一种欧洲鳗鲡肝脏细胞系及其构建方法和应用

文档序号:8218464阅读:596来源:国知局
一种欧洲鳗鲡肝脏细胞系及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种欧洲鳗鲡Anguilla)肝脏细胞系及其构建方法和应用,属于海水鱼类细胞培养技术领域。
【背景技术】
[0002]鱼类细胞培养始于20世纪60年代,自Wolf等1962年建立第一个真骨鱼类永久性细胞系——虹鳟生殖腺细胞系RTG-2以来,国内外已建立了 250余株鱼类细胞系,有40余种病毒采用细胞培养分离成功,鱼类胚胎干细胞培养的成功更是有力地促进了基因工程的发展。鱼类研究实验对于养殖场所、设备和水体环境的维持有较高的要求,以鱼类培养细胞作为实验模型,有着活体鱼无法比拟的优点:(I)成本低,细胞系的维护不需要大型的养殖设备和大量的换水与充气;(2)重复性好,实验条件可以精确控制;(3)取样、观测简便易行,利于进行大量样本的分析。鱼类体细胞系模型研究几十年来发展迅速,已经广泛应用于病原学、药理学、生理学、环境毒理学、细胞生物学、肿瘤学以及资源保护等各方面,在病毒学研究中尤其具有重要的地位,被视为病毒性病原分离、鉴定和特性研究的基础。
[0003]鳗鲡养殖业是我国水产业重要的支柱行业,其年产量约占世界总产量的2/3,单项产品出口值在水产品中位居榜首。欧洲鳗鲡(AnguiIla AnguiIla)属鳗鲡目
鳗鲡科鳗鲡属{Anguilla),原产于大西洋,于 1993 年首次引入我国,并于同年实现配套饲料国产化;自引养成功以来,欧鳗养殖业迅速发展,90年代末欧洲鳗鲡年产量超过日本鳗鲡,成为我国最重要的养殖鳗鲡品种,其肉质细嫩,味美,富含蛋白质、多种维生素及不饱和脂肪酸,具有极高的营养价值,有“软黄金”之称。由于养殖业的迅速发展,养殖布局不合理、密度过大、水流不畅等问题普遍发生,加之时有投喂变质饵料和滥用药物的状况,导致鱼体免疫力下降和水体污染,各类病害频繁爆发,其中不乏病毒性病例,而当前已有的欧洲鳗鲡细胞系模型极少,远不能满足研究需要。
[0004]由于欧洲鳗鲡降河洄游的繁殖习性和复杂多变的生活史,其人工繁殖至今仍是未解的世界级技术难题;而欧鳗胚胎和低龄幼体的难以获取,和被列为濒危物种后对玻璃鳗进出口的限制,客观上增大了欧洲鳗鲡体细胞系建立的难度,更加突显出这一亟需填补的技术空白的重要性。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种欧洲鳗鲡肝脏细胞系及其构建方法和应用,以弥补现有技术和细胞模型库的不足,并满足对欧洲鳗鲡进行病原学分析和生理特性、功能基因组等研究的应用需要。
[0006]本发明所涉及的欧洲鳗鲡肝脏细胞系的构建方法,其步骤如下:
1)欧洲鳗鲡的试前准备:健康欧洲鳗鲡幼体黑仔鳗在洁净海水中于室内暂养I?2周,期间不喂食饵料;
2)欧洲鳗鲡肝脏组织的获取:将步骤I)准备好的仔鳗置于碎冰中行冰冻麻醉,至鱼体对物理刺激应激行为消失为止;以2%碘酊棉球充分擦拭鱼体表面去除黏液后,再以75%酒精棉球擦拭鱼体表面2?3次,由侧面剪开体壁,取出肝脏组织,置于(TC预冷并含青霉素及链霉素双抗的灭菌无钙镁D-Hanks平衡盐溶液中,清洗5?6次;
3)原代培养:将步骤2)得到的欧洲鳗鲡肝脏组织剪碎成0.5mm3?Imm3大小的组织块,以步骤2)所述灭菌无钙镁D-Hanks平衡盐溶液漂洗;用不含血清的L-15培养基润湿培养瓶底面,将漂洗后的组织块移入25mL培养瓶中,以0.3cm?0.5cm的间距均匀排列;倒置瓶身于20°C密闭培养6?8小时使组织块贴壁后,在培养瓶中加入原代及早期传代培养用完全培养液,缓慢翻正瓶身,使培养液浸润组织块,于20°C恒温下启动原代培养;
4)早期传代培养:收集生长良好的原代培养物进行早期传代培养,传代前弃去培养液和脱落的组织块,用0.25%胰酶润洗细胞层,弃去,再加入0.25%胰酶消化细胞,待细胞呈收缩分离态势时弃去胰酶,加原代及早期传代培养用完全培养液中止消化,以弯头滴管吹打培养物至细胞和组织块大部分分散脱落,收集细胞和组织悬浮液,100rpm离心3分钟,去除上清后用完全培养液重悬沉淀,依照细胞和组织块数量以1:1?2:1的比例在27°C下进行富集化培养,重复以上步骤直至确认培养物连续数代无污染迹象,传代后细胞能顺利形成铺满瓶底的单层;
5)常规传代培养:细胞能稳定形成单层后对其进行常规传代培养,以显微镜法对培养细胞进行连续观察,当细胞出现均匀的轻微堆叠现象时即行传代,用0.25%胰酶润洗细胞层,弃去,再加入0.25%胰酶消化细胞30秒至I分钟,待上层细胞收缩变圆时弃去胰酶,力口入常规传代培养用完全培养液,用弯头滴管轻柔吹打至上层细胞脱落制成细胞悬液,将全部细胞悬液移入新瓶,于27°C恒温下进行常规传代培养;
6)细胞的冻存及复苏:当细胞进入常规传代培养阶段后,对其分批进行液氮冷冻保存,冻存液组成为70%L-15、20%胎牛血清以及10%DMS0 ;复苏细胞时,以37°C水浴迅速解冻样品,吸出细胞悬液后与常规传代培养用完全培养液混匀接种于培养瓶内,12小时后更换培液,去除未成活细胞和DMSO成分后继续培养。
[0007]步骤3)和4)所述原代及早期传代用完全培养液是以L-15培养基为基础,含终浓度为15%的胎牛血清,终浓度为200U/mL的青霉素,以及终浓度为200 μ g/mL的链霉素的完全培养液。
[0008]步骤5)所述常规传代培养用完全培养液是以L-15培养基为基础,含终浓度为10%的胎牛血清,不含抗生素及其他营养添加物的完全培养液。
[0009]本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。
[0010]根据上述细胞系构建方法,建立了一株欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL,该细胞系于2014年12月16日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏登记入册编号为CCTCC N0:C2014239o
[0011]所述欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL,该细胞系具有以下生物学特性:
O该细胞系为典型的成纤维细胞形态,在体外连续传代60代仍可保持该形态特征。
[0012]2)该细胞系增殖能力强,存活时间长,在每周更换培养基一次的条件下体外生存期限可稳定达到70?90天,最长可超过150天,在体外连续传代60代仍然保持该生理特征。
[0013]本发明还保护了所述的欧洲鳗鲡肝脏细胞系EL作为水产动物病毒宿主细胞的应用,取对数生长期的EL细胞,在维持性培养基环境下接种鳗鲡疱疹病毒HVA-1I,可产生典型的细胞病变(cytopathic effect , CPE)现象。
[0014]所述维持性培养基以L-15培养基为基础,包含终浓度为2%的胎牛血清。
[0015]本发明的有益效果在于:
1)本发明的技术方案简便易行,筛选条件简单明晰,所用试剂均为鱼类细胞培养中最常用的常规用品,无须添加任何特殊营养成分,从而保证了所构建的欧洲鳗鲡肝脏细胞系有广阔的应用空间,有效填补了欧洲鳗鲡体细胞系模型建立的技术空白;
2)所构建的欧洲鳗鲡肝脏细胞系(EL)细胞生长旺盛,形态均一,为成纤维样细胞,能连续传代60代以上,且冻存复苏后贴壁良好,生长稳定,能直接用于水产病毒学、欧洲鳗鲡细胞生物学特性及免疫抗病基因功能的研究,并已被证实对鳗鲡疱疹病毒敏感;
3)该构建方法操作简单,重复性强,成本适中,也适用于其他欧洲鳗鲡体细胞系。
【附图说明】
[0016]图1:欧洲鳗鲡肝脏细胞原代培养光镜照片:a&b、不同类型细胞从组织块中迁出;c&d、细胞围绕组织块形成不同形态的生长晕。
[0017]图2:欧洲鳗鲡肝脏细胞传代培养光镜照片:a、第2代EL细胞;b、第5代EL细胞;C、第11代EL细胞;d、第21代EL细胞;e、第41代EL细胞;f、第70代EL细胞。
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