一种针对miR-92a种子序列的微小反义寡聚核苷酸及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物制备领域，具体涉及一种针对miR-92a种子序列的微小反义寡聚 核苷酸及应用。
【背景技术】
[0002] 多发性骨髓瘤（multiplemyeloma,MM)是一种单克隆的恶性衆细胞病。近期出现 的沙利度胺，来那度胺和硼替佐米等药可以有效的延长MM患者的寿命，但是耐药性或疾病 复发仍然备受关注。在多发性骨髓瘤的发病过程涉及多种基因的异常表达和多条信号通路 的失调。研宄发现这些失调的基因和信号通路，可以被miRNA调节。
[0003] microRNA(miRNA)是一种非编码的RNA，它可以与靶mRNA的3'端的非编码区互 补结合抑制mRNA的翻译或者降解mRNA链。因此，MiRNA可以通过影响mRNA的翻译过程， 从而影响细胞的多种功能。生物信息学预测发现，30%的人全基因可以被miRNA调节，并且 miRNA参与细胞的存活、发育、分化、凋亡和衰老等多种生物过程。越来越多的证据表明，在 肿瘤中有一些显著过表达miRNA，类似癌基因功能，被称为oncomirs。近年研宄表明，影响 oncomir的表达可能是治疗癌症一种新的有效策略。
[0004] 在丽细胞中发现多种miRNA的表达水平出现明显的差异性，其中高表达的miRNA 包括miR-21，miR-155,miR-17-92,miR-99a-125b和miR-106-25。其中miR-17-92 簇作为 重要的癌基因簇，在多种癌症中引起了重视。miR-17-92簇基因是一种多顺反子，可以转 录出 6 中miRNA(miR-17，miR-18，miR-19a，miR-20，miR-19b-l，miR-92-l)。先前的研宄发 现，miR-17-92簇与Myc基因的表达有密切的关联，在多发性骨髓瘤细胞中沉默Myc基因， miR-17-92簇的表达下调可以促进细胞生长抑制或细胞死亡。这表明miR-17-92簇在多发 性骨髓瘤中也可能是一种很重要的癌基因。但确切的作用还不很明确。
[0005] 研宄证实，在miRNA的5'端具有7?8个高度保守序列，被称为种子序列。种子 序列通过与其靶基因mRNA的3'UTR进行碱基完全互补配对，促进靶基因mRNA降解或抑制 mRNA翻译，从而对靶基因的表达水平进行转录后的负性调控。针对miRNA种子序列反义核 酸可以干扰miRNA与靶基因的配对，从而阻止miRNA发挥功能。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种针对miR-92a 种子序列的微小反义寡聚核苷酸。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述针对miR_92a种子序列的微小反义寡聚核苷酸 的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] -种针对miR_92a种子序列的微小反义寡聚核苷酸（tiny antimiR-92a，t-antimiR-92a)，其核苷酸序列如下：5'-AGTGCAAT-3' ；
[0010] 所述的微小反义寡核苷酸经过全硫代修饰；
[0011] 所述的针对rniR-92a种子序列的微小反义寡聚核苷酸在制备抗肿瘤药物中的应 用；
[0012] 所述的抗肿瘤药物优选为抗多发性骨髓瘤药物；
[0013] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0014] (1)本发明提供的针对miR-92a种子序列的微小反义寡聚核苷酸t-antimiR-92a 靶向作用于多发性骨髓瘤细胞RPMI-8266中的miR-92a，本发明探宄了微小反义寡聚核苷 酸t-antimiR-92a对多发性骨髓瘤细胞的抑制效应，为肿瘤基因治疗寻找新的方法，同时 也为传统的中药的抗肿瘤机制提供新的视角。
[0015] (2)相对于成熟miRNA而言，本发明提供的针对miR-92a种子序列的微小反义寡聚 核苷酸t-antimiR-92a具有分子量小，毒性小，特异性强，转染效率高等优点。
【附图说明】
[0016] 图 1 是miR_92a和t_antimiR-92a的序列不意图。
[0017] 图2是miRFocus软件分析miR-92a参与的信号通路的结果分析图。
[0018] 图3是t-antimiR-92a对RPMI-8266细胞增殖抑制作用的结果分析图。
[0019] 图4是转染t-antimiR-92a对RPMI-8266细胞colony实验结果图，其中A为不同 处理组的细胞克隆数统计分析，B为不同处理组显微镜下的集落形态。
[0020] 图5是转染t-antimiR-92a对RPMI-8266细胞的侵袭影响的结果分析图，其中，A 为不同处理组的细胞侵袭数统计分析，B为不同处理组显微镜下的侵袭结果。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0022] 实施例1微小反义寡聚核苷酸的设计与合成
[0023] 从microRNAFamilies数据库中获取人microRNA_92a的种子序列，根据序列互 补原理设计针对人microRNA-92a种子序列的微小反义寡聚核苷酸序列（t-antimiR-92a)， 并采用BLAST软件分析确定其微小反义寡聚核苷酸序列及随机对照序列（图1)。微小 反义寡聚核苷酸序列：t-antimiR-92a(5' -AGTGCAAT-3'），随机序列（scramble，SCR): 5' -TCATACTA-3' ；均由上海生物工程有限公司合成，全硫代修饰，高效液相色谱（high performanceliquidchromatography,HPLC)纯化。
[0024] 实施例2细胞培养
[0025] 将RPMI-8266细胞（多发性骨髓瘤细胞，购买于中国科学院上海细胞生化所）接 种于含体积分数为10%的胎牛血清，无抗生素的RPMI-1640培养基中，置于37°C、体积分数 为5%的C02培养箱，饱和湿度下培养。每2?3天换液传代。实验选用对数生长期、质量 分数为0. 2 %台盼蓝拒染率>95 %的细胞。
[0026] 实施例3miRNA-92a的信号通路分析
[0027] miRFocus(http://mirfocus.org)软件可以用来分析miRNA的革巴基因和其参与的 f目号通路。
[0028]miRFocus软件分析miR-92a参与的信号通路。结果如图2,miR-92a参与多条与 肿瘤有关的重要的信号通路。例如mTOR信号通路、细胞周期和其他癌症通路等。
[0029] 实施例4MTT法筛选微小反义寡聚核苷酸的最佳作用浓度
[0030] 本实验分t-antimiR-92