用于检测循环肿瘤和内皮细胞的血液测试样机和方法

用于检测循环肿瘤和内皮细胞的血液测试样机和方法
【专利说明】用于检测循环肿瘤和内皮细胞的血液测试样机和方法 本申请是申请日为2004年10月30日，申请号为200480039363. O (国际申请号为PCT/ US2004/036177)，发明名称为"用于检测循环肿瘤和内皮细胞的血液测试样机和方法"的发 明专利申请的分案申请。 相关申请
[0001] 本申请要求2003年10月31日提交的美国临时专利申请系列号60/516, 571的优 先权，其全文在此引入作为参考。 发明背景 1. 发明领域
[0002] -般而论，本发明涉及改良的细胞粘附基质（"CAM"）和用于分离靶细胞的改良的 细胞分离装置，所述靶细胞为例如来自血液或诸如腹水、刮片和涂片标本的其它组织液体 样品的肿瘤、胎儿和生血管细胞。更具体地说，本发明涉及可用于选择性分离细胞的CAM系 统，所述细胞例如为具有转移潜能的革G癌细胞和/或显示侵袭伪足（invadopodia)的内皮 祖细胞。 2. 相关技术的描述 循环肿瘤细朐（CTC)和癌症检测
[0003] 上皮组织恶性肿瘤是癌症的最常见形式，是造成大多数癌症相关死亡的原因。由 于这些肿瘤手术治疗的发展，因此死亡率更多地与早期转移和复发相关联，但这些早期转 移和复发在初期诊断时经常被忽略（Racila等，1998 ;Pantel等，1999)。例如，胰腺和其他 胃肠（GI)器官解剖学位置相距较远，在它们侵袭邻近结构并生长成大于Icm肿瘤之前不太 可能检测到膜腺和其他 GI 癌症（Compton，2003 ;Flatmark 等，2002 ;Koch 等，2001 ;Liefers 等，1998 ;Matsunami 等，2003 ;Nomoto 等，1998 ;Pantel 等，1999 ;Walsh 和 Terdiman，2003 ; 如;[1^311(311，2002)。甚至就乳癌而言，通过乳房造影术检测的12-37%乳癌小肿瘤（<1011) 在诊断时就业已转移了（Chadha M等，1994 ;Wilhelm MC等，1991)。
[0004] 文献中累积的证据表明在循环中所发现的上皮肿瘤细胞代表了转移形成的最早 病征，可考虑将循环肿瘤细胞（"CTC"）用作独立的癌症进展诊断法（Beitsch和Clifford， 2000 ;Brandt 等，2001 ;Feezor 等，2002 ;Fehm 等，2002 ;Ghossein 等，1999 ;Glaves，1983 ; Karczewski 等，1994 ;Koch 等，2001 ;Liefers 等，1998 ;Luzzi 等，1998 ;Matsunami 等，2003 ; Molnar 等，2001 ;Wang 等，2000 ;Weitz 等，1999 ;Wharton 等，1999 ;Racila 等，1998 ;Pantel 等，1999)。同样地，从血液中分离出癌细胞的可靠方法对癌症的临床诊断和治疗应用将产 生有意义的影响（Racila等，1998 ;Pantel等，1999)。一个称为Mi期的新肿瘤期，业已被 建议用于指示癌症患者循环中肿瘤细胞的存在。该期使得可以检测循环肿瘤细胞（CTC)的 血液测试的发展有所依据。癌症研宄领域期待着能增加检测灵敏性的相对于现有方法提高 至少一个数量级的新肿瘤细胞富集方法的产生（Pantel等，1999)。 循环内皮祖细朐，血管发牛和心血管危险
[0005] 内皮细胞损伤是动脉粥样硬化斑块发展的重要刺激因素（R〇SS，1993)。已鉴定可 分离自外周血单核细胞级分、骨髓和脐带血的循环内皮祖细胞（"CEC"）为内皮细胞损伤之 标志（Asahara等，1997 ;Hi11等，2003)。实验室证据表明这些细胞表达多种内皮特异性细 胞表面标记并具有众多内皮特性。已注意到当这些细胞注射入具有局部缺血的动物模型中 时，它们迅速地与新血管形成位点结合。
[0006] 在初步研宄中，Hill等，2003发现低CEC水平与心血管危险因素及臂丛 (brachial)反应性相关。业已表明在缺乏足够的CEC下内皮损伤可能影响心血管疾病的进 展。该初期研宄指出了 CEC在心血管疾病诊断和治疗中的潜在应用。CEC通过提供细胞循 环富集以促进血管生成而有助于内皮修复（Szmitko等，2003)。因此，CEC可作为心血管疾 病危险的阴性预测因子。所以，CEC有效富集的方法在心血管疾病的诊断前和治疗中将特 别有用。 细朐异质件及现有的细朐分离抟术
[0007] 在血液（细胞异质来源）中循环的肿瘤和内皮祖细胞非常稀少。这些细胞很难被 纯化用于分析。在癌症患者中，与非赘生细胞的数量相比，血液中的CTC或剥落的异常细胞 (赘生细胞）数量通常较少。因此，通过常规细胞病理学进行的剥落的异常细胞检测经常受 限于之。此外，剥落的细胞常常是高度异质性，由多种不同细胞类型组成（有趣的是许多基 因最初报道在剥落的细胞中差异表达，而实际上是在非肿瘤细胞中表达的）。由于增加了这 种异质性问题，所以存在于每一临床标本中的赘生细胞频率易变，使得在随机混合群体中 不同基因表达的量化产生偏差并变复杂。在较大的肿瘤、外周血和腹水中常见凋亡和坏死 的细胞。这些细胞不合高质量的RNA，因此对于分子分析来说存在着技术困难（Karczewski 等，1994)。
[0008] 业已描述了多种循环肿瘤和内皮祖细胞的细胞富集方法：
[0009] a)显微切割可用于逐一分离稀少的肿瘤细胞（Suarez-Quian等，1999)。该方法通 常具有一些限制：（1)后继样品处理过程复杂，（2)很难确定细胞生存力，以及（3)选择要被 切割的细胞主要是基于形态学上的标准，会造成高频率的假阳性结果。
[0010] b)也可以利用肿瘤细胞的物理特性，例如形状、大小、密度或电荷（Vona等， 2000)。已经发展了几种密度梯度离心方法用于富集有核血细胞（不合成熟红细胞）中的 肿瘤细胞。密度梯度离心方法可获得500到1000倍的细胞富集。富集的肿瘤细胞可接 着用于分子分析，使用了高灵敏的测定方法，例如免疫细胞化学和逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)，该逆转录聚合酶链式反应可用于扩增推定的肿瘤标记或内皮标记，例如胰腺特 异性抗原（PSA)mRNA或细胞角蛋白19mRNA(Peck等，1998)。但是，这些方法不能有效地从 正常细胞中富集有活力的肿瘤细胞。也就是说，500-1000倍的细胞富集通常认为是相对适 度的富集，其实质上所产生背景噪声对进一步的分子分析产生了不利影响。另外，基于物理 分离技术的富集方法通常是麻烦、冗长的，且包括可导致细胞损害的步骤（如，超过2-3轮 的离心）。
[0011] C)基于抗体的技术是新近才发展的。免疫亲合方法包括将抗体固定到物理载体或 荧光标记上。在抗体与感兴趣细胞表面上存在的其靶标结合后，接着进行分选步骤用于阳 性或阴性富集期望的细胞类型。上述方法包括亲合色谱法、粒子磁分离、离心或过滤，以及 流式细胞术（包括荧光激活细胞分选术；FACS)。 (1)流式细胞术或荧光激活细胞分选术（"FACS"）从背景细胞中逐一检测并分离单 个细胞。在模式试验中，该方法可检测单核细胞级分中的乳癌细胞（Gross等，1995)和内 皮祖细胞（Hill等，2003)，该单核细胞级分业已通过密度梯度离心富集自外周血。此外， 在使用抗体涂覆的磁性微珠富集步骤后，FACS可检测血液中天然存在的乳癌和胰腺癌细胞 (Racila等，1998 ;Beitsch和Clifford，2000)。但是，在FACS方法中，舍弃了以簇或块存 在的细胞，且在某些情况下，例如，在卵巢癌中，大多数细胞都以团聚体存在，使得FACS CTC 或CEC检测基本无效。 (2)基于抗体涂覆的微珠方法可使用磁场（Racila等，1998)、柱层析、离心、过滤或 FACS以获得分离。尽管富集效率很高，但仍存在与所有基于抗体的细胞分离方法相关的内 在限制。最重要的一个限制是癌细胞通常表达推定的肿瘤特异性抗原的程度不定（Sabile 等，1999);因此在收集过程中容易丢失大量和潜在的肿瘤细胞非随机亚类。抗体也倾向于 以有效的非特异性亲和力结合损害的细胞，导致它们与感兴趣细胞一起分离。总之，该基于 抗体的细胞分离方法具有较预期更高的假阴性率。当前，抗体-启动的磁性分离方法检测 到很低水平的CTC，即，每毫升乳癌和胰腺癌患者血液1-100个CTC (Racila等，1998)，或每 毫升处于心血管疾病危险中个体血液小于50个CEC (Hill等，2003 ;Beitsch和Clifford， 2000)。在一毫升（mL)或一克血液中大约存在5X IO9个红细胞和5X10 6个有核白细胞。 因此，要在一毫升的血液中检测存在的数千个的癌或内皮细胞仍是一个具挑战性的工作 (Gulati 和 Acaba，1993)。
[0012] 在过去的20年中，已鉴定了在侵袭性肿瘤细胞表面发现的特殊复合物，该复 合物促进了这些细胞从原发性肿瘤到转移位点的运动（Aoyama和Chen，1990 ;Chen和 Chen，1987 ;Chen 等，1994a ;Chen 等，1984 ;Chen 等，1994b ;Chen，1996 ;Chen，1989 ;Chen 和 Wang，1999 ;Ghersi 等，2002 ;Goldstein 和 Chen，2000 ;Goldstein 等，1997 ;Kelly 等， 1994 ;Monsky 等，1994 ;Monsky 等，1993 ;Mueller 等，1999 ;Mueller 和 Chen，1991 ;Mueller 等，1992 ;Nakahara 等，1996 ;Nakaliara 等，1998 ;Nakahara 等，1997 ;Pavlaki 等，2002 ; Pineiro-Sanchez 等，1997 ;Saga 等，1988 ;Zucker 等，2000 ;Zukowska_Grojec 等，1998)。我 们命名为"侵袭伪足"的这些复合物，结合并降解多种类型的上皮细胞基质（ECM)成分。在 分化的正常血细胞或原发性肿瘤细胞上没有发现侵袭伪足，且它们在死亡或垂死细胞中也 无法起有效作用。侵袭伪足存在于循环内皮祖细胞中，但在超过99. 999 %的血细胞中不存 在，也存在于孕妇外周血中发现的胎儿细胞中。本发明人已意识到基于侵袭伪足作用的富 集步骤可有效地用于从发现于腹水、血液和许多其他体液的大多数细胞类型中分离有活力 的转移性肿瘤细胞和内皮细胞，并将克服上述其他技术所具之限制。 发明概沭
[0013] 在一个实施方案中，提供了用于分离血样或其他组织液体样品中有活力的特异性 靶细胞的CAM，所述样品用于疾病的筛选、诊断评估、预后和治疗。
[0014] 本发明的CAM使用处在芯材周围的细胞粘附材料以有效地促进包括CTC和CEC在 内的靶细胞的粘附。有用的细胞粘附材料包括血源性粘附化合物，其包括，不限于，纤连蛋 白、血纤蛋白、肝素、层粘连蛋白、生腱蛋白或玻连蛋白，以及合成的化合物，例如合成的纤 连蛋白和层粘连蛋白肽，额外的细胞基质化合物，或其片段，它们的组合等等。CAM中有用 的细胞粘附材料应具有