Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用

文档序号:8218469
Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域,尤其涉及Wipl(wild-typep53_induced phosphatase)敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalStem Cells,BMMSCs)迀移中的应用。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞,它们可以不断地自我更新, 并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细 胞,是形成人体各种组织器官的始祖细胞。间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs) 是干细胞的一个研宄分支,其具有自我更新,多向分化,免疫调节及寻靶等一系列优势,为 将来细胞治疗呈现出希望。BMMSCs来源于骨髓,可在体外培养扩增,并能在体外特定条件下 能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经元细胞等;同时具有迀移能力和免 疫调节功能,能有效的用于多功能的治疗。
[0003] 目前,关于MSCs用于治疗十余种难治性疾病的研宄已开始进行,其除了用来促进 恢复造血,与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外,还用于心脑血管疾病,肝 硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫 性疾病的治疗研宄,已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。
[0004] 然而自体MSCs的应用过程中逐渐暴露了不便之处:例如个体间MSCs扩增能力差 异很大;潜在的肿瘤细胞污染风险;培养需要一定的时间,不能及时适应病情的需要,其中 MSCs和其他原代细胞一样在体外培养过程中具有生长停滞,过早衰老等相似的情况。这些 制约了自体MSCs的使用。涉及到MSCs迀移到靶位置和生长停滞的一些调控因子及机制研 宄的不够深入,报道的较少。因此,深入解析MSCs增殖和迀移信号转导途径网络,探讨如何 增强MSCs向受损组织趋化和迀移的能力,可以为提高MSCs移植效率和应用提供新思路和 理论依据。
[0005] 细胞在增殖和迀移过程中都涉及到蛋白的磷酸化过程,Wipl是丝氨酸/苏氨酸磷 酸酶,由PPM1D基因编码。其主要表达于细胞核内,参与多条通路关键元件磷酸化/去磷酸 化的过程。目前研宄报道中,未见其参与MSCs迀移的报道。

【发明内容】

[0006] 本发明的一个目的是提供敲除动物Wipl基因的物质的应用。
[0007] 本发明提供的敲除动物Wipl基因在制备具有如下(1)_(4)中至少一种功能的产 品中的应用:
[0008] (1)促进动物BMMSCs迀移;
[0009] ⑵抑制动物BMMSCs增殖;
[0010] (3)使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞;
[0011] (4)使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰;
[0012] Wipl基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0013] 上述应用中,所述促进动物BMMSCs迀移体现在提高动物BMMSCs的Racl活性、促 进PI3K/AKT表达和/或促进动物BMMSCs丝状伪足的形成;
[0014] 所述使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞体现在抑制动物BMMSCs中cyclinBl表达。
[0015] 上述应用中,所述动物为小鼠。
[0016] 上述应用中,所述产品为药物。
[0017] 本发明另一个目的是提供敲除动物Wipl基因的物质的另一种应用。
[0018] 本发明提供的提供敲除动物Wipl基因的物质在制备具有如下A-D中至少一种功 能的产品中的应用:
[0019] A、提高动物BMMSCs中Racl活性;
[0020] B、促进PI3K/AKT表达;
[0021] C、促进动物BMMSCs丝状伪足的形成;
[0022] D、抑制动物BMMSCs中cyclinBl表达。
[0023] 上述应用中,所述动物为小鼠。
[0024] 上述应用中,所述产品为药物。
[0025] 本发明实验证明,利用原代Wipr/_小鼠提取出来的原代BMMSCs经过细胞形态学 观察,分化能力鉴定,细胞表面特异标记识别鉴定,证明Wipl敲除可以促进小鼠BMMSCs迀 移。传统研宄方法利用以构建好的MSCs细胞系,在其基础上过表达或者干扰某基因来研宄 MSCs增殖停滞和迀移的分子机制。而本发明是利用敲除某基因的原代MSCs进行分子机制 研宄,相对传统而言,能做到既能完全排除细胞系本身所具备无限增长的影响,又能排除未 彻底清除某基因所保留部分生物学功能对机理研宄的影响。
[0026] 本发明所涉及的研宄手段包括:增殖检测,细胞周期检测,相关蛋白表达水平检测 (westernblot,免疫焚光),细胞核染,形态学观察,细胞划痕实验,transwell检测,相关蛋 白活性检测,涉及信号通路研宄(抑制剂,westernblot),F-actin染色,激光共聚焦检测。 这些方法具有更加科学,严谨,可信度高的特点。
【附图说明】
[0027] 图1为PCR鉴定Wipl+鼠的凝胶电泳分析。
[0028] 图2为培养BMMSCs免疫表型和分化潜能的鉴定。
[0029] 图3为敲除Wipl使原代BMMSCs停滞于G2期。
[0030] 图4为敲除Wipl基因后降低cyclinBl蛋白表达。
[0031] 图5为Wipl-/-BMMSCs表现出生长停滞和早衰。
[0032] 图6为Wipl敲除后促进MSCs迀移愈合划痕。
[0033] 图7为Wipl敲除后促进MSCs通过transwell膜。
[0034] 图8为敲除Wipl后促进MSCs表达Racl活性。
[0035] 图9为敲除Wipl后促进MSCs表达AKT及促进AKT的磷酸化,从而增加MSCs迀移 能力。
[0036] 图10为Wipl敲除后促进MSCs肌动蛋白丝的重排及丝状伪足的形成。
【具体实施方式】
[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0039] Wipl+/-小鼠(遗传背景:C57BL/6,与该遗传背景相比,仅Wipl基因为杂合型,一 条染色体有Wipl,另一条染色体上敲除Wipl;其余基因与C57BL/6 -致,为全身性敲除小 鼠):中国医学科学院医学实验动物研宄所,Wipl基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0040] DNA组织样提取试剂盒:百泰克。
[0041] Racl-GTP Elisa试剂盒:Cytoskeleton, Inc.
[0042]FITC-CD34,FITC-CD45,APC-CD44,APC-CD29andPE-CD90 及同型对照:
[0043] e-Bioscience和MACS公司。
[0044]抗体Wipl(D4F7),AKT,p-AKT(Ser473),p-AKT(Thr308),cyclinBl(4138p),and
[0045]GAPDH(14C10):CellSignalingTechnology公司。
[0046] 5umtranswell膜和 60_mm培养皿:Costar公司
[0047] 油红、茜素红、DAPI染液:Sigma公司。
[0048] 罗丹明-鬼笔环肽:LifeTechnologies公司。
[0049]CellCountingKit_8 试剂盒:Dojingdo公司。
[0050] 基础培养基、血清、成骨、成脂分化试剂盒:Gibco公司
[0051] NSC23766、LY294002 :R&D公司。
[0052]CycleTESTPLUSDNA试剂盒:BDBiosciences公司。
[0053] 实施例l、Wipl_~j、鼠的鉴定及原代小鼠BMMSCs提取、鉴定
[0054]-、Wipl-A及Wipl-WT小鼠鉴定
[0055] 将Wipl+小鼠杂交,所产后代10周后剪尾、编号,提取DNA,经PCR鉴定扩增的带 型,所用引物如下:
[0056] 鉴定引物如下:
【主权项】
1. 敲除动物Wipl基因的物质在制备具有如下(1)-(4)中至少一种功能的产品中的应 用: (1) 促进动物BMMSCs迀移; (2) 抑制动物BMMSCs增殖; (3) 使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞; (4) 使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰; Wipl基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
2. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于: 所述促进动物BMMSCs迀移体现在提高动物BMMSCsRacl活性、促进PI3K/AKT表达和/ 或促进动物BMMSCs丝状伪足的形成; 所述使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞体现在抑制动物BMMSCs中cyclinBl表达。
3. 根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述动物为小鼠。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用,其特征在于:所述产品为药物。
5. 敲除动物Wipl基因的物质在制备具有如下A-D中至少一种功能的产品中的应用: A、 提高动物BMMSCs中Racl活性; B、 促进PI3K/AKT表达; C、 促进动物BMMSCs丝状伪足的形成; D、 抑制动物BMMSCs中cyclinBl表达。
6. 根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述动物为小鼠。
7. 根据权利要求5或6所述的应用,其特征在于:所述产品为药物。
【专利摘要】本发明公开了Wip1敲除在促进小鼠骨髓间充质干细胞迁移中的应用。本发明提供了敲除动物Wip1的物质在制备具有如下(1)-(4)中至少一种功能的产品中的应用:(1)促进动物BMMSCs迁移;(2)抑制动物BMMSCs增殖;(3)使动物BMMSCs出现G2细胞阻滞;(4)使动物BMMSCs生长停滞和/或早衰。本发明实验证明,小鼠敲除Wip1后可以促进BMMSCs的迁移能力。
【IPC分类】C12N5-0775, C12Q1-02
【公开号】CN104531613
【申请号】CN201410654105
【发明人】牟玉莲, 李奎, 唐懿挺, 刘岚, 高倩, 魏景亮, 刘洋, 黄雷, 夏颖
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年11月17日
再多了解一些
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