一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种培育耐盐水稻的方法，属于植物育种技术领域，更具体地说是一 种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法。
【背景技术】
[0002] 土壤的盐渍化是影响农业与生态环境的一个严重问题。我国的耕地总面积19. 5 亿亩，其中20%存在着不同程度的盐渍化和次生盐渍化，滩涂共计1.4亿多亩。此外还有 5. 2亿亩内陆盐碱化土壤，其中盐碱地1. 5亿亩。人们曾试图通过合理的排灌、淡水洗涤、施 用化学改良剂等方式来改造盐碱地，但常因耗资巨大，见效少而难以推广。于是把目光转 向发掘和培育耐盐作物方面。国内外在培育耐盐水稻新品种方面，主要集中在两个方面：
[0003] -是对地方农家水稻品种进行筛选，驯化成具有经济价值的耐盐品种，但由于水 稻品种具有特殊多样化的生态条件，适应性相对较窄的特点，因此筛选出来的耐盐资源大 多没能在实践中得到有效利用，更没有进入盐碱地区进行生产应用，目前，我国沿海滩涂和 盐碱地主要是中低产田，适合我国种植的耐盐水稻很少，水稻亩产量只有200公斤左右。
[0004] 二是随着分子生物学技术的发展，借助生物技术和杂交育种，改造并提高水稻的 耐盐性，培育耐盐新品种日益成为热点。目前已有一些导入单个基因提高植物耐盐性的报 道，如通过基因工程手段，使植物细胞产生和积累某些低分子有机化合物，如甜菜碱、脯胺 酸、糖醇类等以维持渗透势平衡和体内水分，能在一定程度上提高植物的耐盐性，但目前 大多还处于实验室研宄阶段。突出的例子是陈受宜等转入甜菜碱脱氢酶（BADH)基因的水 稻，经盐胁迫筛选得到转化植株在0. 5%NaCl的盐池中多数生长基本正常，但结实率仅为 10%。目前还没有得到真正意义上的耐盐水稻作物，其原因主要是植物的耐盐机制十分复 杂，是一种数量性状，受多基因控制，因此转移单个基因往往只能获得部分耐盐性，要获得 具有经济价值的耐盐作物可能需要同时转移多个基因，而目前在识别和分离耐盐基因以及 同时操作多个基因方面尚有很大困难。
[0005] 自从上世纪50年代联合国教科文组织提出耐盐植物开发研宄的方向以来，盐土 农业作为一种新兴的农业模式正在逐渐兴起。2013年4月，国际水稻研宄所称，通过野生稻 种杂交已经培育出一种新型耐盐水稻，可以在海水侵蚀的滨海土地种植，但目前仍处于对 品种性能进行改进和评定的阶段，若要田间试种至少还需4到5年（参见Salt-tolerant ricebredatPhilippinesinstituteApr16,2013)。日本理化学研宄所尝试用重离 子培育耐盐水稻，但目前也还处于实验室研宄阶段。另有报道，泰国国家遗传工程和生 物技术中心植物细胞技术实验室的主任ChalermpolKirdmanee2001年在实验室中发现 了 4株能耐2%NaCl的泰国香水稻，但是一直没有关于最新进展的后续相关报道（参见 Transcriptionalregulationsofthegenesofstarchmetabolismandphysiological changesinresponsetosaltstressrice(OryzasativaL)seedlings)，2005 年中国 科学院上海生科院植物生理生态所宣布：水稻耐盐功能基因研究在沪取得重大突破性进 展。该所与美国专家合作，成功克隆了与水稻耐盐相关的数量性状基因，但距离实际应用 尚需时曰。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，该方法 中运用花粉管通道技术将盐生植物的总DNA转移，实现超远缘遗传物质的转移，能同时导 入多个基因，达到耐盐植物分子育种的目的。
[0007]本发明为一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)提取盐生植物芦苇叶片DNA作为供体；
[0009] (2)取水稻9311、盐559、7海76、7海74作为受体，在盛花期选择正在开花的稻 穗，去除未开过的颖花和已开过的颖花，每穗只留下当天刚开的颖花约20朵；1. 5?2. 0小 时后剪去小穗内颖，并将1/3?1/2的花柱连同柱头一起剪去；立即用微量注射器在刚剪去 柱头的花柱切面上滴注含外源DNA溶液2?3yL;注射时间：水稻开花后1?3小时进行， DNA溶液浓度是250?300yg/ml，导入量是10-20y1，套上杂交袋以防止水份蒸发，25? 30天后收获％代种子；
[0010] (3)收获的％代种子全部播种，经观察，各导入系基本无变异或变异不明显，分别 全收各株的种子为种子；
[0011] (4)将0:代种子分为两组，第一组在含盐分浓度为5%。的塑料盆中进行种子发芽 和育苗，对种子进行耐盐性筛选，选留健壮幼苗移栽到普通无盐大田，进行常规栽培，观察 变异情况，选留生长正常的单株收种；第二组种子则种植于普通水田内发芽和育苗以及全 过程生长，选留变异株，进行单株收种；盐筛和非盐筛所选留的各单株收种称为％代种子；
[0012] (5)将收获的D2种子再在盐池盐度为4%。?5%。的条件下进行耐盐性筛选，以未导 入外源DNA的受体作为对照，进行水稻生长的耐盐性和产量品质性状的筛选鉴定，筛选生 长正常的单株，收获〇 3代种子；
[0013] (6)将收获的D3代种子在盐池盐度为4%。?5%。的条件下进行耐盐性筛选，以未导 入外源DNA的受体作为对照，进行水稻生长的耐盐性和产量品质性状的筛选鉴定，筛选生 长正常的单株，收获比代种子；
[0014] (7)在盐池盐度为5%。的条件下进行多代筛选，直至D6代植株基本稳定；
[0015] (8)同时，培育出与双8S/海湘4号C815S杂交获得F#植株；
[0016] (9)将收获的D6代株系的种子与获得的Fi代单株种子分别在盐分为2%。和4%。、 6%。不同梯度的江苏盐城滩涂盐地中进行田间试种，选育出耐盐性高、生长好、产量高的新 品种或新品系，以未导入外源DNA的受体作为对照；
[0017] (10)次年，将新品系或新品种在盐分为3%。-4%。的江苏盐城滩涂盐地中进行50亩 "耐盐水稻高产示范区"中展示，以未导入外源DNA的受体作为对照，进行水稻生长的耐盐性 和产量品质性状的筛选鉴定。
[0018]在本发明中，由该方法得到的耐盐水稻新品种或新品系的新的DNA片段，其编码 序列为序列表1中所示。
[0019] 综上所述，本发明运用花粉管通道技术将盐生植物的总DNA转移的方法，操作简 单，具有无基因型限制和易于实现大规模基因转化的特点，可以在任何开花植物和不同物 种之间实现基因的转移，并省略了组织培养过程，避免了植物组织培养过程中可能产生的 各种无法预测的不利影响，能同时导入多个基因，达到耐盐植物分子育种的目的。
[0020] 本发明的的有益效果为：
[0021] (1)供体材料新。从发掘、搜集的十余种盐生植物种质资源中选出芦苇，是培育创 制耐盐水稻的核心种质材料；以盐生植物芦苇总DNA作为供体材料，区别于克隆分离单个 耐盐相关基因转化受体植物；
[0022] (2)导入方法新。尽管以前有人通过花粉管通道将外源基因导入植物，但就其固有 的研宄目的和操作细节而言都与本发明所述的大不相同。本发明建立了关于水稻的程序化 导入方法。通过花粉管通道导入芦苇总DNA进行耐盐水稻育种是首次应用；
[0023] (3)筛选方法新、效果明显。该盐筛方法是先将种子盐筛；幼苗至全生育期在人工 盐池筛选；大田选育；盐滩田间种植成功，可以逐步进入盐滩地大田生产中应用；一般转基 因植物在实验室可能有一定的耐盐性，而一旦进入大田中其耐盐性状就不明显了；
[0024] (4)育种周期短。通过常规育种获得稳定株系一般需要8-10年，而通过该方法培 育的水稻株系仅仅只用了 3-4年就稳定了；
[0025] (5)利用本发明育成的耐盐水稻新品系耐盐性好、产量高
[0026] 在2012年5月将培育出的一批性能稳定的耐盐水稻新品系21个组合或株系，在 江苏盐城沿海滩涂进行不同梯度盐分2%。、4%。、6%。（低、中、高）进行田间中试，海湘030、 海湘016、海湘121表现突出，育种时间较一般的常规育种缩短了一半。2013年，将海湘030、 海湘016、海湘121三个耐盐水稻新品系在盐城沿海滩涂50亩"耐盐水稻高产示范区"中展 示，在3%。_4%。盐分下对照品种全部死亡绝收而这三个耐盐水稻表现优异，其中海湘030最 好，株高100厘米左右、整齐一致，亩产达817斤。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明培育耐盐水稻及田间中试示意图；
[0028] 图2为海湘030、海湘016、海湘121三个耐盐水稻新品系在盐度为3%。的江苏盐城 沿海滩涂种植图，其中030表示海湘030,016表示海湘016,121表示海湘121，对照株全死 亡；
[0029] 图3为海湘030、海湘016、海湘121三个耐盐水稻新品系在盐度为6%。一9%。的江 苏盐城沿海滩涂种植图，其中030表示海湘030,016表示海湘016,121表示海湘121，CK为 水稻9311对照株；
[0030] 图4为海湘030、海湘016、海湘121三个耐盐水稻新品系在3%。一4%。的江苏盐城 沿海滩涂50亩"耐盐水稻高产示范区"中展示图；
[0031] 图5为水稻海湘030的长势图；
[0032] 图6为转基因水稻植株PCR扩增检测结果。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明：
[0034] 下述实施例中所用的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] -、耐盐水稻的培育
[0036] 1 ?材料
[0037] 供体：盐生植物芦苇
[0038] 受体：水稻9311、盐恢559、7海76、7海74
[0039] 2.具体操作步骤如下所述：
[0040]