体。优选地，本发明所用的核糖体来源于如大肠杆菌A19菌株和大肠杆菌MRE600菌株等大肠杆菌。
作为本发明的体外蛋白质合成系统中的起始因子是形成翻译起始复合物所必需的，或明显促进翻译起始复合物形成的因子，可使用那些已知来源于大肠杆菌的因子，譬如IF1、IF2和IF3(Biochemistry295881-5889(1990))。起始因子IF3启动作为翻译起始的必要步骤的70S核糖体解离为30S亚基和50S亚基。另外，它在翻译起始复合物形成时抑制除了甲酰甲硫氨酰tRNA外的其他tRNA插入到P位点。起始因子IF2与甲酰甲硫氨酰tRNA结合，并将甲酰甲硫氨酰tRNA运送到30S核糖体亚基的P位点，从而形成翻译起始复合物。起始因子IF1促进起始因子IF2和IF3的功能。本发明中所用的起始因子的优选实例包括来源于例如大肠杆菌K12菌株等大肠杆菌的起始因子。另外，也可使用来源于真核细胞的起始因子。
共有两种类型的EF-Tu延伸因子GTP和GDP。GTP与氨酰tRNA结合，将其转运到核糖体的A位点。当EF-Tu离开核糖体时，GTP被水解转变为GDP(EMBOJ.177490-7497(1998))。同时，延伸因子EF-Ts与EF-Tu(GDP)结合，促进GDP转化为GTP(Archives ofBiochemistry and Biophysics 348157-162(1997))。另外，延伸因子EF-G在肽链延伸过程中肽键形成后促进转位反应(Nature StructureBiology 6643-647(1999)；FEMS Microbiology Reviews 23317-333(1999))。本发明所用的延伸因子的优选实例是来源于大肠杆菌的延伸因子，例如来源于大肠杆菌K12菌株的延伸因子。另外，也可使用来源于真核细胞的延伸因子。
终止因子是在蛋白质合成终止、翻译的肽链解离并开始后续的mRNA翻译的过程中核糖体再生所必须的。当在没有终止因子的反应体系中进行蛋白质合成时，反应在终止密码子之前停止，从而形成核糖体、肽和mRNA的稳定复合物(多聚体展示方法、核糖体展示方法和体外病毒方法)。另外，通过从反应体系中省略RF1和/或RF2而可向肽链中引入非天然氨基酸。换句话说，当分别省略RF1和RF2时，可分别在UAG密码子和UGA密码子处高效引入非天然氨基酸。
当终止密码子(UAA、UAG或UGA)来到核糖体的A位点时，终止因子RF1和RF2移动到A位点以促进肽链从肽酰tRNA(位于P位点)解离。RF1可识别终止密码子UAA和UAG，而RF2可识别UAA和UGA。终止因子RF3可在RF1和RF2引起肽链解离后将RF1和RF2从核糖体上解离下来。核糖体循环因子(RRF)促进在P位点的tRNA在蛋白质合成终止后解离下来，使核糖体再生以进行后续蛋白质合成。在本发明中，RRF也被看作是一种终止因子。另外，在EMBOJ.164126-4133(1997)和EMBOJ.164134-4141(1997)中解释了RF1、RF2、RF3和RRF终止因子的功能。本发明所用的终止因子的优选实例是来源于例如源自大肠杆菌K12菌株等大肠杆菌的终止因子。另外，也可使用来源于真核细胞的终止因子。
氨酰tRNA合成酶是一种在ATP存在下通过将氨基酸与tRNA共价连接而合成氨酰tRNA的酶(RNA 3954-960(1997)；Protein，NucleicAcid and Enzyme，391215-1225(1994))。本发明所用的氨酰tRNA合成酶的优选实例是来源于诸如自大肠杆菌K12菌株等大肠杆菌的氨酰tRNA合成酶。另外，也可使用来源于真核细胞的氨酰tRNA合成酶。另外，也可使用识别非天然氨基酸的人工氨酰tRNA合成酶(JP PatentNo.2668701)。
甲硫氨酰tRNA转移酶(MTF)是一种将甲酰基连接到甲硫氨酰tRNA氨基上而合成N-甲酰甲硫氨酰(fMet)tRNA进行原核生物蛋白质合成的酶。即甲硫氨酰tRNA转移酶可使N10-甲酰基叶酸的甲酰基转移到对应于起始密码子的甲硫氨酰tRNA的N末端，形成fMet-tRNA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96875-880(1999))。增加的甲酰基可被起始因子IF2识别，作为蛋白质合成的起始信号。MTF不存在于真核细胞质中的合成系统中；但存在于真核线粒体和叶绿体合成系统中。本发明所用的MTF的优选实例是来源于诸如自大肠杆菌K12菌株等大肠杆菌的MTF。
RNA聚合酶是一种将DNA序列转录为RNA的酶，存在于各种生物中。其中一个实例是来源于T7噬菌体的T7 RNA聚合酶。该酶可与称为T7启动子的特异DNA序列结合，将下游的DNA转录为RNA。本发明的发明人在T7 RNA聚合酶的N末端加入一个His-Tag，从而可在大肠杆菌BL21细胞系中以融和蛋白的形式大量表达聚合酶，并用镍柱通过亲和层析进行纯化。在本发明中，可与T7 RNA聚合酶一样使用其它类型的RNA聚合酶。例如，在本发明中可使用商品化的T3RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
氨基酸的实例包括天然或非天然氨基酸和带有天然或非天然氨基酸的tRNA。当用这种带非天然氨基酸的tRNA时，可将非天然氨基酸引入到蛋白质中。
所用的tRNA的实例包括从大肠杆菌、酵母和类似物质中纯化的tRNA。另外，可使用反义密码子或其它碱基被选择性修饰的人工合成的tRNA(J.Am.Chem.Soc.12134-40(1996)，Nature Biotech.20177-182(2002))。例如，当以CUA为反义密码子的tRNA带有非天然氨基酸时，则作为终止密码子的UAG可被翻译为非天然氨基酸。用这种方法可通过位点特异的方式在蛋白质中引入非天然氨基酸。
另外，通常使用磷酸钾缓冲液(pH 7.3)作为缓冲液。
影响二硫键形成的物质的实例包括可催化二硫键氧化还原反应的氧化还原酶和/或可调节二硫键氧化还原状态的氧化还原试剂。更具体而言，影响二硫键形成的酶和/或试剂的实例包括(i)催化氧化还原的酶，例如包括谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶、蛋白质二硫键异构酶、二硫键交换蛋白和硫氧还蛋白样蛋白的蛋白质；和/或(ii)调节氧化还原状态的试剂，例如低分子量化合物，包括还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、DTT、2-巯基乙醇和硫氧还蛋白。本发明中的术语“氧化还原试剂”是指可将二硫键还原为硫醇或将硫醇氧化形成二硫键的试剂。
优选地，促进/调节蛋白质中二硫键交联的酶和/或底物可用作影响二硫键形成的物质的(i)氧化还原酶(催化氧化还原反应的酶)和/或(ii)氧化还原试剂(可调节氧化还原状态的试剂)，。另外，在翻译反应中不必加入(i)催化氧化还原反应的酶和/或(ii)调节氧化还原状态的试剂，其可在反应终止后加入这些试剂。优选地，当在翻译终止后加入这些试剂时，应在加入后将其放置在37℃几十分钟到约1小时。
当DTT用作调节氧化还原状态的试剂时，其浓度为0到1mM，优选地为0.001到0.5mM，更优选地为0.060到0.5mM。
当氧化型谷胱甘肽作为调节氧化还原状态的试剂时，其浓度为0到8mM，优选地为0.1到4mM，更优选地为1到4mM。
根据上述蛋白质合成的方法，二硫键交换蛋白优选地为DsbA和/或DsbC。
蛋白质二硫键异构酶(EC 5.3.4.1.)是一种分子量约为55 kDa的酶，存在于真核生物的内质网内壁，可催化二硫键的形成、异构化和/或还原反应。还认为该蛋白质具有分子伴侣类似的活性。如上所述，该蛋白质可在从生物中纯化后用作组分。而且可通过重组合成的方法获得该蛋白质。例如，可使用从牛肝纯化的蛋白质二硫键异构酶(PIRdatabase accession no.ISBOSS)或通过使用大肠杆菌重组表达酵母的蛋白质二硫键异构酶基因而获得的纯化蛋白质。
另外，已知以下蛋白质是蛋白质二硫键异构酶，它们可用作本发明的蛋白质二硫键异构酶人蛋白质二硫键异构酶(PIR database accession no.ISHUSS)；人蛋白质二硫键异构酶相关的蛋白质(GenBank accession no.4758304)；和酵母蛋白质二硫键异构酶同系物(PIR database accessionno.A44483)。
至于二硫键交换蛋白，有四种类型分别称为二硫键交换蛋白A、B、C和D(DsbA、B、C和D)的蛋白质存在于大肠杆菌等。DsbA是一种21 kDa具有类似硫氧还蛋白折叠结构的酶，可催化二硫键的形成。DsbB是20kDa的蛋白质，具有四个跨膜区和两个周质区。DsbB可维持DsbA的氧化状态。DsbC是一种周质蛋白，可形成同型二聚体，具有类似硫氧还蛋白的折叠。DsbC是一种主要负责二硫键异构化、并作为分子伴侣的酶。DsbD是一种分子量59 kDa的蛋白质，包括2个周质区和8个跨膜区。DsbD的功能是可维持半胱氨酸作为处于还原状态的DsbC的活性中心。
已知以下蛋白质是二硫键交换蛋白，可用作本发明的二硫键交换蛋白大肠杆菌的DsbA(SWISS-PROT protein database accession no.P24991)；大肠杆菌的DsbC(SWISS-PROT protein database accession no.P21892)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的蛋白质二硫键异构酶dsbA同系物(PIR database accession no.S32895)；脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的硫醇-二硫键交换蛋白dsbA同系物NMB0278(PIR database accession no.C81217)；线虫(Caenorhabditis elegans)的蛋白质二硫键异构酶I型异构体(GeneBank accession no.AAB94647)；和Datisca glomerata的蛋白质二硫键异构酶同系物(GeneBankaccession no.AAD28260)。
如上所述，可从微生物中纯化这些二硫键交换蛋白作为组分，而且它们也可以通过重组方法来获得。
当使用蛋白质二硫键异构酶(PDI)作为氧化还原酶时，其浓度优选地是0到10μM，更优选地是0.001到5μM，进一步优选地是0.001到2μM。当用二硫键交换蛋白作为氧化还原酶时，其浓度优选地是0到10μM，更优选地是0.01到10μM，进一步优选地是0.1到10μM。
另外，优选地，二硫键交换蛋白包含最低量的谷胱甘肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶。优选地，硫氧还蛋白还原酶和/或谷胱甘肽还原酶在构成蛋白质合成系统的组分中的含量为100ng/ml或更少。
另外，如上所述的各组分纯度的测定方法将在下面举例说明。
可通过以下方式计算纯度上述含有诸如起始因子、延伸因子、终止因子、甲硫氨酰tRNA转移酶、DsbA和DsbC这样的蛋白质的组分，通过His-Tag和镍柱纯化His标记蛋白的方法进行纯化；通过SDS-PAGE确定目标蛋白；通过光密度计测定每个泳道的电泳图谱。
纯化的核糖体的纯度可通过蔗糖密度梯度分析进行测定。
通常已商品化的试剂，譬如tRNAs、氨基酸、核糖核苷三磷酸、FD、其它类型的缓冲液、DTT和氧化型谷胱甘肽，可按这种试剂商品化形式的纯度使用。另外，所有这些商品化的试剂纯度均为80％或以上。
对于本发明的检测方法，可使用[合成具有分子内或分子间二硫键的蛋白质的方法]所述的反应体系。
本发明的检测方法包括测定氧化还原酶浓度、氧化还原试剂浓度与至少含有一个肽链的合成蛋白质的活性之间的相关性，其中，所述的合成蛋白质可通过一个二硫键形成交联，而且基于这种交联形式可调节其活性。通过包含以下a)到d)，和具体地(1)a)，b)和c)，(2)a)，b)和d)，和(3)a)，b)和c)和d)的反应体系进行检测a)至少一个模板核酸；b)包含多种具有特定的存在量和纯度、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的组分；c)至少一种具有特定的存在量和纯度的、可催化二硫键氧化还原的氧化还原酶；及d)至少一种具有特定的存在量和纯度的、调节二硫键氧化还原状态的氧化还原试剂。
测定通过以上反应体系合成的蛋白质的活性，从而测定添加的c)氧化还原酶和d)氧化还原试剂之间的相关性。所测定的蛋白质的活性不仅限于酶活性，还可包含例如，受体和蛋白质的结合活性、细胞增殖活性、结合活性和细胞增殖活性之间的比活性等活性。
更具体而言，制备各种浓度的c)氧化还原酶和d)氧化还原试剂，其中c)和d)均可只含有单一物质或者是多种物质的混合物。这种氧化还原酶的实例包括蛋白质二硫键异构酶、二硫键交换蛋白和同系物的酶类。这种氧化还原试剂的实例包括DTT、GSSG、GSH和硫氧还蛋白。然后起始蛋白合成反应。此处，c)和d)可在蛋白质合成反应开始时加入，也可以在合成反应中加入，或者在合成反应停止后加入。当在合成反应终止后加入c)和d)时，优选地，产物在加入后置于37℃静置几十分钟到1小时。在上述蛋白质合成的每个例子中，测定反应溶液中所合成的蛋白质的活性。此处，被合成的蛋白质没有特别限定，只要是至少具有一个分子间和/或分子内二硫键交联形成的蛋白质即可。例如，可在反应溶液中合成多种蛋白质，从而形成异源寡聚体或类似物质，从而可测定其活性。
如上所述，可测定蛋白质活性、c)氧化还原酶和/或d)氧化还原试剂的相关性。
利用所获得的相关性，通过测定实现预定活性水平(期望活性水平)必须的c)氧化还原酶和/或d)氧化还原试剂的浓度；向b)蛋白合成反应试剂中加入c)氧化还原酶和/或d)氧化还原试剂，使其达到可获得期望活性的浓度；及加入a)编码目标蛋白的模板核酸，从而可在反应体系中高效合成目标蛋白。
参考以下实施例对本发明进行详细描述，但本发明的技术范围不限定于此。
实施例1核糖体的制备用氧化铝颗粒破碎处于对数生长期中的大肠杆菌A19细胞系(300克)。将破碎的细胞悬浮在缓冲液A(10mM HEPES-氢氧化钾(pH 7.6，HEPES-KOH)，10m氯化镁(MgCl2)，50mM氯化钾(KCl)和1mMDTT)中。然后通过离心(30,000g，4℃，1小时)除去氧化铝颗粒和破碎的细胞。接着向得到的上清部分加入脱氧核糖核酸酶(DNase)至终浓度1μg/ml，然后离心(100,000g，4℃，4小时)。将得到的沉淀悬浮在缓冲液A中，制备粗核糖体提取物。将粗核糖体提取物进行6％到36％(w/v)蔗糖密度梯度离心。图1所示的片段来自分离成分。将得到的核糖体组分在100,000g进行离心。将得到的沉淀悬浮在核糖体缓冲液(20mM HEPES-KOH(pH 7.6)，6mM MgOAc，30mM NH4Cl，7mMβ-巯基乙醇)中，从而得到纯化的核糖体。将部分纯化的核糖体进行6％到36％(w/v)蔗糖密度梯度分析，可形成单一的峰。核糖体的纯度为90％或以上。
实施例2构建高表达氨酰-tRNA合成酶的质粒及转化子的生产用从大肠杆菌A19细胞系提取的基因组为模板，通过PCR扩增编码丙氨酰-tRNA合成酶的基因序列，从而得到5′端被SphI，3′端被HindIII识别的DNA片段。将得到的DNA片段插入到已被SphI和HindIII切割的质粒pQE30(QIAGEN公司制)中。从而得到可高表达N端融合His-Tag的丙氨酰-tRNA合成酶的载体。用得到的载体转化大肠杆菌BL21/pREP4。另一个高表达ARS的载体以同样方法构建。表1列出载体、限制性酶和His-Tag的位置。另外，用表1列出的pQE系列质粒和pET系列质粒分别转化大肠杆菌BL21/pREP4和大肠杆菌BL21/DE3。
备注″R.E.″表示限制性酶。
实施例3构建其它可高表达蛋白因子和酶的质粒以下高表达蛋白因子和酶的质粒按实施例2中所述方式构建MTF、T7聚合酶、IF1、IF2、IF3、EF-G、EF-Tu、EF-Ts和RF1。
此外，表达未列到表1中的蛋白因子和酶的质粒也可以相同方式构建。另外，使用pQE系列载体或pET系列载体分别转化大肠杆菌BL21/pREP 4或大肠杆菌BL21/DE3。
实施例4
蛋白因子和酶的高表达与纯化为了高表达His标记的丙氨酰-tRNA合成酶，在LB培养基(6升)培养实施例2获得的大肠杆菌BL21/pREP4细胞转化子至660nm吸光度为0.7。向培养液中加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖胺(IPTG)至终浓度为0.1mM，然后在37℃再培养4小时。将培养液离心，得到的细胞悬浮在悬浮缓冲液(50mM HEPES-KOH(pH 7.6)，1M NH4Cl，10mM MgCl2，0.3mg/ml白蛋白溶菌酶，0.1％TritonX-100，0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和6mM β-巯基乙醇)中。超声悬浮液以破碎细胞。将超声悬浮液离心(100,000g，4℃ 1小时)。然后除去破碎的细胞。将获得的上清部分加入已预装Ni2+的10-ml Hi-Trap鳌合柱(Pharmacia公司制)中，然后用100ml含10mM咪唑(50mMHEPES-KOH(pH 7.6)，1M NH4Cl和10mM MgCl2)的HT缓冲液洗涤。用线性梯度为10到400mM咪唑的HT缓冲液将His标记的丙氨酰-tRNA合成酶从柱上洗脱下来。用储液缓冲液(50mM HEPES-KOH(pH 7.6)，100mM KCl，10mM MgCl2和30％甘油)透析含纯化蛋白质的组分。根据以牛血清白蛋白(BSA)为参照、用蛋白质检测试剂盒(Bio-Rad)制备的标准曲线，计算纯化的His标记的丙氨酰-tRNA合成酶的浓度。将纯化的His标记的丙氨酰-tRNA合成酶等分为1ml，并用液氮快速冷冻，然后储存于-80℃。以相同方法纯化His标记的丙氨酰-tRNA合成酶(AlaRS)、精氨酸tRNA合成酶(ArgRS)、天冬酰氨tRNA合成酶(AsnRS)、天冬氨酸tRNA合成酶(AspRS)、半胱氨酸tRNA合成酶(CysRS)、谷氨酰胺tRNA合成酶(GlnRS)和谷氨酸tRNA合成酶(GluRS)。图2所示的是His标记的因子经12％SDS-PAGE电泳图进行分离(进行考马斯亮兰染色)。通过光密度计计算出每种因子的纯度均为90％或以上。另外，未显示在图2中的表1中的其它因子和酶也通过SDS-PAGE分离。用光密度计以相同方法计算每种因子的纯度均为90％或以上。
实施例5翻译实验(一般方法)蛋白质合成反应基本试剂的成分(50μl)如下2mM ATP，2mMGTP，1mM CTP，1mM UTP，10mM磷酸肌酸，2.8A 260单位tRNA混合物，0.5μgFD，0.1mM各种氨基酸，9mM醋酸镁，5mM磷酸钾(pH 7.3)，95mM谷氨酸钾，5mM氯化铵，0.5mM氯化钙，1mM亚精胺，8mM腐胺，12pmol核糖体，1μg IF1，2μg IF2，0.75μg IF3，1μg EF-G，2μg EF-Tu，1μg EF-Ts，0.5μg RF1，0.5μg RF3，0.5μgRRF，30-300单位ARS MTF，0.2μg肌酸激酶(CK)，0.15μg肌激酶(MK)，0.054μg核苷二磷酸激酶(NDK)，1.78单位PPiase，和0.5μgT7 RNA聚合酶。向这种蛋白质合成反应基本试剂中加入1pmol模板DNA，37℃反应1小时。
在反应后必须除去核糖体时，使用分子量为100kDa或更小的物质才可通过的超滤膜除去核糖体。
另外，核糖体和上述列于表1中的组分项目通过实施例1和4所述的方法制备，并测定其纯度。其它所用的组分是商品化的纯化试剂。
而且当上述组分应用于下述实施例6和12时，表1所列的项目、核糖体、DsbA和DsbC通过实施例1、4和13所述的方法制备，并测定其纯度。其它所用的组分是商品化的纯化试剂。
实施例6人溶菌酶的合成已报道溶菌酶是一种具有四个分子内二硫键，而且两个或多个这样的二硫键必须互相交联以表现出活性的蛋白质(J Biol Chem2513147-3153(1976))。因此，溶菌酶一直作为检测结构与活性相关性的模式蛋白。此处，根据本发明的方法和传统方法合成了人溶菌酶，以检测合成的蛋白量和比活性。
使用以下两条引物从人溶菌酶cDNA克隆(人基因库，Stratagene公司)中通过PCR扩增大小为0.42 kbp的成熟的人溶菌酶基因正向引物序列AAGGAGATATACCAATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTG；及反向引物序列GGATTAGTTATTCATTACAGTCCACAACCTTGAACAT。
然后用序列为GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA的正向引物和上述反向引物通过PCR扩增含T7启动子区的长约0.51kbp的模板DNA。模板DNA的序列如序列表中的SEQ IDNO4所示。
向实施例5中所述的每个蛋白质合成反应基本试剂(用于本发明方法)，及50μl通过向反应试剂加入1mM DTT得到的反应液(用于传统方法)中，加入1pmol制备好的模板DNA，进行蛋白质合成反应。
合成的蛋白质通过SDS-PAGE分离，并用SYPRO Orange(Amersham pharmacia公司制)进行染色。将分子量为17000的人溶菌酶带与已知浓度的BSA带相比较，以得到合成的人溶菌酶的浓度。用Micrococcus luteus ATCC 4698细胞系冷冻干燥粉(SIGMA)，在每分钟可降低0.001的450nM吸光度的酶量为1个单位的条件下测定人溶菌酶活性(Imoto T.，Johnson L. N.，North A.T.C.，Phillips D.C.，Rupley J.A.，The Enzymes，3rd ed.，7，665-868(1972))。图3和4所示的分别是合成蛋白质的电泳图和比活性。从图3和4可明显看出，在传统方法下，合成的蛋白质可通过电泳确定，但没有检测到酶活性。而在本发明的方法中，可检测到比活性约为300单位/毫克。因此表明根据本发明的方法，具有二硫键的蛋白进行了正确折叠。而且检测了其它具有二硫键的蛋白，也可得到大致相当的结果。
实施例7鼠白介素6(mIL 6)的合成用鼠cDNA文库以与实施例6相同方式制备mIL6。另外，用大肠杆菌基因组DNA以与实施例6相同方式制备大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DHFR)的模板DNA。然后制备以下5种反应溶液向实施例5(传统方法)的蛋白合成反应试剂中加入1mM DTT得到的反应溶液；实施例5的蛋白质合成反应基本试剂；和向实施例5的试剂中分别加入终浓度为2、4和8mM GSSG而得到的反应溶液。每种反应溶液中均加入1pmol模板DNA，以进行各反应溶液中的蛋白质合成。在DHFR合成时，蛋白质合成后将反应溶液通过超滤膜。然后将DHFR的反应溶液和mIL6的反应溶液分别进行SDS-PAGE，并用SYPRO Red对蛋白质进行荧光染色。用荧光图像仪分析染色图谱，根据mIL6和DHFR的染色浓度计算反应溶液中蛋白质的量。图5和6所示的分别是获得的mIL6蛋白和DHFR蛋白的量。从图5和6可明显看出，当合成没有分子间二硫键的DHFRs时，传统方法可得到最大量的蛋白质，而本发明的方法得到的蛋白质的量少一些。另外表明，当合成有分子间二硫键的mIL6时，本发明的方法产生的蛋白质量超过传统方法产生的量。另外进行了同样的实验，只是使用了不同的具有二硫键的蛋白质的模板DNA来代替mIL6模板DNA。因此得到了大致相当的结果。
实施例8蛋白质二硫键异构酶(PDI)的影响制备4种反应溶液，每种均包含实施例5中的蛋白质合成基本反应试剂，并加入2mM GSSG。然后向反应溶液中加入来源于牛的PDI(Takara Bio Inc.)至终浓度分别为0、0.0325、0.13和0.52μM。然后，向50μl反应溶液中加入人溶菌酶模板DNA(1pmol)，进行蛋白质合成。以与实施例6所用相同方式测定溶菌酶的比活性。图7所示的是加到反应体系中的PDI浓度与合成的人溶菌酶比活性间的关系。从图7可明显看出，当PDI浓度为0.0325μM或更多时，可提高具有二硫键的蛋白质的比活性。另外，可通过本发明的方法测定PDI活性。另外，当用其它类型的PDIs和二硫键交换蛋白来代替牛PDI时，可得到大致相当的结果。
实施例9二硫苏糖醇(DTT)浓度的影响制备6种反应溶液，每种均包含实施例5中的蛋白质合成反应基本试剂，并加入0.13μM PDI。然后向反应溶液中加入DTT至终浓度分别为1000、500、250、125、62.5和0μM。然后，向50μl反应溶液中加入1pmol人溶菌酶模板DNA，进行蛋白质合成。以与实施例6所用相同方式测定溶菌酶的比活性。如图8所示的结果。从图8可明显看出，当DTT浓度为125μM或更少时，可得到较强的溶菌酶活性。
实施例10碱性磷酸酶的合成碱性磷酸酶是具有两个分子内二硫键的蛋白质，因此它可作为模式蛋白来检测二硫键形成与酶活性的关系。在这里合成了碱性磷酸酶。
使用针对大肠杆菌基因组DNA和大肠杆菌碱性磷酸酶的PCR引物，以与实施例6相同的方式来合成大肠杆菌碱性磷酸酶的模板DNA。制备5种反应溶液，每种都包含实施例5的蛋白质合成反应基本试剂，并加入1mM DTT和0.13μM PDI。之后，分别向反应溶液中加入浓度为0、1、2、3和4 mM的GSSG。
然后，向50μl反应溶液中加入1pmol碱性磷酸酶的模板DNA，进行蛋白质合成。以与实施例5相同的方法测定合成的蛋白质的浓度。通过以对硝基苯基磷酸二钠盐为底物(Biochim Biophys Acta.258178-87(1972))测定405nm处吸光度来测定所合成的碱性磷酸酶的活性。图9所示的是碱性磷酸酶的相对活性。从图9可明显看出，通过传统方法，也就是用蛋白反应试剂加入1mM DTT和0.13μMPDI，没有检测到碱性磷酸酶的活性。另一方面，通过本发明的方法，也就是用蛋白反应试剂加入1mM或2mM GSSG，可获得碱性磷酸酶的活性。甚至在体系中存在1mM DTT时也可检测到碱性磷酸酶的活性。因此，可证明合成的蛋白质发生了正确的折叠。另外，制备不同的反应溶液，分别包含实施例5中的反应溶液和浓度为1000、500、250、125和0μM DTT。如上所述，向每种反应溶液中加入模板DNA，然后碱性蛋白合成。然后测定碱性磷酸酶的活性。结果如图10所示。没有PDI，只是改变DTT的浓度。因此，结果表明可在DTT的浓度为500μM或更小时获得碱性磷酸酶的活性。
实施例11DsbC的影响通过PCR扩增大肠杆菌的DsbC，并以与实施例2相同的方法构建高表达dsbC的载体，只是所获得的DNA片段其序列可被5′的BamHI和3′的HindIII识别。用获得的载体转化大肠杆菌BL21/pREP4。然后，以与实施例4相同的方法获得纯化的DsbC。蛋白质纯度在90％或以上。通过向实施例5的蛋白质合成试剂中加入1mM DTT和2mMGSSG而制备3种反应溶液(每种50μl)。向这些反应溶液中分别添加浓度0、0和0.5μM的DsbC，及0、1和1pmol的实施例6中的人溶菌酶基因的模板DNA。通过与实施例6所用相同的方法测定合成的蛋白质量和溶菌酶的活性。图11所示的是特异的酶活性。从图11可以明显看出，加入DsbC可使溶菌酶的比活性显著增加。另外，当使用其它的二硫键交换蛋白代替DsbC时，以及当不同类型的二硫键交换蛋白同时使用时，可得到大致相当的结果。
实施例12本发明的蛋白质合成试剂与传统的细胞提取物的比较根据商品说明书通过大肠杆菌细胞提取物的体外蛋白质合成系统(Roche Rapid Translation System 100)合成大肠杆菌的碱性磷酸酶，不过添加了终浓度为0、1、2和3mM的GSSG。另外，通过本发明的方法以与实施例10所用的相同方式合成大肠杆菌碱性磷酸酶。图12所示的是合成的碱性磷酸酶的比活性。从图12可明显看出，用大肠杆菌细胞提取物体系即使加入各种浓度的GSSG也没有检测到碱性磷酸酶的活性，而另一方面，通过本发明的合成方法可得到很高的碱性磷酸酶的活性。
实施例13EF-Tu、DsbA和DsbC纯度的确定在冰上超声破碎表达含带有His-Tag的EF-Tu的蛋白的细胞，以将其悬浮在上样缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，pH 8.0)中。然后，将得到的细胞裂解物离心(30,000g，4℃，30分钟)。之后，向上述获得的上清中加入已在冰冷上样缓冲液中平衡的50％Ni2+-NTA浆(Qiagen)，并在4℃搅拌1小时。然后将树脂加到柱上，并在4℃用20倍柱体积的上样缓冲液(含10mM咪唑，pH 8.0)进行洗涤。用20倍柱体积咪唑浓度梯度为10到250mM的上样缓冲液将目标蛋白从柱上洗脱下来。然后收集组分(每个1ml)。通过SDS-PAGE确定目标蛋白。用光密度计读取每个泳道的电泳图谱，从而可计算纯度。图13所示的是EF-Tu洗脱组分的电泳图。每个泳道的电泳图谱通过光密度计读取，然后收集纯度为90％或以上的Ef-Tu组分。
另外，图1 4所示的是纯化的DsbA(泳道1)和DsbC(泳道2)的电泳图。这两个酶的纯度均为90％或以上。
工业实用性[蛋白质合成方法]根据本发明，可加入几微摩尔到1mM在传统反应溶液中要优先除去的DTT。而且也可以不加入DTT。
另外，通常认为使用除去DTT的无细胞蛋白合成系统的传统方法所合成蛋白的量在这种体系可能会降低，即使二硫键可在蛋白质中形成，有活性的目标蛋白的合成效率也将被破坏。但根据本发明，通过重构蛋白质合成系统可使合成蛋白质的量保持稳定，或在某些情况下有所提高。因此，蛋白质可被高效合成。
根据本发明活性测定方法，在蛋白质合成反应中合成的底物为没有二硫键的单链多肽，从而不需要还原和变性步骤。因此，在合成时或合成后，加入测定活性的酶，可以折叠蛋白质的活性或结构作为指示物。因此，本发明的方法的特征在于所需的步骤和时间与传统方法相比较大大简化和缩短。
本申请所引用的所有出版物，专利和专利申请均全部并入本申请作为参考。
序列表<110>Post Genome Institute Co.，Ltd.
<120>通过二硫化物交联进行体外蛋白质合成的方法<130>PH-2448-PCT<150>JP 2004-136520<151>2004-04-30<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>1aaggagatat accaatgaag gtctttgaaa ggtgtg 36<210>2<211>37<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2ggattagtta ttcattacac tccacaacct tgaacat 37<210>3<211>85<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60ttaactttaa gaaggagata tacca 85<210>4<211>495<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60ttaactttaa gaaggagata taccaatgaa ggtctttgaa aggtgtgagt tggccagaac 120
tctgaaaaga ttgggaatgg atggctacag gggaatcagc ctagcaaact ggatgtgttt 180ggccaaatgg gagagtggtt acaacacacg agctacaaac tacaatgctg gagacagaag 240cactgattat gggatatttc agatcaatag ccgctactgg tgtaatgatg gcaaaacccc 300aggagcagtt aatgcctgtc atttatcctg cagtgctttg ctgcaagata acatcgctga 360tgctgtagct tgtgcaaaga gggttgtccg tgatccacaa ggcattagag catgggtggc 420atggagaaat cgttgtcaaa acagagatgt ccgtcagtat gttcaaggtt gtggagtgta 480atgaataact aatcc 495
权利要求
1.一种合成具有分子内或分子间二硫键的蛋白质的方法，包括使用包含以下a)，b)，和c)和/或d)的反应系统a)至少一个编码目标蛋白的模板核酸；b)包含多种具有特定存在量和纯度的组分的、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成反应基本试剂；c)至少一种具有特定存在量和纯度的、可催化二硫键氧化还原的氧化还原酶；及d)至少一种具有特定存在量和纯度的调节二硫键氧化还原状态的氧化还原试剂。
2.权利要求
1所述的合成蛋白质的方法，其中蛋白质合成基本反应试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。
3.权利要求
1所述的合成蛋白质的方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。
4.权利要求
1-3中任一项所述的合成蛋白质的方法，其中氧化还原酶是催化促进和/或异构化蛋白质的二硫键的酶。
5.权利要求
1-4中任一项所述的合成蛋白质的方法，其中氧化还原酶包括蛋白质二硫键异构酶类(PDIs)或二硫键交换蛋白。
6.权利要求
5所述的合成蛋白质的方法，其中蛋白质二硫键异构酶的浓度为0到10μM。
7.权利要求
5或6所述的合成蛋白质的方法，其中二硫键交换蛋白的浓度为0到10μM。
8.权利要求
1-7中任一项所述的合成蛋白质的方法，其中氧化还原试剂为二硫苏糖醇或氧化型谷胱甘肽。
9.权利要求
8所述的合成蛋白质的方法，其中氧化型谷胱甘肽的浓度为0到8mM。
10.权利要求
8或9所述的合成蛋白质的方法，其中二硫苏糖醇的浓度为0到1mM。
11.权利要求
1-10中任一项所述的合成蛋白质的方法，其中硫氧还蛋白还原酶在反应体系中的浓度不超过100ng/ml。
12.权利要求
1-11中任一项所述的合成蛋白质的方法，其中谷胱甘肽还原酶在反应体系中的浓度不超过100ng/ml。
13.一种检测方法包括在包含以下a)，b)和c)和/或d)的反应体系中改变氧化还原酶试剂和氧化还原试剂的浓度；合成包含至少一个肽链的蛋白质，其中所述肽链分子内或分子间通过至少一个二硫键进行交联，其活性可根据这种交联方式进行调节；测定蛋白质的活性；及测定蛋白质活性、氧化还原酶试剂浓度和氧化还原试剂浓度之间的关系a)至少一个编码目标蛋白的模板核酸；b)包含具有特定存在量和纯度的多种组分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成反应基本试剂；c)至少一种具有特定存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；及d)至少一种具有特定存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂。
14.权利要求
13所述的检测方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。
15.权利要求
13所述的检测方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。
16.权利要求
13-15中任一项所述的检测方法，其中氧化还原酶是催化促进和/或异构化蛋白质的二硫键的酶。
17.权利要求
13-16中任一项所述的检测方法，其中氧化还原酶包括蛋白质二硫键异构酶类(PDIs)或二硫键交换蛋白。
18.权利要求
13-17中任一项所述的检测方法，其中氧化还原酶是浓度为0μM到10μM的蛋白质二硫键异构酶类。
19.权利要求
13-18中任一项所述的检测方法，其中氧化还原酶是浓度为0μM到10μM的二硫键交换蛋白。
20.权利要求
13-19中任一项所述的检测方法，其中氧化还原试剂为二硫苏糖醇或氧化型谷胱甘肽。
21.权利要求
20所述的检测方法，其中氧化型谷胱甘肽的浓度为0到8mM。
22.权利要求
13-21中任一项所述的检测方法，其中硫氧还蛋白还原酶在反应体系中的浓度不超过100ng/ml。
23.权利要求
13-21中任一项所述的检测方法，其中谷胱甘肽还原酶在反应体系中的浓度不超过100ng/ml。
24.一种测定催化促进和/或异构化蛋白质二硫键的酶的活性的方法，包括以下a)，b)和c)a)至少一个模板核酸；b)包含多种具有特定的化合物名称、存在量和纯度的组分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成基本反应试剂；c)包含至少一种具有特定的化合物名称、存在量和纯度的组分、可调节氧化还原状态试剂的氧化还原试剂。
25.权利要求
24中测定活性的方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。
26.权利要求
24中测定活性的方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。
27.一种方法，该方法包括在包含下述a)和b)的基本蛋白质合成反应系统中添加不同浓度的c)和d)，合成包含至少一种蛋白质，其中所述蛋白质通过至少一个二硫键形成分子内或分子间交联，而且可根据这种交联形式调节其活性；测定蛋白质的活性；测定蛋白质活性、催化氧化还原反应的酶浓度和调节氧化还原状态的试剂浓度之间的关系，由此确定可使目标蛋白活性超过预期活性水平的c)和/或d)的浓度，其中所述的a)～d)如下a)编码至少一个目标蛋白的至少一个模板核酸；b)包含多种具有特定存在量和纯度的组分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成基本反应试剂；c)至少一种具有特定存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；d)至少一种具有特定存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂。
28.权利要求
27所述的方法，其中蛋白质合成基本反应试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。
29.一种合成具有分子内或分子间二硫键的蛋白质的方法，包括以下步骤在包含a)编码至少一个目标蛋白的至少一个模板核酸；b)包含多种具有特定存在量和纯度的组分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成基本反应试剂；c)至少一种具有特定存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；和/或d)至少一种具有特定存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂的蛋白质合成反应系统中，在改变c)催化氧化还原的酶的浓度和/或d)调节氧化还原状态的试剂浓度的合成条件下，合成包含至少一种多肽的蛋白质，其中所述多肽可通过至少一个二硫键形成分子内或分子间交联，而且可根据这种交联形式调节其活性；测定蛋白质的活性；测定蛋白质活性、催化氧化还原反应的酶浓度和调节氧化还原状态的试剂浓度之间的关系，由此确定可使目标蛋白活性超过预期活性水平的c)和/或d)的浓度；(2)用包含以上a)、b)和c)和/或d)的蛋白质合成反应系统合成目标蛋白，其中c)和/或d)的浓度已按上述确定的进行了调节。
30.权利要求
29所述的合成蛋白质的方法，其中蛋白合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。
31.权利要求
29所述的合成蛋白质的方法，其中蛋白质合成反应基本试剂包括核糖体、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、氨基酸、核苷三磷酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水。
32.一种包含以下a)、b)和/或c)的试剂盒a)包含具有特定存在量和纯度的核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、核苷三磷酸、氨基酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水的、可在加入模板核酸后合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成反应基本试剂；b)至少一种具有特定存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；及c)至少一种具有特定存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂。
33.一种包含以下a)、b)和/或c)的试剂盒a)包含具有特定存在量和纯度的核糖体、起始因子、延伸因子、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、核苷三磷酸、氨基酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水的、可在加入模板核酸后合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成反应基本试剂；b)至少一种具有特定存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；及c)至少一种具有特定存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂。
34.一种包含以下a)、b)和/或c)的试剂盒a)包括特定存在量和纯度的核糖体、起始因子、延伸因子、终止因子、RNA聚合酶、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、核苷三磷酸、氨基酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水的、可在加入模板核酸后合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成反应基本试剂；b)至少一种具有特定存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；及c)至少一种具有特定存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂。
35.一种包含以下a)、b)和/或c)的试剂盒a)包括特定存在量和纯度的核糖体、起始因子、延伸因子、RNA聚合酶、氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰tRNA转移酶、tRNAs、核苷三磷酸、氨基酸、10-甲酰基5，6，7，8-四氢叶酸(FD)、盐和水的蛋白质合成反应基本试剂，其量和纯度已进行指定，可在加入模板核酸后合成由模板核酸编码的蛋白质；b)至少一种具有特定存在量和纯度的可催化氧化还原的氧化还原酶；及c)至少一种具有特定存在量和纯度的调节氧化还原状态的氧化还原试剂。
36.权利要求
32-35中任一项所述的试剂盒，包含编码对照蛋白质的模板核酸。
37.一种通过含以下a)和b)的反应体系合成具有分子内或分子间二硫键的蛋白质的方法a)至少一个编码目标蛋白的模板核酸；b)包含多种具有特定存在量和纯度的组分、在加入模板核酸后可合成由模板核酸编码的蛋白质的蛋白质合成反应基本试剂。
专利摘要
本发明的目的是提供一种用重构的蛋白质合成系统简便高效地合成含二硫键的蛋白质的方法。已知具有活性的蛋白质可通过使用含有纯化组分的重构蛋白合成系统合成获得，其中可影响氧化还原状态的酶和底物被除去，并可对二硫化物和硫醇的氧化还原的平衡进行人工调节。这种系统可代替含有多种维持还原状态酶和底物，例如硫氧还蛋白还原酶[EC 1.6.4.5]和谷胱甘肽还原酶[EC 1.6.4.2]等的细胞提取物或粗组分的、难以调节氧化还原状态的系统。
文档编号C12P21/02GK1997739SQ200580022328
公开日2007年7月11日 申请日期2005年4月28日
发明者桑田英文 申请人:株式会社后基因组研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan