胶原肽组合物的制造方法、dpp-4阻碍剂和血糖值升高抑制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及胶原肽组合物的制造方法、含有所述胶原肽组合物的二肽基肽酶4阻 碍剂（以下简称为DPP-4阻碍剂）和血糖值升高抑制剂。
【背景技术】
[0002] 近年来，从胶原、明胶的水解物中发现大量的活性肽。作为活性肽的用途，有以 Hyp-Gly为关节炎、褥疮抑制剂（专利文献1)、以Ala-Hyp、Leu-Hyp、Ala-Hyp-Gly为明胶合 成促进剂（专利文献2)、以Gly-X-Y-(Gly-Z-W)表示的肽为血糖值升高抑制剂（专利文献 3)、以Gly-Pro-Ala-Gly为DPP-4阻碍剂（专利文献4)、以Pro-Hyp的成纤维细胞增殖促进 作用为化妆品（专利文献5)等大量的报告。另外，关于口服摄取了胶原、明胶时的消化、吸 收、代谢，报告了 Pro-Hyp、Ala-Hyp、Leu-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Pro_Hyp-Gly 等二肽、三肽在血 中存在（非专利文献1)、Hyp_Gly在血中存在（非专利文献2)。由于这些肽具有生理活性 (专利文献1、专利文献2、专利文献5)，因此，二肽、三肽在血中转移被认为是胶原在口服摄 取中的机制之一。水解胶原、明胶的蛋白质分解酶数量众多，为了通过其中的任何一个、或 它们的组合来有效地生成生理活性肽而进行研宄，蛋白质分解酶的选择成为重要的因素之 〇
[0003] 胶原具有甘氨酸每三个残基便重复、以所谓被称作胶原样序列的_(Gly_氨基酸 X-氨基酸Y)n_表示的特征性氨基酸序列，作为每到该单元便分解的蛋白质分解酶，具有细 菌胶原酶。使用细菌胶原酶进行分解的方法是得到Gly-X-Y型肽的优异方法。作为关于由 细菌胶原酶生成的肽的生理活性的报告，有使用所述以Gly-X-Y-(Gly-Z-W)表示的肽的血 糖值升高抑制剂（专利文献3)、使用Gly-Ala-Arg等三肽的胶原生成促进剂（专利文献6) 等。
[0004] 另一方面，也有使多个蛋白质分解酶组合地以多个阶段进行反应来获得所需要的 肽的方法。例如有为了制造含有L-脯氨酰基-L-羟基脯氨酸的组合物，首先用具有胶原酶 活性的蛋白酶进行处理，接着使肽链端解酶作用的方法（专利文献7)。另外，也有为了得到 Glu-Hyp-Gly、Leu-Hyp-Gly、Ser-Hyp_Gly，在1次酶处理中使来自胶原酶、黄曲霉的蛋白酶 作用，接着作为2次酶处理，在从N末端起第2个存在除脯氨酸或羟基脯氨酸以外的氨基酸 的情况下使氨基酸从N末端起游离的肽酶作用，从而生成1次酶处理物不含有的肽的方法 (专利文献8)。
[0005] 另一方面，下述公知的：生姜中含有生姜蛋白酶（Zingibain)(非专利文献3);胶 原也可被除细菌胶原酶等以外的生姜蛋白酶分解（非专利文献4);以及从将生姜根茎在极 性溶剂中粉碎、干燥该过滤残渣而成的粉末中提取的酶的蛋白酶活性比直接从生姜根茎中 提取的酶的蛋白酶活性高。
[0006] 并且已知：生姜蛋白酶是脯氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，在从N末端侧读取时，切 断与Pro的C末端侧相邻的氨基酸残基与下一个氨基酸残基之间的肽键（专利文献9)。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1 :日本特开2010-106003号公报
[0010] 专利文献2 :日本特开2010-24200号公报
[0011] 专利文献3 :国际公开第2008/66070号
[0012] 专利文献4 :国际公开第2013/65832号
[0013] 专利文献5 :日本特开2007-1981号公报
[0014] 专利文献6 :日本特开2003-137807号公报
[0015] 专利文献7 :日本特开2012-135222号公报
[0016] 专利文献8 :国际公开第2012/102308号
[0017] 专利文献9 :日本特表2007-522822号公报
[0018] 非专利文献
[0019] 非专利文献 1 :J.Agric.FoodChem. 2005Aug10 ;53 (16) : 6531-6536.
[0020] 非专利文献 2:FoodChemistry1291019-10242011.
[0021] 非专利文献3 :生姜蛋白分解酶的分离纯化、营养与粮食，1973年，26卷6 号，P377-383.
[0022] 非专利文献4:Plantcollagenase:uniquecollagenolyticactivityof cysteineproteasesfromginger,BiochimBiophysActa，2007 年，1770 卷 12 号，P1627-1635.
[0023] 非专利文献5:Preparationofproteolyticactivityrichgingerpowderand evaluationofitstenderizingeffectonspent-henmuscles,JournalofMuscle Foods，2006 年，17 卷 2 号，pl74-184.
【发明内容】
[0024] 发明要解决的问题
[0025] 在以X表示氨基酸残基的情况下，以X-Hyp-Gly表示的三肽中存在具有特有的生 理活性的肽。所述专利文献2中，记载有Ala-Hyp-Gly具有胶原合成促进作用并可在生物 体胶原合成促进用化妆品、皮肤治疗药等中使用。另外，所述专利文献8中称Glu-Hyp-Gly、 Leu-Hyp-Gly等具有DPP-4阻碍活性。然而，以X-Hyp-Gly表示的肽不能仅通过细菌胶原酶 分解胶原蛋白、明胶而生成。这是因为：细菌胶原酶在Gly的N末端侧切断因而切断上述式 的Hyp与Gly之间的肽键。所以，所述专利文献2中通过人工合成生成Ala-Hyp-Gly，所述 专利文献8中使用多个酶以2阶段反应生成。然而，在工业生产中，人工合成、将多个酶组 合成为工序数变多、成本高的一个原因。因此，期望开发出可高效地分解胶原、明胶并生成 以X-Hyp-Gly表示的三肽的胶原肽组合物的制造方法。
[0026]通常，口服摄取的蛋白质、肽被消化道酶分解成氨基酸、二肽、三肽，从小肠上皮通 过氨基酸转运子、肽转运子摄入到血液中。如前所述，二肽、三肽在血中较稳定地存在且存 在具有生理活性的二肽、三肽。通过生姜蛋白酶，可生成含有脯氨酸残基的肽，但其种类多， 关于其生理活性的研宄正在进行。如果发现新的药效，就能够有效地利用由简单的方法获 得的肽。
[0027] 鉴于上述现状，本发明的目的在于，提供以胶原和/或明胶作为原料、可高效地制 造以X-Hyp-Gly表示的三肽的胶原肽组合物的制造方法。
[0028] 另外，本发明的目的还在于，提供基于上述胶原肽组合物的生理活性的DPP-4阻 碍剂和血糖值升高抑制剂。
[0029] 用于解决课题的方法
[0030] 本发明者们发现如果在胶原和/或明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶，则从C 末端起第2个的氨基酸残基能够产生Hyp的胶原肽；在获得的胶原肽组合物中含有以 X-Hyp-Gly表示的肽，并且也同时生成以X-Pro-Gly表示的肽等；获得的胶原肽组合物的 DPP-4阻碍活性高；如果将其对动物口服给药，则具有降血糖的效果，从而完成了本发明。
[0031] 即，本发明提供胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，在胶原和/或明胶溶液中 添加来自生姜根茎的酶进行分解，生成含有以X-Hyp-Gly (式中，X表示除Gly、Hyp和Pro 以外的氨基酸残基）表示的肽的肽组合物。
[0032] 另外，本发明提供上述胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，将生姜根茎的干燥 粉碎物用作所述来自生姜根茎的酶。
[0033] 另外，本发明提供上述胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，将含有谷胱甘肽 的酵母与所述来自生姜根茎的酶一同以〇. 005?0. 5w/v%的范围添加，和/或调节到 pH4. 0?6. 0的范围使其反应。
[0034] 另外，本发明提供上述胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，所述肽组合物所含 的以所述式表示的肽的含量是所述胶原和/或明胶的〇. 01摩尔％以上。
[0035] 另外，本发明提供胶原肽组合物的制造方法，其特征在于，进一步含有以 X-Pr〇-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基）表示的肽。
[0036] 另外，本发明提供含有由上述制造方法得到的胶原肽组合物的DPP-4阻碍剂。
[0037] 另外，本发明提供含有由上述制造方法得到的胶原肽组合物的血糖值升高抑制 剂。
[0038] 发明的效果
[0039] 根据本发明，能够通过在胶原、明胶溶液中添加来自生姜根茎的酶来以1阶段的 酶反应制造含有以X-Hyp-Gly(式中，X表示除Gly、Hyp和Pro以外的氨基酸残基）表示的 肽的胶原肽组合物。
[0040] 根据本发明，能够将由所述制造方法获得的胶原肽组合物用于DPP-4阻碍剂和血 糖值升高抑制