肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及一种诊断肝癌的标志物及 其用途。
【背景技术】
[0002] 肝癌是中国常见的恶性肿瘤，位居肿瘤发生率的第三位，死亡率的第二位。原发性 肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常见的肝癌类型。
[0003] 中国的肝癌患者占全世界发病率的54%，男性较女性更易发病。目前肝癌患者的 5年生存率不到5%。全世界每年大约有549000名患者死于此，且其发病率有逐年上升的 趋势（来自WHO死亡率数据库）。因此，加大对肝癌的防治力度对降低死亡率具有重要意 义。
[0004] 目前肝癌的诊断主要依靠影像学检查、肝穿刺组织学检查以及实验室检查。影像 学诊断在肝癌诊断中起重要的作用，但是在诊断小肝癌及区分良恶性结节中均具有一定的 局限性。肝硬化基础上肝内再生结节和发育不良的结节等良性病变较为常见，与肝癌的影 像学特征有一定的重叠，放射学检查对肝内小的良恶性病变鉴别仍很困难。与肝脏病理对 比，CT诊断肝癌的敏感度较低。有创的组织病理学检查是诊断肝癌的主要方法，即使是很好 的细针穿刺仍因取材有限而有较高的假阴性率，并且有使肿瘤扩散和针道种植的危险。因 此，临床仍需要高度敏感的血清肝癌特异性标志物来鉴别肝脏良恶性病变，或在高危人群 进行随访提高肝癌的早期诊断率。
[0005] 肝癌的早期诊断是提高患者生存率的一项最重要因素。目前在临床使用的肝癌血 清诊断标志物主要是甲胎蛋白（Alphafetoprotein,AFP)。虽然甲胎蛋白在肝癌的诊断中 起了积极的作用，但其敏感性和特异性还不令人满意，而且在新发病例中AFP阴性比例在 不断增加。
[0006] 因此，寻找新的具有诊断或联合诊断价值的肝癌血清标志物是当务之急，也是HCC 早发现早治疗的关键。因此，提供在肝癌组织和血清中特异高表达的基因或蛋白质具有重 要的诊断和治疗意义，本领域迫切需要开发用于检测或判断肝癌的血清特异标志物。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是提供一种可用于检测或判断肝癌的血清特异标志物及其用途。
[0008] YAP(Yes-AssociatedProtein)已被发现可促进细胞增殖及转化[1]。YAP在肝细 胞肝癌（HCC)中的过表达与较低程度的肿瘤分化具有显著的相关性[2]。近来的研宄表明， 核YAP的表达和活性的提高与胆酸诱导的HCC有着密切的联系[3]。在小鼠实验中，YAP过 表达使肝尺寸不可逆地增大4倍以上[4]。相反，敲除肝中的YAP不仅导致肝细胞存活中的 缺陷，还会导致胆管上皮细胞发育的重大缺陷[5]。这些结果表明，YAP活化在肝癌发展中 有着重要的作用。
[0009] YAP作为辅助因子能够提高几种转录因子的转录活性，这些转录因子包括TEAD、 ErbB4和Runx2 [6]。尽管已经鉴定了包括存活蛋白（Survivin)、CTGF和周期蛋白D1(Cyclin Dl)等数个影响HCC细胞去分化、抗细胞凋亡抗性和体内细胞生长的YAP靶基因[7-8]，但 还有哪些能够反映YAP功能似乎很有可能仍然不清楚，特别是那些可在血清中检测到并可 用作非侵入诊断肿瘤标志物的分子。膜蛋白很有希望用作候选分子，它们来自肿瘤损伤并 易于释放入血流中。但是，迄今仍没有肝癌特异性的YAP依赖性膜蛋白的详细报道。最近 的研宄表明，Hippo信号传导可导致YAP功能失活[9-10]。除Hippo信号传导外，YAP在肝 癌中的致瘤性的保持依赖于多种癌蛋白的配合作用，这些癌蛋白包括TRIB2、c-Myc、CREB、 MEK1和SRSF1 [11-15]。虽然逐渐鉴定了许多调节YAP功能的核和细胞质蛋白，但是可调控 YAP活性并可用作直接治疗靶的膜蛋白仍是未知的。
[0010] 在本发明中，申请人将黑素瘤细胞黏附分子（MCAM)鉴定为YAP依赖性肝癌的新型 血清肿瘤标志物。本申请人的实验结果同时证明，MCAM活性对于肝癌细胞存活和转化是至 关重要的，表明其可作为潜在的直接抗癌药靶加以应用。
[0011] 本发明的第一方面，提供了一种黑素瘤细胞黏附分子（MCAM)的基因、mRNA或cDNA 的用途，用作检测肝癌的标志物；或用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒。更优选，所述检测 是血清检测。
[0012] 在另一个优选实施方案中，所述试剂包括抗体、引物、探针、核酸微阵列（例如DNA 微阵列）或蛋白质微阵列。
[0013] 在本发明的第二方面，提供了MCAM或其特异性抗体的用途，用于制备检测肝癌的 诊断试剂或试剂盒。更优选，所述检测是血清检测。
[0014] 在本发明的第三方面，提供了用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：
[0015] (a)抗MCAM抗体；和/或
[0016] (b)特异性扩增MCAM的mRNA或MCAM的cDNA引物或引物对。
[0017] 在另一优选实施方案中，所述试剂盒还包含标签或说明书，所述标签或说明书注 明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌。
[0018] 在另一优选实施方案中，所述抗MCAM抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0019] 在本发明的第四方面，提供了检测肝癌的方法，其中所述方法包括：
[0020] (a)制备受试者测试样品；
[0021] (b)检测测试样品中MCAM的表达水平，并将检测到的表达水平与参比值相比较， 其中MCAM表达水平高于参比值表明受试者患有肝癌，或患肝癌的几率高于正常人群。
[0022] 在另一优选实施方案中，所述测试样品为组织样品、血液样品、血清样品或体液样 品。
[0023] 在另一优选实施方案中，所述参比值为非肝癌样品中的MCAM表达水平。
[0024] 在另一优选实施方案中，所述检测步骤b包括检测MCAMmRNA的量，或MCAMcDNA 的量；和/或检测MCAM的量。
[0025] 在另一优选实施方案中，所述检测步骤b包括通过RT-PCR或PCR方法进行检测。
[0026] 在另一优选实施方案中，所述检测步骤b包括使用抗MCAM蛋白抗体进行检测。
[0027] 在另一优选实施方案中，所述检测步骤b通过酶联免疫反应法（ELISA)实现。
[0028] 在另一优选实施方案中，所述抗MCAM抗体是单克隆抗体或多克隆抗体（如抗血 清）。
[0029] 在另一优选实施方案中，所述方法还包括评估测试样品中其它肝癌标志物的表达 水平。
[0030] 在另一优选实施方案中，所述其它肝癌标志物包括：甲胎蛋白AFP、AFP异构体 AFP-L3、血清岩藻糖苷酶AFU、硫酸肝素蛋白多糖3GPC3、异常凝血酶原DCP、谷氨酰胺转移 酶II(GGTII)、GP73、骨桥蛋白OPN、TGF-0、DKK1、SCCA或其组合。
[0031] 在另一优选实施方案中，所述方法还包括评估测试样品中甲胎蛋白的表达水平。
[0032] 在本发明的第五方面，提供了MCAM或其特异性抗体的用途，用于制备血清检测肝 癌的诊断试剂或试剂盒。
[0033] 在另一优选实施方案中，MCAM或其特异性抗体偶联或带有可检测标记。
[0034] 在另一优选实施方案中，所述可检测标记选自：生色团、化学发光基团、荧光团、同 位素或酶。
[0035] 在另一优选实施方案中，所述诊断试剂是单克隆抗体。
[0036] 在另一优选实施方案中，所述试剂是蛋白微阵列。
[0037] 在另一优选实施方案中，所述核酸微阵列包括基片和点样在基片上的癌症相关基 因的特异性寡核苷酸探针，所述的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针包括与MCAM多核 苷酸（mRNA或DNA)特异性结合的探针。
[0038] 在另一优选实施方案中，所述蛋白质微阵列包括基片和点样在基片上的癌症相关 蛋白的特异性抗体，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体包括抗MCAM的特异性抗体。
[0039] 在另一优选实施方案中，所述特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0040] 在另一优选实施方案中，所述血清检测是ELISA或双抗体夹心时间分辨免疫荧光 法（TRFIA法）。
[0041] 在本发明的第六方面，提供了用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有容 器，所述容器中含有MCAM蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注 明所述试剂盒用于血清检测或诊断肝癌。
[0042] 在另一优选实施方案中，所述标签或说明书中注明以下内容：如果检测对象的血 清MCAM的浓度 >100ng/ml(优选 >500ng/ml，更优选 >1，000ng/ml，甚至更优选 >2,OOOng/ ml甚至更优选>2, 200ng/ml甚至更优选>2, 400ng/ml甚至更优选>2, 600ng/ml，最优选 >20, 000ng/ml)，则该对象发生肝癌的几率大于正常人群。ELISA数据表明，肝癌患者中血清 MCAM的浓度显著升高（n= 84, 20742. 48 ±19215. 08ng/ml)。
[0043] 在另一优选实施方案中，MCAM或其特异性抗体偶联或带有可检测标记。
[0044] 在另一优选实施方案中，所述肝癌包括肝细胞癌，尤其是原发性肝细胞癌。
[0045] 在另一优选实施方案中，所述可检测标记选自：生色团、化学发光基团、荧光团、同 位素或酶。
[0046] 在另一优选实施方案中，所述诊断试剂是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0047] 在本发明的第七方面，提供了用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有容 器，所述容器中含有特异性扩增MCAMmRNA或cDNA的特异性引物；以及标签或说明书，所述 标签或说明书注明所述试剂盒用于定量检测MCAM的表达水平来判断患肝癌的几率。
[0048] 在另一优选实施方案中，所述的标签或说明书中注明以下内容：如果检测对象的 MACMmRNA的量与一般人群中MACMmRNA的量之比>1. 5 (优选>2. 0,更优选>2. 5,甚至更优 选>5. 0最优选>10. 0)，则该对象发生肝癌的几率大于正常人群。
[0049] 在本发明的第八方面，提供了MCAM的用途，用作血清检测肝癌的标志物。
[0050] 在本发明的第九方面，提供了MCAM的拮抗剂的用途，用于制备抑制肝癌细胞生长 的药物。
[0051] 在另一优选的实施方案中，所述拮抗剂包括靶向MCAM的siRNA、反义RNA、抗体，或 其组合。
[0052] 在本发明的第十方面，提供了体外检测肝组织中MCAMmRNA的表达