用于稳定乙酰-辅酶a衍生化合物生成的方法
【技术领域】
[0001] 本公开文本涉及氧响应性启动子作为遗传开关用于调控经遗传修饰的宿主细胞 的异源非异化化合物生成的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 合成生物学的出现带来了发酵微生物以工业规模和质量自可更新来源生产生 物燃料，化学制品和生物材料的指望。例如，在微生物宿主中成功构建了功能性非天然 生物学途径，用于生产抗疱药青蒿素的前体（参见例如Martin et al.，Nat Biotechnol 21:796-802(2003));脂肪酸衍生燃料和化学制品（例如脂肪酯，脂肪醇和和蜡；参见例如 Steen et al.，Nature 463:559-562(2010));构成降胆固醇药的聚酮合酶（参见例如Ma et al.，Science 326:589-592(2009));和聚酮（参见例如 Kodumal，Proc Natl Acad Sci USA 101:15573-15578(2004))。然而，合成生物学的商业成功会大大依赖于可更新产品的生产 成本是否能够变成比得上或比得过它们相应非可更新对应物的生产成本。
[0004] 菌株稳定性会是工业发酵成本的一项主要驱动项，因为它影响连续发酵能够生产 性运行的时间长度。菌株稳定性一般指微生物在延长的培养时间里维持非异化发酵产物的 有利生产特征（即高产率（克化合物每克底物）和生产率（克每升发酵培养基每小时）） 的能力。特别地，遗传稳定性（即生产微生物群中与产品生成有关的基因的指定等位基因 频率随时间变化小至无变化的倾向）在持久的产品输出中发挥主要作用。
[0005] 对于除生物质以外的产品（根据定义，该产品消耗代谢能和碳，它们原本可用于 生成更多的细胞）的非异化发酵，不稳定性的机制是双倍的：进化突变和选择。首先，自发 和随机发生生产丧失突变。其次，产品产率降低的细胞的生长速率或"适合性"优势导致低 生产者席卷最终的群，并由此降低总体培养物性能。这种现象可称作"菌株退化"。
[0006] 巴西燃料乙醇发酵对较长时间段实现自糖获得乙醇的极高产率，即最大理论产率 的约90%。这部分是因为乙醇生产是异化性的：它生成2个ATP每分子生成的糖，而且不 涉及氧就是氧化还原反应平衡的。突变成不生成乙醇的细胞不太适合在发酵罐的低氧条件 下且不会席卷该群。这允许工业乙醇发酵贯穿季节循环大部分酵母生物质，由此使糖转变 成酵母细胞生物质最小化并将几乎所有糖引导至乙醇生产。这扩展繁殖和生物质的再使用 提高乙醇生产的效率：运转支出减少，因为每个循环期间更少的糖变成生物质（即产率提 高）；而且资金支出减少，因为建造接种所用生物质需要更少和更小的发酵罐。
[0007] 比较而言，许多乙酰-CoA衍生烃（例如类异戊二烯，脂肪酸，和聚酮）的生成在性 质上一般是非异化性的；它们通常要求ATP，NADPH，和碳的净输入，常常供应大量的氧来帮 助平衡系统的氧化还原作用。此类环境使得朝向更低产品，更高生物质生成基因型的进化 更加有利，并导致更高速率的菌株退化。
[0008] 降低生成非异化产品的负选择压力的一种方式是在不想要该产品的时段期间关 闭产品形成，诸如在必须生成生物质以使发酵罐生产率最大化的发酵阶段期间。如此，本领 域需要能够在发酵期间控制乙酰-CoA衍生化合物生成时机的开关。
[0009] 发明概述
[0010] 本文中提供的是用于自经遗传修饰的宿主细胞生成异源非异化化合物的发酵工 艺。在一些实施方案中，该工艺包含两个阶段：建造阶段，期间非异化化合物生成实质性降 低（"关"阶段），同时细胞生物质积累；和生产阶段，期间非异化化合物生成开启。如此，与 非异化化合物生成有关的负选择压力在不需要生成的发酵阶段期间减轻。建造阶段期间非 异化化合物生成的减少或消除导致（i)建造阶段期间细胞的生长速率升高；和（ii)生产阶 段期间菌株的生产稳定性升高。这导致非异化化合物生成持续更久，由此提高菌株的总体 产率和/或生产率。有利的事，本文中提供的发酵方法中非异化化合物生成的"关"和"开" 状态经由容易获得的，承担得起的，和工业相关的条件来控制。
[0011] 一方面，发酵培养中非异化化合物生成的"关"和"开"状态通过发酵期间的氧水 平，例如培养基中溶解氧的量，结合使用驱动实现异源非异化化合物生成的途径酶的基因 表达的氧敏感性启动子来控制。这些方法利用当培养工程化改造成生成异源非异化化合物 的细胞时能够以有限量提供氧的观察结果。这些细胞能够在微好氧条件下维持生长和存活 力，由此节省与运行完全好氧发酵工艺有关的成本。在一些实施方案中，一旦宿主细胞群达 到足以像供应氧那样快地消耗氧的密度，就能够实现微好氧条件。有利的是，通过将途径基 因表达与氧敏感性启动子偶联，化合物生成仅在宿主细胞群的氧消耗高得足以在发酵罐中 实现微好氧条件时（这在建造阶段结束时，就是说，在为高效化合物生成实现了最佳细胞 密度时有效发生）开启。如此，途径基因表达与实现对生产阶段开始理想的群密度紧密偶 联。因而，本文中提供的方法利用氧水平和遗传开关来实现用于异源非异化化合物生成的 改良发酵工艺的"关"和"开"阶段。
[0012] 如此，本文中提供的是一种用于在经遗传修饰的宿主细胞中生成异源非异化化合 物的方法，该方法包括：
[0013] (a)在好氧条件下在包含碳源的培养基中培养一群经遗传修饰的宿主细胞，其中 该宿主细胞包含编码用于生成该异源非异化化合物的酶促途径的一种或多种酶的一种或 多种异源核酸，其中该一种或多种酶的表达受微好氧响应性启动子的活性正调节，其中该 好氧条件限制由该宿主细胞生成的异源非异化化合物的量；并
[0014] (b)在微好氧条件下在包含碳源的培养基中培养所述群或其亚群，其中所述微好 氧条件提高所述群或其亚群的非异化化合物生成。
[0015] 在一些实施方案中，该微好氧响应性启动子为突变型DAN1启动子。在一些实施方 案中，该突变型DAN1启动子包含选自下组的序列：SEQ ID勵：1，2,3,4,5,6,7,8,9和10。 在一些实施方案中，该突变型DAN1启动子序列包含SEQ ID NO :1。在一些实施方案中，该 突变型DAN1启动子序列包含SEQ ID NO :2。
[0016] 在一些实施方案中，该微好氧响应性启动子与该编码酶促途径的一种或多种酶的 一种或多种异源核酸可操作连接，且所述微好氧条件提高该酶促途径的一种或多种酶的表 达。在一些实施方案中，该微好氧响应性启动子与编码转录调节物的异源核酸可操作连接， 该转录调节物正调节该编码酶促途径的一种或多种酶的一种或多种异源核酸的表达，且所 述微好氧条件提高该转录调节物的的表达。在一些实施方案中，该转录调节物为Gal4p，且 该编码酶促途径的一种或多种酶的一种或多种异源核酸各自与选自下组的Gal4p响应性 启动子可操作连接：pGALl，pGAL7和pGALlO。在一些实施方案中，该宿主细胞进一步包含 Gal80p的功能性破坏。
[0017] 在一些实施方案中，该微好氧条件包含该培养基中的溶解氧浓度小于约20 %，小 于约15%，小于约10%，或小于约5%。在一些实施方案中，该微好氧条件包含该培养基中 的溶解氧浓度为约〇 %。在一些实施方案中，该微好氧条件导致该宿主细胞的氧摄取率小于 约50毫摩尔，小于约40毫摩尔，小于约30毫摩尔，小于约20毫摩尔每升培养基，或小于约 10毫摩尔每升培养基。在一些实施方案中，该微好氧条件导致该宿主细胞的比氧摄取率小 于约30毫摩尔，小于约25毫摩尔，小于约20毫摩尔，小于约15毫摩尔，小于约10毫摩尔， 或小于约5毫摩尔每克细胞干重每小时。
[0018] 在一些实施方案中，由该群经遗传修饰的宿主细胞在步骤（b)的培养期间里生成 的异源非异化化合物与在该酶促途径的一种或多种酶的表达不受该微好氧响应性启动子 的活性限制的好氧发酵工艺中实现的异源非异化化合物相比改善。
[0019] 本文中还提供的是一种用于在经遗传修饰的宿主细胞中生成异源类异戊二烯的 方法，该方法包括：
[0020] (a)在好氧条件下在包含碳源的培养基中培养一群经遗传修饰的宿主细胞，其中 该宿主细胞包含：
[0021] (i)编码甲羟戊酸（MEV)途径的一种或多种酶的一种或多种异源核酸，其各自与 选自下组的Gal4p响应性启动子可操作连接：pGALl，pGAL7和pGALlO ;和
[0022] (ii)编码Gal4p的核酸，其与微好氧响应性启动子可操作连接；
[0023] 其中该好氧条件限制由该宿主细胞生成的异源类异戊二烯的量；并
[0024] (b)在微好氧条件下在包含碳源的培养基中培养所述群或其亚群，其中所述微好 氧条件提高所述群或其亚群的异源类异戊二烯生成。
[0025] 另一方面，发酵培养中的非异化化合物生成的"关"和"开"状态通过培养基中糖麦 芽糖的量，结合使用调节实现异源非异化化合物生成的途径酶的基因表达的麦芽糖响应性 启动子来控制。有利的是，通过将途径基因表达与麦芽糖敏感性启动子偶联，能够通过控制 给料中麦芽糖的量来开启或关闭化合物生成。例如，麦芽糖响应性启动子能够布线成"开" 闸，用于在麦芽糖存在下诱导异源非异化化合物生成。或者，麦芽糖响应性启动子能够布线 成"关"闸，用于在麦芽糖存在下诱导用于化合物生成的酶促途径的负调节物表达。因而， 本文中提供的方法利用培养基中的麦芽糖水平和遗传开关来实现用于异源非异化化合物 生成的改良发酵工艺的"关"和"开"阶段。
[0026] 如此，本文中提供的是一种用于在经遗传修饰的宿主细胞中生成异源非异化化合 物的方法，该方法包括：
[0027] (a)在包含碳源（包含麦芽糖）的培养基中培养一群经遗传修饰的宿主细胞，其中 该宿主细胞包含编码用于生成该异源非异化化合物的酶促途径的一种或多种酶的一种或 多种异源核酸，其中该一种或多种酶的表达受麦芽糖响应性启动子的活性负调节，其中该 培养基中存在麦芽糖限制由该宿主细胞生成的异源非异化化合物的量；并
[0028] (b)在包含碳源的培养基中培养所述群或其亚群，其中麦芽糖缺失或处于足够低 的量使得该麦芽糖响应性启动子不再有活性，且该宿主细胞的异源非异化化合物生成升 尚。
[0029] 在一些实施方案中，该麦芽糖响应性启动子与编码转录调节物的异源核酸可操作 连接，该转录调节物负调节该编码酶促途径的一种或多种酶的一种或多种异源核酸的表 达，且步骤（a)中的麦芽糖提高该转录调节物的表达。在一些实施方案中，该转录调节物 为GalSOp，该宿主细胞进一步包含Gal4p，且该编码酶促途径的一种或多种酶的一种或多 种异源核酸各自与选自下组的Gal4p响应性启动子可操作连接：pGALl，pGAL7和pGALlO。 在一些实施方案中，该麦芽糖响应