专利名称:一种液体深层发酵生产块菌多糖的培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程与技术领域：
，具体涉及一种液体深层发酵生产块菌多糖的培养基，还涉及一种生产块菌多糖的液体深层发酵的方法，该培养基适用于块菌的液体深层发酵以及工业化大规模发酵生产块菌多糖。
技术背景块菌是世界上最珍贵的药食两用真菌之一，其子囊果呈球形、半球形或块状，直径一般在1.5-12厘米，成熟后为褐色、红褐色至深褐色，基部常凹陷，表面布以大小不一的小疣。块菌的产地狭窄，主要分布于欧洲大陆的北温带和寒带地区，其产量在市场上一直供不应求，价值显赫。
块菌(Truffle)是地下生菌物中一个比较重要的子囊菌类群，子实体在土壤中生长，除个别种类在成熟时半露出土表外，大部分种类自始至终埋生于地下，是与树木共生的外生菌根型药食两用真菌。
块菌在生物分类学上属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、块菌目(Tuberales)、块菌科(Tuberaceae)、块菌属(Tuber)，常见的块菌有黑孢块菌(Tuber melanosporum Vittad)、印度块菌(Tuber indicum Cooke)、中国块菌(Tuber sinense Tao et Liu)等。我国云南产的印度块菌和和四川产的中国块菌在外形上与黑孢块菌相似，其品质亦可与欧洲产的黑孢块菌相媲美，目前国际市场上每公斤新鲜黑孢块菌的价格高达1000多美元，其昂贵的价格和黑色、疣状的外形被赋予森林中“黑钻石”的美誉。
有关块菌多糖的研究开始于上个世纪九十年代，当时的研究侧重于如何从块菌的子实体中提取块菌多糖及其生物活性，如文献胡慧娟，李佩珍，林涛，杭秉茜，郭跃伟。块菌多糖对小鼠肿瘤及免疫系统的影响。中国药科大学学报，1994；25(5)289-292首次报道了从中国块菌的子实体中提取出一种新的蛋白结合多糖——块菌多糖，连续通过10天给药接种有S-180肉瘤、EAC肉瘤液的小鼠，发现25毫克/千克、50毫克/千克的块菌多糖能明显的抑制小鼠S-180肉瘤及EAC肉瘤的生长。同时通过连续给药发现块菌多糖对小鼠脾脏的重量、外周血中的白细胞数及T淋巴细胞百分率具有明显的增加作用；能够促进T淋巴细胞转化，提高小鼠血清中IgG水平等。实验结果表明，块菌多糖作为一个新的真菌多糖，毒性低、水溶性好、抑制肿瘤作用明显，可望开发成为抗肿瘤免疫疗法的药物。
块菌作为一种药食两用真菌具有可培养性，能够通过廉价的培养基快速简单地获得大量的块菌菌丝体及其发酵代谢产物，同时可以通过代谢工程的原理有针对性地设计合适的培养基组分，诱导块菌多糖高效积累，使发酵过程朝着有利于块菌多糖生产的方向进行，整个发酵过程容易放大到工业化生产的规模。但目前的发酵研究主要侧重于如何获得块菌的菌丝体，如文献陈惠群，刘洪玉，李子平。中国块菌主要生理特性初步研究。食用菌学报，1998，5(4)26-30报道了将中国块菌(Tuber sinense Tao et Liu)在鲜松针培养基(洋芋20％、鲜松针3％、葡萄糖1％、麦芽糖1％、蛋白胨0.5％、硫酸镁0.05％、琼脂2％)上进行纯培养，通过比较菌丝的生长量和菌落直径大小分别考察了温度、碳源、氮源、pH对中国块菌菌丝生长的影响。结论表明中国块菌的最适宜生长温度为23-25℃、最适pH为5-6，菌丝生长最好的碳源为麦芽糖、蔗糖、果糖，菌丝生长最好的氮源为蛋白胨和硫酸铵。
块菌多糖可以直接从块菌子实体中提取，亦可以通过块菌液体深层发酵的方法获得，但前者不适应于工业化大规模生产，原因主要在于1.块菌作为一种生长于地下的药食两用真菌，在自然界中要求生长于碱性土壤、气候温和的环境，同时与橡树、栎树等树种的根系共生，苛刻的生长条件直接导致了其天然产量的供不应求。
2.为弥补块菌天然产量的不足曾有不少学者进行了半人工模拟栽培的研究，但从接种到收获一般需要7-9年时间，周期较长，需要耗费大量的人力和物力。
3.由于块菌生长于地下，人工发现的难度较大，采集过程中易受到损伤，同时块菌生长于自然界受环境变化的影响较大，品质较难保证。
4.目前欧美市场上每千克新鲜的黑孢块菌的价格高达1000美元，云南产的中国块菌的市场价亦高达400元/公斤。因此若直接以块菌子实体作为块菌多糖的生产原料则无法回避原料价格昂贵、产量有限等问题。
目前的文献报道仅是针对中国块菌的生理特性研究进行了纯培养和在黑孢块菌的半人工模拟栽培过程中对块菌的菌丝体生长进行了初步研究，涉及到通过液体深层发酵生产块菌多糖的块菌纯培养的研究尚未见到有关报道，相关的培养基配方研究在本发明中属于第一次报道。总之，一种既适合块菌生长又适合块菌胞外多糖生产的液体深层发酵培养基对整个块菌多糖生产的工艺和成本而言至关重要。
发明内容本发明的目的在于提供一种液体深层发酵生产块菌多糖的培养基，该培养基配方合理，成本低廉，制作简便；中国块菌在该液体深层发酵培养基中生长迅速、块菌胞外多糖产量高；利用块菌在该培养基中深层发酵来生产块菌多糖能够解决块菌子实体产量不足等问题。
本发明的另一个目的在于提供一种液体深层发酵生产块菌多糖的制备方法，方法易行，操作简便，适合块菌多糖的工业化生产。
本发明的技术方案以中国块菌(Tuber sinense Tao et Liu)为出发菌株，有关该菌株的内容详见参考文献(陈惠群 刘洪玉.中国块菌主要生理特性初步研究，食用菌学报，1998，5(4)26-30)。采用斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、和液体深层发酵的生产流程来生产块菌胞外多糖。在液体深层发酵阶段，通过考察不同的碳源、氮源和起始pH值对块菌胞外多糖产量的影响来优化最佳的液体深层发酵培养基。
实现本发明的具体步骤如下一、斜面菌种培养本发明所采用的斜面培养基为麦芽糖30-150克/升、硫酸镁1.0-10克/升、磷酸二氢钾1.0-10克/升、琼脂10-30克/升、马铃薯提取液1.0升、pH值5-8。灭菌条件为121℃、20分钟。将中国块菌接种于新鲜配置的斜面培养基中，置于生化培养箱内培养，培养温度15-40℃，培养时间2-20天。
二、液体种子培养液体种子培养基配方为麦芽糖30-150克/升、蛋白胨5.0-50克/升、硫酸镁1.0-10克/升、磷酸二氢钾1.0-10克/升、pH值5-8；培养温度15-40℃，摇床转速50-300转/分钟，培养时间2-20天。将步骤一中所培养的斜面菌种转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，该培养液即为含有菌种的一级液体种子。将所培养的一级液体种子转接入摇瓶中进行二级液体种子培养，接种量按体积比计为10％，该培养液即为含有菌种的二级液体种子。
三、块菌液体深层发酵及其培养基的优化将步骤二中所培养的二级液体种子转接摇瓶进行液体深层发酵，接种量按体积比计为10％，发酵温度15-40℃，摇床转速50-300转/分钟，发酵时间2-20天。所述的液体深层发酵培养基中无机盐成分为硫酸镁0.1-10克/升、磷酸二氢钾0.1-10克/升；碳源为麦芽糖50克/升、乳糖30-150克/升、果糖80克/升、或半乳糖80克/升；氮源为尿素7克/升、酵母膏34克/升、牛肉浸膏34克/升、硫酸铵15.6克/升、氯化铵12.6克/升、硝酸钠20克/升、硝酸钾24克/升、硝酸铵9克/升；起始pH值为2-9。根据碳源、氮源、pH值的优化结果，得到一种液体深层发酵培养基配方乳糖30-150克/升、蛋白胨5-50克/升、硫酸镁1.0-10克/升、磷酸二氢钾1.0-10克/升、pH值为2-9。将该培养基组分用水溶解，然后调至指定的pH值，置于高压灭菌锅内121℃灭菌20分钟后即完成该液体深层发酵培养基的制备。
四、块菌胞外多糖的测定将步骤三中所获得的含有菌丝体的发酵液离心(5000转/分钟、30分钟)，取其上清液用于块菌胞外多糖的测定。采用乙醇沉淀法来获得液体深层发酵所获得的块菌胞外多糖，发酵上清液加入四倍体积的无水乙醇，混匀后静置过夜，13000转/分钟离心5分钟后取沉淀，用等量的80％乙醇清洗后在13000转/分钟下离心5分钟就可以得到纯度较高的胞外多糖，其浓度用浓硫酸-苯酚法来测定。详细步骤见参考文献，M.Dubois，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，et al.Colorimetric method for determination of sugars andrelated substances，Anal.Chem.1956，(28)350-356.
本发明的有益效果由于块菌价格昂贵，目前块菌多糖的工业化生产在市场上没有，本发明避免了从块菌子实体中提取多糖过程中原料有限和价格昂贵等不利因素，大大降低其生产成本，有望填补块菌多糖工业化生产的空白。同时通过对碳源、氮源、起始pH的优化，本发明所获得的最佳液体深层培养基能大大提高块菌多糖的产量，更适合块菌多糖的工业化生产。
具体实施方式实施例1采用的菌种中国块菌(Tuber sinense Taoet Liu)。
A、斜面菌种培养本实施例所采用的斜面菌种培养基配方为麦芽糖50克/升、硫酸镁5克/升、磷酸二氢钾5克/升、琼脂15克/升、马铃薯提取液1.0升、pH值5或6或7或8。灭菌条件为121℃、20分钟。培养温度为15或17或19或24或27或29或34或36或40℃，培养时间为2或5或7或9或14或16或17或20天。
B、液体种子培养本实施例中一级液体种子、二级液体种子培养基的配方均为麦芽糖70克/升，蛋白胨25克/升，硫酸镁5克/升，磷酸二氢钾6克/升，pH值5或6或7或8。将斜面菌种转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中即可进行一级液体种子培养。培养温度为15或17或19或24或27或29或34或36或40℃，摇床转速为200转/分钟，培养时间为2或5或7或9或14或16或17或20天，装液量为每250毫升摇瓶装50毫升液体；将培养好的一级液体种子转接摇瓶进行二级液体种子培养，二级液体种子的培养基配方和以上一级液体种子培养基的配方相同，培养温度与A步相同，摇床转速为200转/分钟，培养时间为2或4或6或8或10天，接种量为5毫升，装液量为每250毫升摇瓶装50毫升液体。
C、块菌液体深层发酵及其培养基优化所采用的液体深层发酵培养基配方为麦芽糖80克/升，蛋白胨30克/升，硫酸镁5克/升，磷酸二氢钾6克/升，pH为2或3或4或5或6或7或8或9。发酵条件为温度，摇与A步相同，摇床转速200转/分钟，培养时间与A步相同。接种量为5毫升，装液量为每250毫升摇瓶装50毫升液体。
胞外多糖的测定主要参考文献M.Dubois，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances，Anal.Chem.1956，(28)350-356。具体实施步骤如下发酵完毕后将含有菌丝体的发酵液离心(5000转/分钟、30分钟)，将发酵液离心后获得的上清液用于块菌胞外多糖的测定，采用乙醇沉淀法测定液体深层发酵所获得的块菌胞外多糖，取200微升离心后的上清液加入800微升的无水乙醇，混匀后静置过夜，13000转/分钟离心4-6分钟后取沉淀，用1毫升80％乙醇清洗后在13000转/分钟下离心4-6分钟就可以得到纯度较高的胞外多糖。浓度用浓硫酸-苯酚法来测定，向得到的胞外多糖中加入1摩尔/升的氢氧化钠1毫升，60℃保温1小时，冷却后取500微升补水至1毫升；加入5％苯酚1毫升，混匀后加入浓硫酸5毫升，25℃保温25分钟后于488nm下比色。用分析纯的葡萄糖以同样的方法制作标准曲线，最后通过回归方程计算出多糖的含量为1.60克/升。
实施例2-4液体深层发酵培养基中碳源分别为80克/升乳糖、80克/升果糖、80克/升半乳糖，其它条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为1.83克/升、1.13克/升、1.17克/升。
实施例5-12液体深层发酵培养基中碳源为乳糖，浓度分别为30克/升、50克/升、60克/升、70克/升、90克/升、110克/升、130克/升、150克/升，其它条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.88克/升、1.15克/升、1.35克/升、2.18克/升、1.60克/升、1.35克/升、1.19克/升、0.91克/升。
实施例13-20液体深层发酵培养基中氮源分别为尿素7克/升、酵母膏34克/升、牛肉浸膏34克/升、硫酸铵15.6克/升、氯化铵12.6克/升、硝酸钠20克/升、硝酸钾24克/升、硝酸铵9克/升，其它条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为1.53克/升、0.28克/升、1.07克/升、0.50克/升、0.25克/升、0.45克/升、0.62克/升、0.64克/升。
实施例21-27液体深层发酵培养基中氮源为尿素，浓度分别为1克/升、3克/升、5克/升、8克/升、11克/升、15克/升、20克/升，其它条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.65克/升、1.10克/升、1.42克/升、1.85克/升、1.87克/升、1.44克/升、1.13克/升。
实施例28-35液体深层发酵培养基中蛋白胨浓度为5克/升、10克/升、15克/升、20克/升、25克/升、30克/升、35克/升、50克/升，其它条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为1.41克/升、1.60克/升、1.85克/升、2.04克/升、2.23克/升、1.60克/升、1.46克/升、1.15克/升。
实施例36-42液体深层发酵培养基中起始pH值分别为2、3、4、5、7、8、9，其它条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.35克/升、1.39克/升、0.93克/升、1.28克/升、1.55克/升、1.68克/升、1.01克/升。
实施例43-50液体深层发酵培养基中硫酸镁浓度为0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.22克/升、0.44克/升、1.10克/升、1.37克/升、1.60克/升、1.42克/升、1.13克/升、1.02克/升。
实施例51-58液体深层发酵培养基中磷酸二氢钾浓度为0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、6克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为1.32克/升、1.58克/升、1.76克/升、2.1 5克/升、2.30克/升、1.60克/升、1.54克/升、1.38克/升、1.01克/升。
权利要求
1.一种液体深层发酵生产块菌多糖的制备方法，它包括下列步骤A、斜面菌种培养将中国块菌菌种接种于斜面培养基上，接种完后置于生化培养箱里培养，培养温度15-40℃，培养时间2-20天，所述的斜面菌种培养基配方为麦芽糖30-150克/升，硫酸镁1.0-10克/升，磷酸二氢钾1.0-10克/升，琼脂10-30克/升，马铃薯提取液1.0升，pH值为5-8；B、液体种子的培养将步骤A中培养的斜面菌种转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，培养条件为温度15-40℃、摇床转速50-300转/分钟、时间2-20天；该培养液即为含有菌种的一级液体种子，所述的一级液体种子培养基配方为麦芽糖30-150克/升、蛋白胨5-50克/升、硫酸镁1.0-10克/升、磷酸二氢钾1.0-10克/升、pH值5-8，培养条件为温度15-40℃、摇床转速50-300转/分钟、培养时间2-10天；将培养好的一级液体种子转接摇瓶进行二级液体种子培养，二级液体种子培养基与一级液体种子培养基相同，接种量10％/体积比，所得到的培养液即为含有菌种的二级液体种子；C、块菌液体深层发酵将步骤B中所培养的二级液体种子转接摇瓶进行液体深层发酵，发酵条件接种量10％/体积比、温度15-40℃、摇床转速50-300转/分钟、发酵时间2-20天，所述的液体深层发酵培养基中无机盐成分为硫酸镁0.1-10克/升、磷酸二氢钾0.1-10克/升，碳源为麦芽糖、乳糖、果糖、或半乳糖；氮源为蛋白胨、尿素、酵母膏、牛肉浸膏、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵，起始pH值为2-9，根据碳源、氮源、起始pH值的选择，将液体深层发酵培养基用水溶解后调至指定的pH值，置于高压灭菌锅内121℃灭菌20分钟后即完成该液体深层发酵培养基的制备。
2.一种用于实现权利要求
1所述的块菌液体深层发酵的培养基，其特征在于乳糖30-150克/升、蛋白胨5-50克/升、硫酸镁0.1-10克/升、磷酸二氢钾0.1-10克/升。
专利摘要
本发明公开了一种液体深层发酵生产块菌多糖的培养基。该培养基由乳糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾按一定比例构成，其块菌多糖的制备步骤首先是斜面菌种培养，其次是液体种子培养，最后是液体深层发酵。本发明通过对中国块菌的斜面菌种、一级液体种子和二级液体种子的培养来稳定其生理状况，在液体深层发酵阶段着重考察了不同碳源、氮源及起始pH值对块菌液体深层发酵过程中块菌多糖产量的影响。在该培养基中块菌生长迅速，发酵周期短，多糖产量高，成本低，适用于工业化大规模生产块菌多糖。
文档编号C12P19/04GK1995322SQ200610166503
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月27日
发明者汤亚杰, 李冬生, 孔国平 申请人:湖北工业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan