苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-BlS396A及其抗逆应用，具体涉及 一种苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-BlS396A的载体构建及其转基因苹果愈伤在抗盐逆境 方面的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。 二、
【背景技术】
[0002] 植物一生中经常遭受各种不良环境和病虫害的侵袭，在长期的适应与进化过程 中，植物形成了一系列防御反应机制，用来抵抗不良环境的伤害。其中，环境胁迫主要包括 各种生物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫主要来自昆虫、食草动物、植物病菌等；非生物胁迫 种类众多，包括干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等胁迫。为了适应繁杂多变的环 境，减少不利环境对机体的伤害，植物体内演化出了涉及多基因、多信号途径、多基因产物 的复杂过程。
[0003] 苹果是世界性果品，是温带地区的主要栽培树种。其适应能力较强，果品营养价值 较高，耐贮性好，供应周期长，世界上很多国家都将其列为主要消费果品而大力支持。但是 在苹果的生长发育过程中，许多非生物胁迫是影响苹果地理分布和产量提高的主要限制因 子，尤其是高盐、干旱和低温等，世界苹果生产国都把选育抗盐、抗旱、抗寒等优质苹果新品 种作为主要育种目标。由于苹果是多年生木本植物，遗传背景复杂、杂和度高、童期长、自交 亲和性差等诸多问题给遗传育种带来了很大障碍，常规育种进展缓慢。而苹果愈伤组织是 研宄植物生长、分化、发育及抗性生理等良好的实验体系，也是植物种质离体保存、细胞工 程材料创建以及遗传转化体系建立等重要工作的基础。并且近年来，随着苹果基因组的测 序（Velasco等，2010)的完成、以及迅速发展的现代生物技术为解决这些问题开辟了新途 径，通过基因工程技术有目的提高果树抗盐、抗旱、抗寒能力，成为果树遗传改良的重要研 宄方向，大量植物抗逆功能基因的分离和鉴定则为基因工程遗传改良提供了目的基因。
[0004] V-ATPase普遍存在于真核细胞中不同内酸性细胞器膜上。它是由两个亚复合体 组成的多亚基酶：外部的VI复合体主要负责ATP水解，膜内嵌的V0复合体主要负责质子转 运（Gaxiola等，2007)。V-ATPase活性主要取决于复合体的可逆组装和V-ATPase亚基基 因的动态表达（Kane, 2012 ;Liberman等，2013)。编码这些V-ATPase亚基的基因被确定与 V-ATPase活性正相关，在植物（或细胞）生长发育及对非生物胁迫的响应中发挥至关重要 的作用（Gaxiola等，2007 ;Silva和Ger6s，2009 ;Hu等，2012)。在拟南芥和苹果中，VI亚 基VHA-B存在三种亚型（为VHA-B1，VHA-B2和VHA-B3所编码）具有序列和功能上的差异 (Gaxiola等，2007)。
[0005] 目前对V-ATPase亚基基因的研宄主要集中在拟南芥、水稻，小麦上等少数模式植 物上，而在果树方面研宄较少。由于诸多方面的原因，可耕土地面积越来越少，再加上低 温、干旱、土壤盐渍化和病、虫害导致果树的种植面积和范围受到严重影响。因此挖掘苹果 V-ATPase亚基基因并进行功能研宄，为果树抗逆转基因育种提供潜在的有效候选基因，不 但具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。苹果转基因育种多在苹果砧木上进行， 而苹果砧木主要生活在地下，不开花坐果，减少了基因工程在果树应用上的争议。
[0006] 随着人们对苹果品质的要求越来越高，品种的改良问题成为科研工作者的一项重 要任务，因此苹果育种在世界各国果树研宄工作中不断得到加强。但是，苹果为多年生木本 植物，通过常规育种选育抗性品种周期长。本发明从苹果中分离到了一个V-ATPase亚基基 因MdVHA-Bl，通过将其396位置处的丝氨酸残基突变为丙氨酸而得到MdVHA-BlS396A基因； 将MdVHA-BlS396A基因在苹果愈伤中过量表达表明：它能够进一步提高其抗盐能力。通过 实验证明转基因苹果愈伤抗盐能力提高，提供了一种新的、快速的育种途径，尤其是在转基 因苹果砧木中，MdVHA-B1S396A基因的发掘不仅能为苹果抗逆基因工程提供新的候选基因， 丰富植物抗逆基因工程理论体系，而且对于培育其它植物的抗逆种质材料（包括一年生植 物和多年生木本植物）也具有重要的现实意义。 三、
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明提供了一种苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及 其抗逆应用，同时提供了该基因在获得抗逆，尤其是在抗盐的转基因苹果中的应用，并可应 用于生产改良其他粮食作物或经济作物。
[0008] 本发明中提供的苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-BlS396A来自嘎啦苹果的cDNA。 [0009] 本发明利用同源克隆获得了苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-Bl，然后采用两轮搭 桥PCR的方法获得单位点突变的MdVHA-BlS396A基因，MdVHA-BlS396A基因核苷酸序列如 SEQ.ID.NO. 1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示。具体方法如下：
[0010] 从经200mMNaCl盐处理24h的嘎啦苹果组培苗中提取总RNA，反转录得到cDNA。 利用拟南芥基因组数据库中已发布的拟南芥中V-ATPase亚基基因AtVHA-Bl的核苷酸序 列，在苹果基因组数据库中blast，找到同源序列（序列号MDP0000945182)，然后设计引 物，以嘎啦苹果组培苗cDNA为模板进行常规聚合酶链式反应（Polymerasechainreact ion，PCR)。将符合片段大小的PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5a感受态 细胞，筛选重组子，并进行测序分析确认，从而获得MdVHA-Bl基因的cDNA全长序列。
[0011] MdVHA-Bl基因的开放阅读框（openreadingframe, 0RF)为 1473bp。由此推得， 该基因编码491个氨基酸，预测分子量约为54. 50kDa。因该基因与拟南芥AtVHA-Bl基因 同源相似性为92. 86%，因此我们将该基因命名为苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-Bl，而将 V-ATPase亚基基因MdVHA-B1396位置的Ser突变为Ala后的基因命名为MdVHA-B1S396A(其 核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示）。
[0012] MdVHA-BlS396A基因序列如下：
[0013] 序列表：
[0014] (l)SEQ.ID.N0. 1 的信息
[0015] (a)序列特征
[0016] 长度：1473bp
[0017] 类型：核酸
[0018] 拓扑结构：线性
[0019] (b)分析类型：cDNA [0020] (c)假设：否
[0021] (d)反义：否
[0022] (e)最初来源：苹果（Malusdomestica)
[0023] (f)序列描述：SEQ.ID.NO. 1
[0024] 〈110>山东农业大学
[0025] 〈120>苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-BlS396A及其抗逆应用
[0026] <160>26
[0027] <210>1
[0028] <211>1473
[0029] <212>cDNA
[0030] 〈213> 苹果（Malusdomestica)
[0031] <400>1
[0032]
【主权项】
1. 一种苹果MdVHA-Bl单个位点突变后的MdVHA-BlS396A基因，其特征在于其核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 1所示；该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
2. 如权利要求1所述的苹果MdVHA-BlS396A基因在提高苹果愈伤抗盐胁迫能力中的应 用。
【专利摘要】本发明涉及一种苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用，从苹果中分离到了MdVHA-B1基因，然后通过两轮PCR搭桥的方法将396位置处的丝氨酸残基突变为丙氨酸得到MdVHA-B1S396A基因；该基因在苹果王林愈伤中过量表达能进一步提高转基因苹果愈伤的表达水平，同时进一步增强转基因苹果愈伤的抗盐等逆境能力。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-29, C12N15-82
【公开号】CN104531718
【申请号】CN201410797205
【发明人】郝玉金, 胡大刚, 孙翠慧
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月19日