一种应用乙酰辅酶a合成聚3-羟基丙酸的方法

文档序号:8208857阅读:588来源:国知局
一种应用乙酰辅酶a合成聚3-羟基丙酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学技术领域,特别是涉及一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法。
【背景技术】
[0002]3-轻基丙酸(3-hydroxyprop1nic acid,缩写为 3-HP)分子式 C3H6O3,一种糖楽状物质,易溶于水、乙醇、乙醚,一般用于有机合成。从化学结构上看,3-HP与乳酸互为同分异构体,该分子带有两个官能团羟基和羧基,是很多光学活性物质的前体。能够作为生物源聚合物的单体,而受到各国科学家的关注。工业上,3-HP是近年来兴起的一种重要的化学中间体,如3-HP可作为合成生物可降解热塑性聚酯(PHA)的原料,合成聚3-羟基丙酸的单体及杀虫剂。还可用于生产涂料、胶黏剂、水处理化学品和个人护理用品。另外,与醇酯化作用生成酯,氧化生成丙二酸,脱水生成丙烯酸,还可通过还原作用生成1,3_丙二醇等。其中1,3-丙二醇可用作溶剂、抗冻剂或保护剂以及新型聚酯-聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的单体。该聚酯具有优良的特性,如抗紫外,抗内应力、低水吸附、低静电及生物可降解,可循环利用。基于3-HP的这些优良特性,其在商业上具有重大的开发价值。2004年8月的美国能源部报告将3-HP列为当前世界上12种最具开发潜力的化工产品之一。
[0003]目前,国际上具有工业应用前景的3-HP的合成方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法生产3-HP主要有丙烯酸水合法,3-羟基丙醛氧化法,3-羟基丙腈水解法及雷福尔马斯基(Reformatsky)反应。
[0004]微生物发酵法的代表是美国卡吉尔(Cargi I I)公司和Code—种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法is公司共同合作研宄了 “以谷物类碳水化合物”生产3-HP的发酵新工艺,于2002年申请了专利。专利中论述了生产3-HP的两种方法:一种是构建基因工程菌,发酵后在胞内或胞外得到3-HP ;另一种是直接利用酶在无细胞体系中生产3-HP。
[0005]微生物发酵法虽绿色环保,但设备及生产过程复杂且国内发酵生产工艺不成熟,发酵时间较长,由于菌种的原因,生产出的产物提纯过程繁琐,产率也低,所得水溶液中3-HP的含量较低。此外生物法制备得到3-HP价格昂贵且来源不足,满足不了市场的需求,只有少量合成供实验室使用,应用前景有限。

【发明内容】

[0006]本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷,而提供一种产率更高,制备所需时间更短的应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法。
[0007]为实现本发明的目的所采用的技术方案是:一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,包括下述步骤:
[0008](I)构建共同过量表达内源或外源的乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)和丙酰辅酶A合成酶基因(prpE),以及外源的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)的重组宿主细胞;
[0009](2)将步骤(I)构建得到的重组宿主细胞在适当的培养基中培养发酵,添加表达诱导剂诱导适当的时间;
[0010](3)收集菌体,离心,水洗,冻干后,氯仿萃取,得到的聚3-羟基丙酸产物。
[0011 ] 所述宿主细胞为大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌。
[0012]所用构建重组宿主细胞的方法为分子克隆方法,即将步骤(I)中所述的各种酶构建到可诱导的启动子的控制下。
[0013]所述步骤(2)中的表达诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
[0014]所述的培养基为现有技术中适于大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌生长的培养基;所述培养基的碳源为成本低的葡萄糖。
[0015]所述乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)为沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因。
[0016]所述丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)为埃希氏菌属大肠杆菌的丙酰辅酶A合成酶基因。
[0017]所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)为橙色绿屈挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因。
[0018]所述聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)为产碱杆菌属真氧产碱杆菌的聚羟基脂肪酸合成酶基因。
[0019]本发明的工作原理及有益效果是:以葡萄糖作为原始材料,利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸,利用常规分子重组克隆技术将多种基因的核苷酸序列与适当的表达控制元件可操作性连接或彼此之间可操作性连接,然后克隆到适宜的大肠杆菌细胞中,并且筛选得到同时包含聚羟基脂肪酸合成酶、丙酰辅酶A合成酶、丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A羧化酶这四种酶活性的重组大肠杆菌菌株。与现有技术相比,乙酰辅酶A作为糖代谢的中间体,原料来源更广泛,成本更低;此外,从乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的过程中,生产工艺简单,成本低廉,具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0020]以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
[0021]实施例:
[0022]—种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,包括下述步骤:
[0023](I)构建共同过量表达内源或外源的乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)和丙酰辅酶A合成酶基因(prpE),以及外源的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)的重组宿主细胞;
[0024](2)将步骤(I)构建得到的重组宿主细胞在适当的培养基中培养发酵,添加表达诱导剂诱导适当的时间;
[0025](3)收集菌体,离心,水洗,冻干后,氯仿萃取,得到的聚3-羟基丙酸产物。
[0026]乙酰辅酶A是能源物质代谢的重要中间代谢产物,在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路——三羧酸循环和氧化磷酸化,经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水,释放能量用以ATP的合成。乙酰辅酶A是合成脂肪酸、酮体等能源物质的前体物质,也是合成胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。葡萄糖的有氧氧化会转化成丙酮酸,再转化成乙酰辅酶A,最后分解为C02+H20,此过程在只能有线粒体的细胞中进行,并且必须要有氧气供应。
[0027]所述宿主细胞为大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌。
[0028]所用构建重组宿主细胞的方法为分子克隆方法,即将步骤(I)中所述的各种酶构建到可诱导的启动子的控制下。
[0029]所述步骤(2)中的表达诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
[0030]所述的培养基为现有技术中适于大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌生长的培养基;所述培养基的碳源优选为成本低的葡萄糖或甘油。
[0031]所述乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)为沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因。
[0032]所述丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)为埃希氏菌属大肠杆菌的丙酰辅酶A合成酶基因。
[0033]所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)为橙色绿屈挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因。
[0034]所述聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)为产碱杆菌属真氧产碱杆菌的聚羟基脂肪酸合成酶基因。
[0035]本发明以葡萄糖作为原始材料,利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸,利用常规分子重组克隆技术将多种基因的核苷酸序列与适当的表达控制元件可操作性连接或彼此之间可操作性连接,然后克隆到适宜的大肠杆菌细胞中,并且筛选得到同时包含聚羟基脂肪酸合成酶、丙酰辅酶A合成酶、丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A羧化酶这四种酶活性的重组大肠杆菌菌株。与现有技术相比,乙酰辅酶A作为糖代谢的中间体,原料来源更广泛,成本更低;此外,从乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的过程中,生产工艺简单,成本低廉,具有广阔的应用前景。
[0036]以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,其特征在于:包括下述步骤: (1)构建共同过量表达内源或外源的乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)和丙酰辅酶A合成酶基因(prpE),以及外源的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和聚羟基脂肪酸合成酶基因(PhaC)的重组宿主细胞; (2)将步骤(I)构建得到的重组宿主细胞在适当的培养基中培养发酵,添加表达诱导剂诱导适当的时间; (3)收集菌体,离心,水洗,冻干后,氯仿萃取,得到的聚3-羟基丙酸产物。
2.根据权利要求1所述的一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌。
3.根据权利要求1所述的一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,其特征在于所用构建重组宿主细胞的方法为分子克隆方法,即将步骤(I)中所述的各种酶构建到可诱导的启动子的控制下。
4.根据权利要求1所述的一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,其特征在于所述步骤(2)中的表达诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
5.根据权利要求1所述的一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,其特征在于所述的培养基为适于大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌生长的培养基;所述培养基的碳源为葡萄糖。
6.根据权利要求1所述的一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,其特征在于所述乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)为沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因。
7.根据权利要求1所述的一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,其特征在于所述丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)为埃希氏菌属大肠杆菌的丙酰辅酶A合成酶基因。
8.根据权利要求1所述的一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,其特征在于所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)为橙色绿屈挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因。
9.根据权利要求1所述的一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,其特征在于所述聚羟基脂肪酸合成酶基因(PhaC)为产碱杆菌属真氧产碱杆菌的聚羟基脂肪酸合成酶基因。
【专利摘要】本发明公开了一种应用乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的方法,包括下述步骤:(1)构建共同过量表达内源或外源酶基因的重组宿主细胞;(2)将重组宿主细胞在适当的培养基中培养发酵,添加表达诱导剂;(3)收集菌体,离心,水洗,冻干后,氯仿萃取。本发明以葡萄糖作为原始材料,利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸,乙酰辅酶A作为糖代谢的中间体,原料来源更广泛,成本更低,生产工艺简单,成本明显降低。
【IPC分类】C12R1-22, C12R1-19, C12P7-62
【公开号】CN104531786
【申请号】CN201410763819
【发明人】李申
【申请人】燃点科技(天津)有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日
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