的提取制备方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于辅酶制备技术领域，具体涉及一种辅酶Qltl的提取制备方法，通过对自然生态条件下发酵的光合细菌进行浓缩、破壁、皂化、萃取和纯化后制得辅酶Qltl纯品。
【背景技术】
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[0002]辅酶Qltl是一种脂溶性抗氧化剂，又名癸烯醌、泛醌、泛癸利酮、辅酵素Q 1(1，其醌式及侧链异戊烯基的结构特点，决定了它在生物体内具有许多重要生理功能；它参与线粒体氧化磷酸化与ATP的产生过程，也能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能，且无毒性、无致畸作用、无副作用，使用十分安全，因此医学上广泛用于心血管系统疾病，国内外广泛将其用于营养保健品及食品添加剂。2004年，日本厚生省将辅酶Qltl批准为食品添加剂，正式用于饮料、糖果、糕点、乳酪、和酸奶中；美国FDA在2003年正式将辅酶Qltl应用于食品中，并于2004年9月批准将液体辅酶Qltl作为食品添加剂；在我国，国家食品药品监督管理局于2006年9月25日出台了《以辅酶Qltl作为原料保健食品申报与审批规定》，此文件的颁布使辅酶Q K1正式进入保健食品市场。
[0003]目前，辅酶Qltl的生产方法大致有发酵法、半合成法、全合成法、生物提取法和细胞培养法，上世纪八十年代初，日本最早实现了从烟叶中提取茄呢醇为原料合成生产辅酶Q1q，使得辅酶Qltl的成本大幅度下降，这对于辅酶Q K1的应用、普及和推广起到了重要的推动作用；半化学合成法技术上比较成熟，已实现了工业化，产品成本低，价格适中，但是使用半化学合成法生产的产品虽然在价格上存在优势，但在使用上与用生物提取法生产的产品相比还有较大差距，这是因为生物提取法生产的91(|是天然的、有机的，易于被人体吸收转化，而化学合成法生产的Qltl是人工化学合成的，生物活性极差、不易被人体吸收，难以充分发挥辅酶Qltl的药理作用；自1977年发达国家实现了用微生物发酵法生产辅酶Qltl后，近几年微生物发酵提取法得到了长足的发展。例如有中国专利200810225225.1公开的一种从微生物中提取辅酶Qltl的方法；中国专利200810062350.5公开的一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Qltl的方法；中国专利200810114118.1公开的一种超临界CO 2条件下微生物转化制备辅酶Qltl的方法；中国专利200910094263.2公开的一种将氧化型辅酶Q 1(|制备并纯化为还原型辅酶Qltl的方法；中国专利201310667868.2公开的一种从微生物中分离纯化辅酶Qltl的方法等等；上述专利技术中均存在产品辅酶Q K1纯度不高、生产原料成本高、制备条件苛刻等缺点。
[0004]研宄发现，在光合细菌中所含B族维生素种类丰富，尤其是B12、叶酸、生物素等；而在酵母中几乎不含有的种类，特别是辅酶Qltl在光合细菌中含量较多，尤其是沼泽红假单胞菌其辅酶Qltl的含量高达3900ug/g干细胞。因此，本发明研宄出一种新型的基于光合细菌发酵法来萃取沼泽红假单胞菌中辅酶Qltl的方法，从而实现低成本、大批量的产业化提取制备辅酶Qltl,所涉及的光合细菌发酵法为已经授权的专利，专利号为201010590805.8，发明名称为“一种自然生态条件的光合细菌发酵方法”。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，寻求设计提供一种辅酶Qltl的提取制备方法，以在自然生态条件下发酵的光合细菌为原料，经浓缩、破壁、皂化、萃取、纯化后制得纯品辅酶Q1Ci。
[0006]为了实现上述目的，本发明涉及的提取制备方法具体包括以下工艺步骤:
[0007](I)细菌发酵:将培养用水加入透光容器后，加入培养用水重量0.1 %的消毒剂，搅拌均匀、静置后过滤得灭菌清液；向灭菌清液中加入培养用水重量I %的细菌培养剂，充分溶解、搅匀后得培养液，向培养液中加入沼泽红假单胞菌种液并搅拌均匀；把已接种好的沼泽红假单胞菌分装至发酵容器中，留气室、置于室外有光照处，每日搅拌十次以上，15-40°C条件下培养2-5天至生物量达18时采收；
[0008](2)离心浓缩:将采收的沼泽红假单胞菌菌液用碟式离心机以1000L/h的速率连续离心使离心率达95%以上，得到浓缩菌泥；
[0009](3)破壁处理:将浓缩菌泥放入细胞破碎机进行破壁处理，控温10°C以下，压力1000psi，反复两次，使菌体破壁率达90%以上，以得到破壁菌体；
[0010](4)皂化处理:向每150kg的破壁菌体中加入焦性没食子酸700g，氢氧化钾5kg，甲醇35kg和纯净水50L，混合均匀后放入反应釜中回流30min，然后迅速冷却至室温；
[0011](5)萃取回收:向反应釜中加入石油醚萃取2次，每次加入的石油醚的体积数与步骤(4)中破壁菌体的质量数的比值为1:1，然后快速搅拌5分钟，在温度为20°C条件下静置Ih后分离萃取液即石油醚层，将两次萃取液合并回收；将反应釜升温至65°C，经挥发回收残留石油醚，反应釜中所剩物即为辅酶Qltl粗制品；
[0012](6)纯化处理:具体步骤包括:
[0013]1.将辅酶Qltl粗制品用无水乙醇溶解后制成体积百分比浓度为20%的辅酶Qltl乙醇溶液；
[0014]I1.将辅酶Qltl乙醇溶液加入反应釜中，每100L辅酶Qltl乙醇溶液中加入HZ816树脂30kg，持续搅拌30min，使辅酶Qltl充分被HZ816树脂吸附，然后分离取出HZ816树脂；
[0015]II1.将吸附有辅酶Qltl的HZ816树脂用丙酮解析洗脱2次。
[0016]IV.将两次丙酮洗脱液进行合并，减压到常压101325Pa，回收丙酮后得到辅酶Qiq浓缩液；
[0017]V.将浓缩液在O°C条件静置过夜24小时有结晶体析出，回收结晶体经干燥后得纯品，纯度达93.4%。
[0018]本发明中所述步骤(I)中培养用水为河水、池水、井水或自来水；消毒剂为重量比是漂粉精:硫酸铝钾:碳酸钠=2:5:0.5配制而成；细菌培养剂为重量比是醋酸钠:硫代硫酸钠:碳酸氢钠:磷酸二氢钾:氯化钙:硫酸镁=7:3:1.3:0.1: (0.04-0.05):(0.01-0.02)配制而成；培养液与球形红假单胞菌种液的重量比为3:0.9—1.1 ;步骤(I)中还可选用球形红假单胞菌、脱氢假单胞菌、脱氮付球菌或荚膜红细菌替代沼泽红假单胞菌。
[0019]本发明与现有技术相比，利用常见光合细菌为原料，在自然生态条件下发酵后，经过离心浓缩和破壁处理后，加入焦性没食子酸、氢氧化钾、甲醇和纯净水进行皂化处理，然后用石油醚进行萃取，最后经纯化处理制得高纯度的辅酶91(|;该方法步骤简单，操作简便，原理可靠，设计科学，成本低廉，溶剂平均回收率高，条件可控，提取效率高，产品纯度好。
【附图说明】
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[0020]图1为本发明中提取制备方法的工艺流程示意图。
[0021]图2为本发明涉及的纯化处理步骤的流程示意图。
【具体实施方式】
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[0022]下面结合附图并通过实施例对本发明作出进一步详细说明。
[0023]实施例1: