三阴乳腺癌标志物col4a2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和肿瘤药物领域，具体涉及一种三阴乳腺癌标志物C0L4A2 及其在三阴乳腺癌诊断中的应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性中最常见且致死率最高的恶性肿瘤。全球每年有将近130万女性患 上乳腺癌，并且有超过40万女性因为乳腺癌的转移复发而死亡。不同类型的乳腺癌可具有 显著不同的生物学特性与临床表现。因此，对患者的乳腺癌进行分类已成为用于确定治疗 方案的重要组成部分。目前临床上主要应用免疫组织化学方法，根据雌激素受体（estrogen receptor,ER)、孕激素受体（progesteronereceptor,PR)和HER-2的检测结果，将乳腺癌 分为4种分子亚型：luminalA型（ER阳性或PR阳性，HER-2阴性，Ki67低表达）、luminal B型（ER阳性或PR阳性，HER-2也阳性）、HER-2过表达型（ER、PR阴性，HER-2阳性，Ki67 多为高表达）和basal-like型（ER、PR、HER-2均阴性）。
[0003] 乳腺癌中恶性程度最高的一种亚型，称为三阴性乳腺癌，以雌激素受体（ER)阴 性/黄体激素受体（PR)阴性/表皮生长因子受体01ER2)阴性为特征，三阴乳腺癌中有 80-90 %属于basal-1ike型。其发病率约占乳腺癌中的17 %?25 %，由于缺乏抗雌激素和 抗HER2靶向治疗的靶标，以及极高的概率发生转移复发，是预后最差的一种乳腺癌类型。 所以对三阴性乳腺癌需要尽早发现尽早治疗，越早发现治愈率将大大提高。然而，目前对三 阴乳腺癌标志物的研究很少，本发明的目的在于发现新的三阴乳腺癌标志物。
[0004] 发明人通过对不同细胞系进行比较研究，在三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中发 现一个特异表达的基因C0L4A2,发明人进一步设计合成干扰C0L4A2基因表达的序列并将 其分别构建到质粒载体上，转染细胞MDA-MB-231，成功获得高效干扰C0L4A2基因表达的序 列。本发明提供的三阴乳腺癌标志物基因及高效干扰标志物基因的siRNA具有重要的临床 应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种三阴乳腺癌标志物C0L4A2基因，所述标志物基因在三 阴乳腺癌细胞系高表达。
[0006] 发明从MDA-MB-231、MCF-7、BT-474、SK-BR-3 这 4 个细胞系中检测C0L4A2 基因的 表达情况，发现C0L4A2基因的mRNA在三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中高表达，而其他三 个乳腺癌细胞系相对表达较少。进一步的Westernblot检测结果也显示C0L4A2蛋白在 MDA-MB-231细胞系中的表达明显高于其他3个细胞系。
[0007] 本发明的目的是提供高效干扰三阴乳腺癌细胞中C0L4A2表达的siRNA。所述 siRNA序列见SEQIDNO1-SEQIDN0 6。优选siRNA序列为SEQIDN0 5 或SEQIDN0 6〇
[0008] 本发明的目的还包括提供一种高效干扰三阴乳腺癌细胞中C0L4A2表达的干扰质 粒载体，所述质粒载体包括上述siRNA。优选将siRNA构建到质粒载体pGenesil-1上形成 干扰质粒载体。更优选的，siRNA序列为SEQIDNO5或SEQIDNO6。
[0009] 本发明的目的还在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述的siRNA分 子，或者包含上述干扰质粒载体。优选的，所述药物组合物包含序列为SEQIDN0 5的siRNA 分子或者包含序列为SEQIDNO6的干扰质粒载体。
[0010] 发明人根据GenBank数据库中C0L4A2(GeneID:1284)基因序列设计了 6条干扰 序列及1条阴性对照序列，并将其分别以酶切连接的方式构建到质粒载体pGenesil-1上， 将构建好的质粒载体分别转染细胞系MDA-MB-231，结果显示有3条质粒载体干扰效率都在 60%以上，最高达69. 61 %，可以有效沉默C0L4A2基因mRNA的表达。
[0011] 本发明的目的是提供一种三阴乳腺癌检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物、 内参引物、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。所述特异性引物包括上游引物和下游引物， 上游引物序列为SEQIDN0 14,下游引物序列为SEQIDN0 15。
[0012] 进一步，本发明的目的在于提供上述检测试剂盒在制备三阴乳腺癌辅助诊断或者 预后制剂中的应用。
[0013] 本发明的目的还在于提供三阴乳腺癌标志物C0L4A2基因在制备检测三阴乳腺癌 试剂或治疗抗三阴乳腺癌药物中的应用。
[0014] 进一步，本发明的目的还在于提供上述的SiRNA分子或干扰质粒载体或药物组合 物在制备治疗抗三阴乳腺癌药物中的应用。
【附图说明】
[0015] 图1各组细胞C0L4A2基因的mRNA的相对表达水平
[0016] 图2C0L4A2干扰质粒干扰效率
[0017] 图3干扰载体对细胞C0L4A2蛋白表达的影响
[0018] 图4干扰处理后C0L4A2蛋白干扰效率
【具体实施方式】
[0019] 实施例1Real-timePCR检测各乳腺癌细胞中C0L4A2基因mRNA表达
[0020] 一、实验材料：
[0021] 各个细胞及其培养基：
[0022] (1)MDA-MB-231 ：L15+10%FBS
[0023] (2)MCF-7 :DMEM-H+10%FBS+0. 01mg/ml胰岛素
[0024] (3)BT-474 :RPMI1640++10%FBS+0.Olmg/ml胰岛素
[0025] (4)SK-BR-3:RPMI1640++10 %FBS
[0026] 二、实验方法：
[0027] 2.1细胞总RNA提取：
[0028] 收集转染后培养细胞约IX106个，用PBS洗2次；将lml预冷的TRNzol加到离心管 中，混勻后，室温放置l〇min，4°C，lOOOOrpm离心10min，取上清，移至新的离心管；加0. 2ml 氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min;4°C，lOOOOrpm离心10min，取上层无色水相， 移至新的离心管，加入等体积异丙醇，混勻，室温放置15min;4°C，lOOOOrpm离心10min，去 上清，加入lml75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀；4°C，5000rpm离心3min，去上清，室温晾 干，加入30iilRNase-free水溶解沉淀。
[0029] 2. 2提取RNA鉴定及检测：
[0030] 提取的RNA50倍稀释后检测0D260、0D280，根据1 0D260 = 40iig/mL计算RNA的 含量；根据0D260/0D280的值评价RNA纯度，比值在1. 8-2. 0范围说明RNA的纯度较好，同 时琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。提取的RNA-70°C保存。
[0031] 2. 3 反转录：
[0032] 以已经提取的细胞总RNA为模板，使用Takara反转录试剂盒进行cDNA的合成。根 据RNA浓度，取0. 5ygRNA进行反转录操作。其余产物-20°C保存。
[0033] 2. 4RealtimePCR：
[0034] 设计并制备C0L4A2(扩增长度263bp)及beta-actin(扩增长度：318bp)扩增引 物，按下述反应体系和反应条件进行PCR扩增反应；反应结束后，收集溶解曲线：从56°C开 始，每升高〇. 5°C反应30s，直至95°C结束。
[0035] 表 1RealtimePCR反应引物
[0036]
【主权项】
1. C0L4A2基因或C0L4A2蛋白在制备三阴乳腺癌标志物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，C0L4A2基因的mRNA或C0L4A2蛋白在三 阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中高表达。
3. -种干扰三阴乳腺癌细胞中C0L4A2基因表达的siRNA分子，其特征在于，所述 siRNA分子选自序列表SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 6序列中的任意一种或几种。
4. 根据权利要求3所述的siRNA分子，其特征在于，所述siRNA分子为SEQ ID NO 5或 SEQ ID NO 6〇
5. -种干扰三阴乳腺癌细胞中C0L4A2基因表达的干扰质粒载体，其特征在于，所述干 扰质粒载体包括权利要求3或4中的siRNA。
6. -种药物组合物，其特征在于所述药物组合物，包含权利要求3-4所述的siRNA分 子，或者包含权利要求5所述干扰质粒载体。
7. -种三阴乳腺癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上游检测引物和下游检 测引物，上游检测引物序列为SEQ ID NO 14,下游检测引物序列为SEQ ID NO 15。
8. 权利要求7所述的三阴乳腺癌检测试剂盒在制备检测三阴乳腺癌辅助诊断或者预 后制剂中的应用。
9. 三阴乳腺癌标志物C0L4A2基因在制备检测三阴乳腺癌试剂或治疗抗三阴乳腺癌药 物中的应用。
10. 权利要求3-4中任一项所述的siRNA分子或权利要求5所述干扰质粒载体或权利 要求6所述的药物组合物在制备治疗抗三阴乳腺癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种三阴乳腺癌标志物COL4A2及其应用。发明人通过对不同细胞系进行比较研究，在三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231中发现一个特异表达的基因COL4A2，发明人进一步设计合成干扰COL4A2基因表达的序列并将其分别构建到质粒载体上，转染细胞MDA-MB-231，成功获得高效干扰COL4A2基因表达的序列。本发明提供的三阴乳腺癌标志物基因及高效干扰标志物基因的siRNA具有重要的临床应用价值。
【IPC分类】C12N15-113, C12N15-63, C12Q1-68, A61P35-00, A61K48-00
【公开号】CN104531710
【申请号】CN201410837151
【发明人】何劲松, 陈伟财, 叶伟亮, 孙婕, 俞莉敏
【申请人】何劲松
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月30日