一种C型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种C型3 -葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，具体涉及的 是一种酶活性显著提高的C型3 -葡萄糖苷酶突变体及其构建方法，属于生物工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] C型，-葡萄糖苷酶（，-C-吡喃葡萄糖苷水解酶，E.C. 3. 2. 1. 21)是一类能水解 苷类和寡糖的糖苷键并释放非还原性末端葡糖残基的酶。这些酶普遍存在于所有领域的生 命体中，在古细菌、真细菌和真核生物中发挥多种功能和作用。包括微生物内的生物质转 换、动物体糖脂和外源性糖苷的降解、细胞壁寡糖的木质化和分解代谢、防御、植物激素结 合共轭激活作用、植物中气味释放以及植物-微生物和植物-昆虫相互作用等。
[0003] 白蚁是自然界中纤维素的最主要消耗者，白蚁主要通过内源和外源纤维素酶的协 同作用分解纤维素，最终转化为葡萄糖。白蚁体内就是一个微型的生物发酵器，若能模拟白 蚁的纤维素酶降解系统，工业化纤维素-葡萄糖-酒精-燃料的生产体系必是解决当前环 境问题能源危机的一条重要途径。
[0004] 至今，国内外对白蚁体内的内源性C型葡萄糖苷酶的研究已经逐步加深，目前 人们主要集中在对该酶进行结构功能研究，并通过改造获得高表达、高活性的0 -葡萄糖 苷酶用于工业经济应用（Zhang，etal.，2010)。目前已有的研究显示，该类纤维素水解 酶的催化效率较低、人工提取和表达的酶纯化难度较大，若能通过同源建模等手段进行理 性分子设计，对白蚁内源性葡萄糖苷酶蛋白的催化活性、稳定性、底物特异性、耐热性 和耐酸碱性等进行合理化改造，将使此类酶具有更大的应用前景，实现巨大工业经济价值。 Hsiao-linLee等人（Mutationsinthesubstrateentranceregionof3-glucosidase fromTrichodermareeseiimproveenzymeactivityandthermostability)已经在来源 于里氏木霉的0 -葡萄糖苷酶中研究了突变后的酶，获得了一些活性增强的突变体。
[0005] 本发明从台湾家白蚁的cDNA中克隆得到C型葡萄糖苷酶(命名：CfBG GlulC)，根据蛋白质结构预测和同源性序列分析，找出了一系列突变位点，在这些氨基酸位 点上进行点突变，得到了一系列突变体酶。经过蛋白质表达与验证，发现有几个突变体酶的 催化活性显著增强。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是通过基因工程的手段对白蚁C型葡萄糖苷酶（CfBGGlulC) 进行定点突变改造，得到酶活性显著提高的C型3 -葡萄糖苷酶突变体，使该酶能更好的应 用到工业生产和实际应用中。
[0007] 本发明提供的一系列定点突变改造的C型0 _葡萄糖苷酶突变体，是由来源于白 蚁的C型葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)进行定点突变产生的。
[0008] 原亲本C型0 -葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，其 特征在于原亲本氨基酸序列的第170位的赖氨酸K分别变为丝氨酸S和色氨酸W，第182位 的苯丙氨酸F变为甲硫氨酸M，第252位的氨基酸组氨酸H变为天冬酰胺N。
[0009] 将定点突变改造获得的C型葡萄糖苷酶突变体质粒转入大肠杆菌DH5a (Novagen公司）中，筛选阳性克隆，提取质粒测序后与模板序列SEQIDNO. 1比对，确认得 到四个酶活显著提高的突变体。
[0010] 突变体的表示方法为：GlulC-原始氨基酸-位置-突变后氨基酸，所述突变体为： GlulC-K170S、GlulC-K170W、GlulC-F182M、GlulC-H252N。
[0011] 本发明的另一目的是提供一种包含有c型0 -葡萄糖苷酶突变体DNA序列的突变 质粒； 本发明的另一目的是提供一种含有上述突变质粒的重组突变菌株。
[0012] 所述突变体构建的具体步骤如下： (1)突变表达载体的构建： 本发明从实验室饲养的台湾家白蚁的唾液腺和肠道组织中，提取出RNA，经过反转录， 得到cDNA。
[0013] 在NCBI基因数据库查到台湾家白蚁的葡萄糖苷酶基因（GenBank登录号为 奶，根据序列同源性，设计扩增引物，以得到的台湾家白蚁cDNA为模板进行PCR扩 增，将扩增产物插入到载体pET_28a(Novagen公司）上的多克隆位点沒aMlI和通oI之 间，转入feWi.DH5a(Novagen公司）感受态细胞中，筛选转化子，测序后与已有的序列 奶比对，不完全相同，本实验室得到的重组质粒称为pET-28a-GlulC。
[0014] 将所得重组质粒转化入及?o/i.BL21 (DE3) (Novagen公司）进行表达，得到C型 3 -葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)，作为活性测定的对照。
[0015] 我们在此酶的基础上，对其基因进行突变改造，以pET-28a-GlulC为模板，设计含 有突变位点的核苷酸序列引物，扩增通过PCR扩增得到突变质粒全长序列，将其利用Dpn I消化DNA模板后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段，经T4DNA连接酶处理后，将 连接产物直接转化到及'Oh'.DH5a(Novagen公司）的感受态细胞中，筛选转化子，提取质粒 测序，看相应位点上的氨基酸是否突变成功。突变成功的重组质粒称为pET-28a-GlulC-X (X为原始氨基酸-位置-突变后氨基酸)分别转化BL21 (DE3) (Novagen公司）进行 表达，即得到对应的突变体表达菌株。
[0016] (2)重组突变体表达菌株诱导表达产生突变体酶 将突变体表达菌株活化后，以1%的接种量转接入200mL的LB培养基(含50 y g/mL的卡 那霉素）中振荡培养，待〇D_约为0.4时加入0. 2mM的诱导剂IPTG，25°C振荡培养6h。收 集菌液，10000g离心收集菌体，加入20mLTris-HCl缓冲液超声破碎，离心取上清得到突变 体酶，分别测定酶活性。
[0017] 本发明的优点： 通过定点突变技术，对台湾家白蚁C型葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)第170位的赖氨 酸K、第182位的苯丙氨酸F和第252位的组氨酸H进行改造，构建了C型葡萄糖苷酶突 变体，显著提高了C型葡萄糖苷酶的酶活，本发明得到的突变体分别为GlulC-K170S、 GlulC-K170W、GlulC-F182M、GlulCH252N，这四株突变体的酶活都有了不同程度的提高， 分别为5. 2倍、2. 05倍、2. 9倍、2. 1倍。这对现今降解生物质尤其是纤维素类具有重大的意 义，可以使自然界中的秸杆等在葡萄糖苷酶的促进催化作用下，更好更快速的降解产 生葡萄糖，实现催化过程的高效优化。产生的葡萄糖又可以进一步参与更多的工业过程，如 生物燃料乙醇的生产，生物洗涤剂等一系列相关工艺。通过改造3 -葡萄糖苷酶使其活性 增强，更能满足社会生产的要求，有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明中所得的突变体的突变位点处核苷酸示意图，箭头指向位点为突变 位点； 图2为本发明构建的突变株以及原始菌株中C型0-葡萄糖苷酶的表达情况； 图3为本发明构建的突变株以及原始菌株表达酶的酶活性情况。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0020] 实施例1:突变表达质粒的构建及重组大肠杆菌的获得 1.突变表达质粒的构建 根据蛋白质结构预测和同源性序列分析，找出了一系列突变位点，在这些氨基酸位点 上进行点突变，得到了一系列突变体酶。经过蛋白质表达与验证，发现有几个突变体酶的催 化活性显著增强。构建过程如下： (1)从实验室饲养的台湾家白蚁的唾液腺和肠道组织中，提取出RNA，经过反转录，得到cDNA。
[0021] (2)在NCBI基因数据库查到台湾家白蚁的e-葡萄糖苷酶基因根据 序列同源性，设计扩增引物，对步骤（1)得到的白蚁cDNA进行扩增，PCR扩增后，将扩增产 物插入到载体pET_28a(Novagen)上的相应的多克隆位点沒aMlI和通oI之间，转化入 i?coJ7.DH5a(Novagen)感受态细胞中，筛选转化子，测序后与已有的序列比 对，不完全相同，本实验室得到的重组质粒称为pET-28a-GlulC。
[0022] 带有限制酶^i/?dIII和ZAoI的酶切位点的扩增引物序列如下： F:BamHI5'-CGGGATCCATGTCTGCCCTGAAGTTTCC R:XhoI5'-CCGCTCGAGTCAATGAGAAGTCTCGAC (3)将得到的重组质粒pET-28a-GlulC转化入BL21 (DE3) (Novagen)进行表达， 得到C型0 -葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)。
[0023] (4)我们在此酶的基础上，对其基因进行突变改造，以pET-28a_GlulC为突变模 板，设计含有突变位点的核苷酸序列引物，以pET-28a-GlulC为扩增模板，通过PCR反应得 到包含突变氨基酸的全长质粒片段。
[0024] 用于定点突变的引物为：（下划线部分为突变位点）
【主权项】
1. 一种重组质粒，称为pET-28a-GlulC，其特征在于，所述重组质粒源于pET-28a，并包 含有白蚁的葡萄糖苷酶基因DNA序列，其中所述的白蚁的葡萄糖苷酶基因DNA序 列的GenBank登录号为
2. -种C型0 -葡萄糖苷酶，其特征在于，所述C型0 -葡萄糖苷酶由权利要求1所述 的重组质粒转入价〇7i. BL21 (DE3)表达所得。
3. -种C型3 -葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体是对权利要求2所述的C 型葡萄糖苷酶进行定点突变得到。
4. 根据权利要求3所述的一种C型3 -葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体的 氨基酸序列为以下任意一项所述： (1) SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第170位的赖氨酸K变为丝氨酸S或色氨酸W; (2) SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第182位的苯丙氨酸F变为甲硫氨酸M; (3) SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第252位的氨基酸组氨酸H变为天冬酰胺N。
5. 编码如权利要求4所述的一种C型0 -葡萄糖苷酶突变体的DNA序列。
6. -种突变质粒，称为pET-28a- GlulC-X (X为原始氨基酸-位置-突变后氨基酸)， 其特征在于，所述质粒包含有权利要求5所述的C型0 -葡萄糖苷酶突变体的DNA序列。
7. -种突变体表达重组菌株，其特征在于，所述菌株包含有权利要求6所述的突变质 粒。
8. -种C型0 -葡萄糖苷酶突变体酶，其特征在于，所述突变体酶由IPTG诱导剂诱导 权利要求7所述的突变体表达菌株获得。
【专利摘要】本发明涉及一种C型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，具体涉及的是一种酶活性显著提高的C型β-葡萄糖苷酶突变体及其构建方法，属于生物工程技术领域；本发明将来源于台湾白蚁的β-葡萄糖苷酶进行定点突变，将第170位的赖氨酸K分别变为丝氨酸S和色氨酸W，第182位的苯丙氨酸F变为甲硫氨酸M，第252位的氨基酸组氨酸H变为天冬酰胺N，分别表示为Glu1C- K170S、Glu1C- K170W、Glu1C- F182M、Glu1C- H252N；本发明所得到的突变体的酶活性与突变前相比分别提高了5.2倍、2.05倍、2.9倍、2.1倍；本发明所得四株C型β-葡萄糖苷酶突变体的酶活都有了不同程度的提高，更适合于生物催化工艺的应用，为工业化应用提供了有利的基础，更能满足社会生产的要求，有广阔的市场前景。
【IPC分类】C12N9-42, C12R1-19, C12N15-70, C12N15-56, C12N1-21
【公开号】CN104531743
【申请号】CN201410801031
【发明人】王继峰, 吴黎明, 冯婷婷, 刘海涛, 周阳, 施海峰
【申请人】江苏大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月22日