卵母细胞培养液及其培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞培养液及其培养方法，尤其是一种卵母细胞培养液及其培养 方法。
【背景技术】
[0002] 一直以来，"不孕症"在人们的潜意识里是件难以启齿、比较隐私的事情。随着辅 助生殖技术的发展，人们对体外受精-胚胎移植技术逐步了解，越来越多的患者夫妇开始 关注并且实施该项技术。体外受精-胚胎移植技术是指从女方的卵巢内取出卵子，在实验 室的培养箱内让它们与男方的精子结合，形成早期胚胎，再将它移植入女方子宫内的一种 辅助生殖技术。近年来，未成熟卵母细胞体外成熟培养（invitromaturation，IVM)成为 生殖领域研宄的热点。IVM是辅助生殖技术的一种，它是通过模拟体内卵母细胞的成熟环 境，在体外对未成熟卵母细胞进行培养，使其发育为成熟的第二次减数分裂中期（MII)的 卵母细胞，具有受精、发育为正常胚胎的能力。在应用常规促排卵治疗的ICSI周期，取出的 卵母细胞首先要拆除卵母细胞周围的颗粒细胞，选择MII卵母细胞进行卵胞浆内单精子注 射，剩余的未成熟卵母细胞通常因无法使用而被丢弃，如果将这部分未成熟卵进行IVM，将 会增加可移植胚胎的数量，提高累积妊娠率，尤其对一些获卵较少的病人，更加有利于助孕 结局。
[0003] IVM培养液的成分至关重要，早期的IVM培养液一般包括TCM199、牛绒毛膜促性 腺激素（PMSG)、胎牛血清、孕马血清促性腺激素。目前国际上已有公司研发了人未成熟卵母 细胞体外成熟的培养液系统，并已于2005年商品化，但仍摆脱不了费用高，成功率低、不稳 定、难推广等缺陷。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了 一种制备简便、成本低的卵母细胞培养液及其培养方法。
[0005] 实现本发明目的之一的卵母细胞培养液，包括G-IVF培养液、卵泡液和颗粒细胞。
[0006] 所述G-IVF培养液与卵泡液的体积比为1:1。
[0007] 所述G-IVF培养液中含10%体积比的HAS(人血清白蛋白）。
[0008] 实现本发明目的之二的卵母细胞培养方法，包括如下步骤：
[0009] (1)人成熟卵泡液的准备：将捡完卵冠丘复合物的首席卵泡液收集于锥形离心管 中，离心去除卵泡液内的红细胞及杂质，取上清液用过滤器过滤，放于小试管中培养箱内平 衡保存；
[0010] (2)颗粒细胞的准备：在使用透明质酸酶拆除卵母细胞周围颗粒细胞之前，先用 两个lml注射器在显微镜下切取卵母细胞周围的大部分颗粒细胞并放于装有G-IVF培养液 的3037培养皿中盖油备用；
[0011] (3)剥除剩余颗粒细胞：将含有少量颗粒细胞的卵母细胞移至透明质酸酶中吹吸 数次，然后用不同直径的巴斯特管把卵母细胞周围剩余的颗粒细胞剥除干净，取出M II期 卵母细胞，将剩余的MI期及GV期卵母细胞放于含有颗粒细胞的培养皿中；
[0012] (4)加入卵泡液：吸取处理好的卵泡液加入含有未成熟卵母细胞的培养皿中培 养。
[0013] 所述G-IVF培养液与卵泡液的体积比为1:1。
[0014] 所述G-IVF培养液中含10%体积比的HAS(人血清白蛋白）。
[0015] 所述步骤（1)中，将捡完卵冠丘复合物在3000r/min离心lOmin去除卵泡液内的 红细胞及杂质。
[0016] 所述步骤（3)中将含有少量颗粒细胞的卵母细胞移至透明质酸酶中吹吸数次，时 间为30S。
[0017] 所述步骤（4)中将含有未成熟卵母细胞的培养皿放于6.0%二氧化碳培养箱中， 37°C培养。
[0018] 本发明的卵母细胞培养液及其培养方法的有益效果如下：
[0019] 1、本发明的卵母细胞培养液及其培养方法，在培养液中添加成熟卵泡液及颗粒细 胞简单方便，一般的生殖中心实验室都具备相关条件。
[0020] 2、培养液中添加成熟卵泡液及颗粒细胞使用的培养液为普通的G-IVF受精液，不 需要单独购买商品化的未成熟卵培养液，避免了试剂的浪费，为病人降低了成本。
[0021] 3、培养液中添加成熟卵泡液及颗粒细胞对病人的卵泡液及颗粒细胞重新利用，二 者含有卵母细胞生长发育所需的多种生长因子（GF)、促性腺激素和类固醇激素等，有利于 未成熟卵母细胞的进一步成熟，促使胞质及核成熟的同步化。
[0022] 4、培养液中添加成熟卵泡液及颗粒细胞可以重新利用常规ICSI或IVF周期中收 集到的未成熟卵，避免了未成熟卵母细胞的浪费，同时也为病人卵子的冷冻提供了机会。
[0023] 5、培养液中添加成熟卵泡液及颗粒细胞可显著提高未成熟卵培养的成熟率及稳 定性，进一步增加了胚胎的卵裂及囊胚形成的机会，对不孕患者提供了更多的妊娠机会。
[0024] 6、培养液中添加成熟卵泡液及颗粒细胞能增加病人可移植胚胎的数量，尤其对一 些获卵较少且有未成熟卵母细胞的病人，能减轻其心理负担，有利于妊娠结局。
【具体实施方式】
[0025] 本发明的卵母细胞培养方法，包括如下步骤：
[0026] 病人选择：选择2012年10月-2013年11月期间在石家庄市第四医院生殖医学中 心接受ICSI助孕治疗的138名患者，平均年龄（31. 56±3. 29)岁，获卵总数〈15枚。
[0027] 1、人成熟卵泡液的准备：将捡完卵冠丘复合物的首席卵泡液收集于锥形离心管 中，3000r/min离心lOmin去除卵泡液内的红细胞及杂质，取上清液2ml用过滤器过滤，放于 5ml小试管中培养箱内平衡保存。
[0028] 2、颗粒细胞的准备：用两个1ml注射器在显微镜下切取卵母细胞周围的大部分颗 粒细胞并放于装有含10%体积比的HSA的G-IVF培养液的3037皿中盖油备用；
[0029] 3、剥除剩余颗粒细胞：将含有少量颗粒细胞的卵母细胞移至透明质酸酶中吹吸数 次，时间为30S左右为宜，然后用不同直径的巴斯特管把卵母细胞周围剩余的颗粒细胞剥 除干净，取出MII期卵母细胞进行卵胞浆内单精子注射，留取剩余的MI期及GV期卵母细 胞备用。
[0030] 4、加入卵泡液：吸取0. 6ml处理好的卵泡液加入含有未成熟卵母细胞的3037培养 皿中，将含有未成熟卵母细胞的培养皿放于6. 0 %二氧化碳培养箱中，37°C培养。
[0031] 实验数据：取以下培养液进行实验
[0032]A组：含10%HSA的G-IVF培养液，
[0033]B组：含10 %HSA的G-IVF培养液与卵泡液，体积比为1:1，
[0034]C组：含10 %HSA的G-IVF培养液+颗粒细胞，
[0035] D组：B组+颗粒细胞。
[0036] 将未成熟的卵母细胞分别放入含有上述培养液的3037培养皿中，并将培养皿放 于6. 0%二氧化碳培养箱中，37°C培养。24小时后，观察未成熟卵母细胞的发育情况，对发 育为成熟的M II期的卵母细胞行卵胞浆内单精子注射，然后放于G-1卵裂期培养液做成的 微滴中培养箱内培养，22小时左右观察受精情况并记录，48小时左右观察记录胚胎的卵裂 情况，得出如下数据：
[0037]
【主权项】
1. 一种卵母细胞培养液，包括G-IVF培养液、卵泡液和颗粒细胞。
2. 根据权利要求1所述的卵母细胞培养液，其特征在于：所述G-IVF培养液与卵泡液 的体积比为1:1。
3. 根据权利要求1或2所述的卵母细胞培养液，其特征在于：所述G-IVF培养液中含 10 %体积比的人血清白蛋白。
4. 一种卵母细胞培养方法，包括如下步骤： (1) 人成熟卵泡液的准备：将捡完卵冠丘复合物的首席卵泡液收集于锥形离心管中， 离心去除卵泡液内的红细胞及杂质，取上清液并用过滤器过滤，放于小试管中培养箱内平 衡保存； (2) 颗粒细胞的准备：用两个注射器在显微镜下切取卵母细胞周围的大部分颗粒细 胞，并放于装有的G-IVF培养液的培养皿中盖油备用； (3) 剥除剩余颗粒细胞：将含有少量颗粒细胞的卵母细胞移至透明质酸酶中吹吸数 次，然后用不同直径的巴斯特管把卵母细胞周围剩余的颗粒细胞剥除干净，取出M II期卵 母细胞，将剩余的M I期及GV期卵母细胞放于含有颗粒细胞的培养皿中； (4) 加入卵泡液：吸取处理好的卵泡液加入制备好的含有未成熟卵母细胞的培养皿中 培养。
5. 根据权利要求4所述的卵母细胞培养液，其特征在于：所述G-IVF培养液与卵泡液 的体积比为1:1。
6. 根据权利要求4所述的卵母细胞培养液，其特征在于：所述G-IVF培养液中含10% 体积比的人血清白蛋白。
7. 根据权利要求4?6任一所述的卵母细胞培养方法，其特征在于：所述步骤（1)中， 将捡完卵冠丘复合物在3000r/min离心lOmin去除卵泡液内的红细胞及杂质。
8. 根据权利要求4?6任一所述的卵母细胞培养方法，其特征在于：所述步骤（3)中， 将含有少量颗粒细胞的卵母细胞移至透明质酸酶中吹吸数次，时间为30S。
9. 根据权利要求4?6任一所述的卵母细胞培养方法，其特征在于：所述步骤（4)中， 将含有未成熟卵母细胞的培养皿放于6. 0%二氧化碳培养箱中，37°C培养。
【专利摘要】本发明提供了一种制备简便、成本低的卵母细胞培养液及其培养方法。本发明的卵母细胞培养液，包括G-IVF培养液、卵泡液和颗粒细胞。本发明的卵母细胞培养液及其培养方法，通过使用从患者卵泡中取出的卵泡液及卵母细胞周围的丘颗粒细胞进行特殊处理加入到培养液中，从而对ICSI周期剩余的未成熟卵进行体外成熟培养，进一步对受精、胚胎发育及妊娠结局进行分析，从而建立一种简单、方便、有效的体外成熟的培养方案，增加未成熟卵的有效利用率，为不孕患者提供更多的妊娠机会。
【IPC分类】C12N5-075
【公开号】CN104531612
【申请号】CN201510020208
【发明人】付蕾, 周莉, 袁景川, 曹琴英, 葛军
【申请人】付蕾
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月14日