一种d1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水稻鉴定领域，具体而言，涉及一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交 组合的鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 70年代我国应用三系法培育杂交水稻获得成功，并在生产上大面积推广种植，实 现了我国水稻单产的第二次飞跃。1976-2005年，我国杂交水稻累计种植面积52. 5亿亩，增 收稻谷约6. 5亿吨，因此杂交水稻的发展是提高粮食产量、解决粮食安全问题的重要途径 (袁隆平，2008)。三系杂交水稻利用的基础是细胞质雄性不育，自从野败型细胞质雄性不育 系被发现与大面积推广应用以来，上世纪70年代到80年代中期，育种家培育出多达60多 种细胞质源来源于野败型、云南滇型OianI和Dianll)、红莲型、冈型、K型和马协型等，尽 管细胞质源和败育特点有较大差异，可分为孢子体不育和配子体不育两种类型（朱英国， 2000)。其中，云南滇型、包台型和红莲型为配子体不育系，野败型、D型、K型和冈型等为孢 子体败育类型，大部分的配子体败育恢保关系一致，而大部分孢子体败育类型的恢保关系 一致，配子体败育和孢子体败育类型的恢保关系相反。
[0003] 在配子体细胞质雄性不育系中，已经克隆验证了包台型细胞质雄性不育基因 〇"79和红莲型细胞质雄性不育基因(^纽79，两个不育基因为等位变异，有97%的序列同 源性（Wangetal.2006;Pengetal.2010)，滇型不育系也鉴定到orf79等位变异基因。对 于孢子体型细胞质雄性不育系，罗荡平等用全线粒体基因组表达分析的方法鉴定出野败型 不育基因WA352,该基因由3个线粒体基因组片段和一个来源不明片段组成，其他孢子体细 胞质不育类型，如印水型、矮败型、冈型、爪哇型、马协型、K型均含有不育基因WA352(Luoet al. 2013) 〇
[0004]目前，国际公认细胞质雄性不育类型主要为野败、红莲、包台三种类型，其中前面 两种不育细胞质都来源于普通野生稻。20世纪70年代，国内外育种家还利用普通野生稻为 细胞质供体培育了其他13种细胞质类型，如崖城野生稻细胞质、田东野生稻细胞质等（朱 英国，2000)，因此，从野生稻中挖掘细胞质是培育新型细胞质雄性不育系的一个重要途径。 东乡野生稻为多年生野生稻，是迄今为止发现的世界上分布最北的野生稻，被国内外誉为 "野生植物大熊猫"（黄依南等，2012)。
[0005] 上世纪80年代，江西省农科院水稻所利用东乡野生稻作为细胞质供体培育出雄 性不育系国际油粘A，但一直没有找到对该新型不育系育性恢复良好的恢复源，因此，没有 得到推广和利用。近年来，江西省超级水稻研宄发展中心与宜春农科所合作，以东乡野生稻 为细胞质供体培育了新型东野不育系D1A，新型东野不育系D1A的具体培育方法见申请号 为201410190251. 0所述；新型东野不育系D1A分别与培矮64和天丰B杂交得到新型东野 不育系DPA和DTA。D1A、DPA和DTA均为孢子体不育系，分子标记鉴定该类型不育系不含有 已克隆的孢子体不育基因WA352。无花粉败育，败育彻底，育性极易稳定，且保持谱广，绝大 多数栽培品种可为其保持系，只在同质野生稻中找到恢复系，并实现同质野生稻恢复系恢 复基因的栽培稻转育，最高恢复率达到85. 1%。因此，它的败育特点、分子机理和恢保关系 与目前推广的其他不育系完全不同，为一种新型孢子体不育类型，暂命名为D1型水稻细胞 质不育系。该不育系的研宄及应用推广对于丰富杂交水稻类型，促进杂交水稻的可持续发 展具有重要价值。
[0006] 植物线粒体基因组由于线粒体基因组高频率的基因重组导致植物线粒体基因组 序列差异很大，存在各自特异的序列，比较分析任何两个物种的线粒体基因组的基因间区， 发现大部分基因间区都不是保守的，甚至是同源物种的比较（KuboandMikami, 2007)。 如，将小麦Ks3和Km3的线粒体基因组进行比较，只有85. 2 %的序列为保守序列，与 NCBI数据库比较，7. 3 %Ks3序列为新序列，且大部分特异序列位于进化速率快的基因间 区（Liuetal.，2011);目前，水稻已完成了 7个线粒体基因组的测序，分别是水稻品种 Nipponbare、N、9311、CW-CMS、LD-CMS、WA-CMS、RT98C。其中，Nipponbare是一个典型的粳 稻品种，9311为典型的籼稻品种，WA-CMS和CW-CMS细胞质来源于中国普通野生稻（Oryza rufipogon)，LD-CMS细胞质来源于籼稻品种缅甸的Lead水稻。水稻线粒体基因组最大 的为CW(559, 045bp)，而LD只有 434, 745bp，通过比较水稻CW-CMS、LD-CMS、WA-CMS、N和 Nipponbare线粒体基因组获得57个大小在102-5745bp的线粒体基因组特异序列，这些特 异序列占到水稻线粒体基因组14. 5%，通过比较分析获得了 3个在所分析的14个不育系中 均能扩出条带的分子标记，3个在所分析的7个配子体不育系均能扩出条带的分子标记，9 个在所分析的7个孢子体不育系均能扩出条带的分子标记，没有鉴定到单个不育系所特异 的分子标记（xieetal.，2014)。
[0007] D1型水稻细胞质不育系为一种以东乡野生稻为细胞质来源的孢子体不育系，与推 广应用的其他孢子体不育系类型完全不一样，目前，还没有开发出相应的特异分子标记能 够快速鉴定该不育类型。
[0008] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0009] 本发明的第一目的在于提供一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方 法，能快速、准确、高效、灵敏地检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合；并且该鉴定 方法操作简便、稳定可靠。
[0010] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0011] 一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法，以碱基序列SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3所示中的任一种或多种设计引物进行基因扩增鉴定。
[0012] 本发明提供的D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法，是以水稻线粒 体基因组遗传变异为基础，先将D1型水稻细胞质不育系的线粒体提取并测序，然后与其他 水稻品种进行基因组学分析，筛选出3个特异性强的东野型不育系D1A线粒体特异序列，即 为序列表中的SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3所示的序列；以该序列设计引物， 然后通过分子检测手段，来鉴定是否为D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合特异的标记。 该鉴定方法能快速、准确、高效、灵敏地检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合；并且 该鉴定方法操作简便、稳定可靠。
[0013] 进一步地，所述引物为引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种或多种；
[0014] 其中，所述引物DM-1为：
【主权项】
1. 一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法，其特征在于，W碱基序列 SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO ;3所示中的任一种或多种设计引物进行基因扩增 鉴定。
2. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物为引物DM-1、引物DM-2、引 物DM-3中的任一种或多种； 其中，所述引物DM-1为： F ;5' -GGAGTTGCTGTAGGGTCG-3' R;5' -CAAGTTGGCTTTGCTGAT-3'; 所述引物DM-2为： F ;5' -CTCGCTTTAGTAGTGGTG-3' R;5' -CTTCGCTAGTGTAGGTGC-3'; 所述引物DM-3为： F ;5' -ACTTCTACGGCCTTACGA-3' R ;5' -GTGGACCTGGGATGACTA-3'。
3. 根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物为引物DM-1、引物DM-2、引 物DM-3中的任一种。
4. 根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物为引物DM-1、引物DM-2、引 物DM-3中的任两种。
5. 根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物为引物DM-1、引物DM-2和 引物DM-3。
6. 根据权利要求2-5任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述基因扩增的模板为所 述D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的总基因组。
7. 根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，所述总基因组采用CTAB法提取。
8. 根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，所述总基因组的提取材料为D1型水 稻细胞质不育系及其杂交组合生长至两叶一屯、的幼苗。
9. 根据权利要求8所述的鉴定方法，其特征在于，基因扩增时所用的体系中，所述总基 因组的终浓度为8-15ng/ y 1。
10. 权利要求2所述的引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一种或多种在D1型水稻 细胞质不育系及其杂交组合种子纯度鉴定的应用。
【专利摘要】本发明涉及水稻鉴定领域，特别涉及一种D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合的鉴定方法，以碱基序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示中的任一种或多种设计引物进行基因扩增鉴定。该鉴定方法是以水稻线粒体基因组遗传变异为基础，先将D1型水稻细胞质不育系的线粒体提取并测序，然后与其他水稻品种进行基因组学分析，筛选出3个特异性强的东野型不育系D1A线粒体特异序列；以该序列设计引物，然后通过分子检测手段，来鉴定是否为D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合特异的标记。该鉴定方法能快速、准确、高效、灵敏地检测出D1型水稻细胞质不育系及其杂交组合；并且该鉴定方法操作简便、稳定可靠。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104531886
【申请号】CN201510018679
【发明人】谢红卫, 蔡耀辉, 蔡怡聪, 李永辉, 钱明娟, 毛凌华, 颜龙安
【申请人】江西省超级水稻研究发展中心
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月14日