一种氯化钠-氨水、丙酮协同纯化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体地说是以猪胰为原料提取、沉淀猪胰制成丙酮粉后，灵活运用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脱脂脱水，氯化钠-氨水、丙酮协同除杂等传统蛋白纯化技术，制备胰激肽酶原。
【背景技术】
[0002]胰激肽酶原(kallikein)是从猪胰脏中分离纯化制得的天然酶类药物，临床上又称血管舒缓素，具有舒展毛细血管和小动脉的作用，在临床上常用来治疗高血脂，防治脂肪肝、动脉粥样硬化、高血压、心绞痛等多种疾病，它的开发具有重要的医学和社会价值。在我国，胰激肽酶原生产还存在很大的发展空间。
[0003]现代生物医药产业研究中，专家多采用离子交换层析、树脂吸附层析等各种高端色谱分离技术提纯得到各种酶类和蛋白。而选择离子交换树脂的主要依据是被分离物的性质和分离目的，包括被分离物和主要杂质的解离特性、分子量、浓度、稳定性、所处介质的性质以及分离的具体条件和要求。其中最重要的一条是根据分离要求和分离环境保证分离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异。被分离物中杂质越多，这种差异性显然会越不明显。在实际大生产中，原料中都含有杂质，如果在采用这些高端色谱技术之前，不对原料或者粗制品进行预处理，势必会因为原料中的杂质含量过多而减短离子交换介质的寿命，降低树脂吸附效率，且洗脱中会存在拖尾现象，延长生产周期，影响产品收率及比活。如李立桓等利用Amberlite-CG50从胰酶中分离纯化胰激肽酶原,通过色谱分离技术得到的胰激肽酶原比活、纯度更高。
[0004]胰激肽酶原是以的猪胰脏为原料，因此，必须对原料进行预处理、提纯得到粗制的胰激肽酶原，然后再采用离子交换层析技术进行精制生产。
[0005]本发明是灵活运用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脱脂、脱水，氯化钠-氨水、丙酮协同除杂等传统蛋白纯化技术，从猪胰脏中制备胰激肽酶原，该技术不仅操作简单、生产成本低廉，而且避免了胰激肽酶原降解失活，提高产品比活。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是纯化从合格的猪胰脏中提取胰激肽酶原。
[0007]本发明的技术方案是:以猪胰为原料提取、沉淀猪胰制成丙酮粉后，灵活运用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脱脂脱水，氯化钠-氨水、丙酮协同除杂等传统蛋白纯化技术，制备胰激肽酶原。本发明具有生产周期短，操作简单、成本低廉的特点，非常适用于规模化大生产。包括如下步骤:
(O醋酸提取:将猪胰脏制成丙酮粉后，加醋酸溶液搅拌提取，离心，得上清液；
(2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀，沉淀用丙酮、乙醚脱脂、脱水，干燥，得胰激肽酶原粗品； (3)氯化钠-氨水、丙酮协同除杂:将粗品用45~55倍量的2~10°C氯化钠溶液溶解，用氨水调PH至7.5-8.5，搅拌混合，过滤，得滤液；将滤液冷至0~5°C，，加入2~10°C丙酮使溶液浓度达40%，搅匀，静置10~14小时，离心，得上清液；将上清液中补加2~10°C丙酮至溶液浓度达60%，静置4~8小时，离心，收集沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗涤，干燥，得胰激肽酶原。
【具体实施方式】
[0008]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0009]实施例1
所述的以猪胰为原料提取、沉淀猪胰制成丙酮粉后，灵活运用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脱脂脱水，氯化钠-氨水、丙酮协同除杂等现代蛋白纯化技术，制备胰激肽酶原，包括如下步骤:
(I)醋酸提取:将猪胰脏1kg制成丙酮粉后，加入30倍量的醋酸溶液，搅拌提取，离心，得上清液30L。
[0010](2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚脱脂、脱水，干燥，得胰激肽酶原粗品96g。
[0011](3)氯化钠-氨水、丙酮协同除杂:将粗品用50倍量的8°C氯化钠溶液溶解，用氨水调PH至8.0，搅拌混合，过滤，得滤液；将滤液冷至2V，加入5°C丙酮使溶液浓度达40%，搅匀，静置12小时，离心，得上清液；将上清液中补加5°C丙酮至溶液浓度达60%，静置4小时，离心，收集沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗涤，干燥，得胰激肽酶原64g。
[0012]实施例2
将实施例1制备的胰激肽原酶6000单位、预胶化淀粉21.7g置混合机内，搅拌5分钟，再加入糊精32.5g、糖粉20.1g于混合机内，搅拌20分钟后将预先配好的粘合剂(取L-羟丙基纤维素2.0g加75%乙醇20ml使溶解，即得)和润滑剂硬脂酸镁0.0031g,缓缓均匀地加入混合机内搅拌，至颗粒形成，放入制粒机中制粒，中间体检验，合格后用压片机制成1000片，片芯检验合格后包肠溶衣。
[0013]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【主权项】
1.一种氯化钠-氨水、丙酮协同纯化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物，其特征在于，该方法包括如下步骤: (1)醋酸提取:将猪胰脏制成丙酮粉后，加醋酸溶液搅拌提取，离心，得上清液； (2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀，沉淀用丙酮、乙醚脱脂、脱水，干燥，得胰激肽酶原粗品； (3)氯化钠-氨水、丙酮协同除杂:将粗品用氯化钠溶液溶解，用氨水调PH，搅拌混合，过滤，得滤液；将滤液中加入丙酮，搅匀，静置，离心，得上清液；将上清液中补加丙酮，静置，离心，收集沉淀； 沉淀用丙酮、乙醚洗涤，干燥，得胰激肽酶原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，胰激肽酶原粗品与氯化钠溶液的比例为lKg:45~55L，氯化钠溶液的温度为:2~10°C，氯化钠溶液的浓度为:0.1%~0.3%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，用氨水调节溶液的PH值为:7.5?8.5o
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，滤液的温度应冷至0~5°C。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，第一次加入丙酮的量为至溶液浓度达到40% ;补加丙酮的量为至溶液浓度达到60% ;丙酮的温度为:2~10°C。
6.一种药物组合物，其含有根据权利要求1-5制备的胰激肽酶原作为活性成分，还含有预胶化淀粉、糊精、糖粉、L-羟丙基纤维素、硬脂酸镁、75%乙醇。
【专利摘要】本发明公开了一种氯化钠-氨水、丙酮协同纯化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物。本发明的技术方案是以猪胰为原料提取、沉淀猪胰制成丙酮粉后，灵活运用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脱脂脱水，氯化钠-氨水、丙酮协同除杂等传统蛋白纯化技术，制备胰激肽酶原。本发明具有生产周期短，操作简单，对化学和热稳定性好、成本低廉的特点，非常适用于规模化大生产。
【IPC分类】C12N9-64, A61P3-06, A61P9-12, A61P9-10, A61P1-16
【公开号】CN104531647
【申请号】CN201410807820
【发明人】刘冠男, 林晓磊, 孙延年
【申请人】青岛康原药业有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月23日